專利名稱：N-未保護(hù)的(3)-氨基-3-芳基丙酸酯的(r)酯的特異性水解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酯水解酶存在的情況下通過生物分解產(chǎn)生富含(S)對 映體的氨基酸酯的方法。
背景技術(shù)：
p-氨基酸和酯，例如3-氨基-3-芳基丙酸酯，作為合成中間體具有 廣泛的應(yīng)用，特別是用于生產(chǎn)藥學(xué)試劑。這樣的分子是手性的，且優(yōu) 選地可以單一對映體的形式或者至少是以對映體富集化形式被獲得。這樣的分子的對映體富集化形式及對應(yīng)的羧酸可通過化學(xué)方法來 獲得。例如，美國專利號6,673,926 B2描述了一種制備3S-氨基-3-芳基 丙酸(例如，芳基=3-吡啶基)及其衍生物的方法，所述方法使用經(jīng)典 的分解(resolution)方法，所述方法需要多個步驟包括對3-氨基基團(tuán) 的保護(hù)。人們已經(jīng)描述了用于制備對映體富集化的P-氨基酸及酯的更具經(jīng) 濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)優(yōu)勢的替代生物催化方法。例如，在美國專利公開 2004/0029236 Al ， 以及Faulconbridge等人在Preparation of enantiomerically enriched aromatic P -amino acids via enzymatic resolution, Tetrahedron Letters 41 (2000) 2679-2681中描述了使用脂肪酶 PS酶來產(chǎn)生")-酸。其它的參考文獻(xiàn)描述了用于制備對映體純(enantiopure)的P-氨基 酸和/或P-氨基酯的方法，包括例如WO 01/16090A1,其包括對分子 的描述，但不包括對合成對映體富集化化合物的方法的描述。以下參 考文獻(xiàn)描述了使用南極假絲酵母(Ozwfefo ""toW"/c")脂肪酶來催化 外消旋底物的氨基基團(tuán)和二異丙醚中2，2，2-三氟乙酯之間的對應(yīng)體選 擇性酉先胺的形成M. Lui等人i ec抓yUv朋ces f/ze他m9se/ec"ve ^"Ae^ ac/d , Tetrahedron 58 (2002) 7991-8035; S. Gedey等人，Pre戸ra"'ow q/" /n'g/z(y e"朋"opwre ;fi-麵fwo esters Z>_y C朋t/油a打tor"/ca /z》ase A， Tetrahdron: Asymmetry 10(1999) 2573-2581 。因lt匕，在這些參考文獻(xiàn)描述的方法中，只有通過使用激活的酯來使氨基基團(tuán) 優(yōu)選地在(W)-中心發(fā)生酰化才引起(幻-未反應(yīng)底物的富集和(i ) -富集酰胺的形成。類似地，V. Sanchez等人在C朋&cfa朋toWc"ca /zjwse cato(yzed mso/她》w q/" e/Zz少/ fl附/woZw(yrate, Tetrahedron:Asymmetry, Vol. 8, No. 1， pp. 37-40, 1997中描述了一種與Gedey參考文 獻(xiàn)類似的途徑，但是產(chǎn)生對映體純的3-氨基丁酸。歐洲專利申請EP 1 057 894 A2, A3描述了黃曲霉菌U5pergz7/似 y "v^)酯酶ATCC 11492來制備7V-節(jié)基-L-氮雜丁烷羧酸酯以產(chǎn)生") -酸的用途，但是這樣的酶尚未被描述用于制備(3-氨基酸或(3-氨基酯。以上的現(xiàn)有技術(shù)所描述的生物催化途徑(其涉及P-氨基酸酯的生 物催化的水解)均產(chǎn)生(S)-酸作為水解產(chǎn)物。如果需要對應(yīng)的(幻-酯作為所需產(chǎn)物的話，則需要")-酸的重新酯化，這通常是通過化學(xué) 方法。所以，這些生物催化的途徑需要多個步驟，因此相對較長且較曰蟲 卬貝o發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了改進(jìn)的酶法制備氨基酸的方法。在一個方面，本發(fā)明為制備富含至少80Wee的(S)-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法，包括以下步驟在酯水解酶存在的情況下， 對應(yīng)體選擇性水解(enantioselectively hydrolyzing) 3誦氨基-3-芳基丙酸 酯的對映體混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(幻-(1)禾口 (1)代表,) — (糾)其中，八1 是0:4.3()未取代或取代的芳香族基團(tuán)，R是Cw。線性或支鏈烷基基團(tuán)；并回收未被水解的光學(xué)活性酯")-(1)。7在第二個方面，本發(fā)明為從曲霉"w^^7/m)中獲得的一種酯水 解酶在制備富含至少80% ee的(50 -對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯中 的用途。在第三個方面，本發(fā)明為制備富含至少80%對映體過量 (enantiomeric excess, ee)的(W) -X寸映休的3-氨基-3-芳基丙酸的方法， 包含以下步驟在酯水解酶存在的情況下，對應(yīng)體選擇性水解3-氨基 -3-芳基丙酸酯的對映體混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式")-(1)和i - (1)代表其中，Ar是C4-3。未取代或取代的芳香族基團(tuán)，R是d.u)線性或支 鏈垸基基團(tuán)；并回收水解產(chǎn)物光學(xué)活性酸(i ) - (2)。在第四個方面，本發(fā)明為從曲霉中獲得的一種酯水解酶在制備富含至少80。/。ee的CR)-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯中的用途。本發(fā)明涉及分解酯以留下未反應(yīng)的(50 -酯或者直接產(chǎn)生(i )-酸，因此與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的方法相比，減少了步驟。
具體實(shí)施方式
根據(jù)本發(fā)明而制備的化合物為富含(幻-對映體的氨基酸酯，所述 氨基酸酯由式(S) - (1)代表氨基酸從3-氨基-3-芳基丙酸酯的對映體混合物中制備，所述的3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(50 - (1)和i - (1)代表其中，八1"是(34.3。芳香族基團(tuán)，R是d.H)烷基基團(tuán)。合適的Ar基團(tuán)包括，芳基、異芳基、取代的芳基或取代的異芳基。 除非另有指明，如這里所用的"芳基"是指芳香族基團(tuán)，例如苯基、 萘基等。芳基基團(tuán)可以是未取代的或者是被一個或多個取代基所取代 的。芳基基團(tuán)上合適的取代基包括但不限于獨(dú)立地選自以下的基團(tuán) 鹵素、垸基、烷氧基、垸芳基、氨基、酰胺、硝基、硫基基團(tuán)、羧基、 羥基。除非另有指明，如這里所用的"異芳基"代表任何五元或六元 單環(huán)結(jié)構(gòu)，其含有至少一個雜原子，所述雜原子選自O(shè)、 N或S，或者 是二環(huán)系統(tǒng)，其中雜芳基環(huán)與另一個芳基環(huán)融合。合適的雜芳基基團(tuán) 的例子包括但不限于吡咯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、噠 嗪基、呋喃基、吡喃基、咪唑基、苯硫基、噁唑基、異噻唑基、異噁 唑基、呋咕基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、嘲哚基、異B引哚基、氮茚 基、吲唑基、嘌呤基、異喹啉基、喹啉基、異噻唑基等。優(yōu)選地，Ar 為苯基或取代的苯基，最優(yōu)選為苯基。合適的R基團(tuán)包括Cwo線性或支鏈烷基基團(tuán)。不論單獨(dú)使用還是 作為取代基基團(tuán)的一部分，如這里所用的"烷基"應(yīng)該包括含有l(wèi).至(/o-u)10個碳原子的直鏈和支鏈。例如，垸基包括甲基、乙基、正丙基、異 丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。優(yōu)選 地，R是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基或仲丁基，最優(yōu) 選為甲基或乙基。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，(幻-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯是 從(50 -乙基3-氨基-3苯基丙酸酯和(7 )-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯 的混合物中制備的，(幻-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯和CR)-乙基3-氨 基-3苯基丙酸酯由以下化學(xué)式代表")-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯(7 )-乙基3-氨基-3苯基丙酸酉i本發(fā)明所述的3-氨基-3-芳基丙酸酯具有(幻-對映體的對映體過 量或"ee"。"對映體過量"或"ee"是一種對映體相對于另一種來說存 在多少的度量，其由以下式子所代表%對映體過量二 (主要對映體的摩爾數(shù)-另一個對映體的摩爾數(shù)/兩 種對映體的總摩爾數(shù))*100.優(yōu)選地，本發(fā)明所述的3-氨基-3-芳基丙酸酯富含至少80% ee的(S) -對映體，更優(yōu)選為至少90。/。ee，再更優(yōu)選為至少95。/。ee。本發(fā)明所用的酶是一種酯水解酶。優(yōu)選地，酯水解酶從曲霉屬中 獲得，更優(yōu)選為從黃曲霉種中獲得。再更有選地，酯水解酶來自黃曲 霉柱頭變禾中(J^erg/〃1^ y/(2vws vgk co/wmwa/^ )的酉旨7JC解酉每，其中黃曲 霉柱頭變種菌株UKNCC 095253和UKNCC 015958為最優(yōu)選。酶可以 是在水溶液中、全細(xì)胞、冷凍的干細(xì)胞、固定于固體載體、保持在膜 生物反應(yīng)器中，或其組合。制備(幻-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯的示例性反應(yīng)過程如下10所需產(chǎn)物反應(yīng)參數(shù)的選擇為高度自由決定的，使用本領(lǐng)域已知的和常規(guī)的方法可找到合適的條件。作為指引，反應(yīng)的pH值范圍應(yīng)該是4至10， 優(yōu)選為5至9，更優(yōu)選為6至8。如果pH太高，將會具有發(fā)生酯的非 選擇性化學(xué)水解的趨勢。如果pH太低，則酶會降解。優(yōu)選地，反應(yīng)在大約IO攝氏度以上的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選為至少 大約15攝氏度。反應(yīng)溫度優(yōu)選為在100攝氏度以下，優(yōu)選為在大約40 攝氏度以下。本發(fā)明的反應(yīng)可在為此目的提供的任何反應(yīng)載體中進(jìn)行，只要反 應(yīng)載體具有合適的pH和溫度控制。例如，本發(fā)明的反應(yīng)可在普通間歇 式反應(yīng)器、環(huán)流反應(yīng)器或酶膜反應(yīng)器。反應(yīng)通常是在水性條件下例如在水和/或水性緩沖液中進(jìn)行。如 果反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性是考慮因素，則反應(yīng)也可在有機(jī)共溶劑 中進(jìn)行，例如除了水或水性緩沖液之外添加疏水性有機(jī)溶劑或親水性 有機(jī)溶劑。這樣的疏水性有機(jī)溶劑可以是例如醚類，如叔丁基甲醚、 異丙醚或碳?xì)浠衔锶缂妆?、己烷、環(huán)己烷、庚烷和異辛烷；而親水 性有機(jī)溶液可以是例如醇類如叔丁醇、甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇， 醚例如四氫呋喃，亞砜例如二甲基亞砜，酮類例如丙酮，或腈例如乙 腈。這些疏水性有機(jī)溶劑或親水性有機(jī)溶劑中的每一個可用作單一的 共溶劑或者與彼此組合，也可考慮一種疏水性有機(jī)溶劑和一種親水性 有機(jī)溶劑的組合。所需的終產(chǎn)物在發(fā)生水解后被保留且必須被回收。優(yōu)選地，所需 的終產(chǎn)物通過萃取、過濾或其組合來回收。實(shí)施例以下實(shí)施例解釋本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
且只是為了解釋而不 是限制。實(shí)施例1-底物溶液(檸檬酸鈉磷酸鹽緩沖液中的10.0 g/L的3-氨基-3-苯基-丙酸乙酯)的制備底物溶液通過向20 ml檸檬酸/鈉磷酸鹽緩沖液(根據(jù)Mcllvaine， /傷o. C7^附.，1921, 49, 183制備)中加入0.2 g酉旨(根據(jù)r"ra/z^/ra", 2002， 58，7449制備)來制備；用磷酸將pH調(diào)至所需要的值。實(shí)施例2-曲霉細(xì)胞的制備從United Kingdom National Culture Collection (UKNCC)獲得黃曲 霉柱頭變種菌株015958 (最初是來自Collection of Filamentous Fungi and Plant Pathogenic Bacteria (CABI))并以甘油貝亡藏于-70。C 。這個ti 藏(250pl)用于在帶有阻擋的250ml錐形瓶中接種50 ml無菌馬鈴薯 右旋糖肉湯。培養(yǎng)物在25。C和250 rpm下生長72小時。然后這個培養(yǎng) 物用于在工作臺發(fā)酵器中接種2.0L的無菌馬鈴薯右旋糖肉湯，培養(yǎng)物 在25。C， 500 rpm和1.0 L空氣/分鐘下不控制pH值生長72小時。通 過過濾收取細(xì)胞以產(chǎn)生35.7g的濕細(xì)胞，然后冷凍于-2(TC。然后將細(xì) 胞凍干以產(chǎn)生7.25 g的干細(xì)胞。實(shí)施例3:生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物的制備200mg收取的凍干的黃曲霉細(xì)胞與底物貯存液(20ml)在27。C下 溫育(作為空白，在一個反應(yīng)中，以緩沖液代替細(xì)胞)。 實(shí)施例4:生物轉(zhuǎn)化的非手性分析將100 (il的生物轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移至900的HPLC溶劑(20%乙 腈+10mM磷酸鉀，pH3.0)中終止反應(yīng)，進(jìn)行非手性分析。 分析使用C18 (BDS)柱(150 x 4.6 mm，或等價的)和HPLC溶劑(20% 乙腈+10mM磷酸鉀，pH3.0)以2ml/分鐘在210nm處監(jiān)視吸光度來 進(jìn)行非手性HPLC分析。實(shí)施例5-生物轉(zhuǎn)化的手性分析對于手性分析，將100 W的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至900 ^的庚垸 中，混合，以無水硫酸鈉干燥并過濾，通過HPLC分析有機(jī)層。 分析可進(jìn)行手性分析以區(qū)分酯底物的兩種異構(gòu)體。使用Diacel Chiralcel OD-H柱(250x4.6 mm，或等價的)，以90%庚垸/ 10%異丙醇作為流12動相。使用lml/分鐘的流速，在210nm處檢測。結(jié)果對于pH7.0下進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化，17小時的反應(yīng)時間產(chǎn)生了 50%的 轉(zhuǎn)化(空白轉(zhuǎn)化7%)，(幻-酯的分離純度為〉98.5o/oee。
權(quán)利要求
1、一種制備富含至少80％對映體過量(ee)的(S)-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法，包括在酯水解酶存在的情況下，對應(yīng)體選擇性水解3-氨基-3-芳基丙酸酯的對映體混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(S)-(1)和R-(1)代表其中，Ar是C4-30未取代或取代的芳香族基團(tuán)，R是C1-10線性或支鏈烷基基團(tuán)；和回收未水解的光學(xué)活性酯(S)-(1)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中Ar是苯基或取代的苯基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R是甲基、乙基、丙基、異 丙基、丁基、異丁基或仲丁基。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中富集的3-氨基-3-芳基丙酸酉旨 是(S) -3-氨基-3-芳基丙酸乙酯。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所制備的(60酯的 對映體過量是90%以上。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的酯水解酶從 曲霉ApergW/Ms中獲得。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的酯水解酶來自黃曲霉柱頭變禾中爿"erg7'〃us_/7avMS var. co/wm/ian's 。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的酶是在水溶 液中、全細(xì)胞、冷凍的干細(xì)胞、固定于固體載體、保持在膜生物反應(yīng) 器中，或其組合。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中黃曲霉柱頭變種^^erg"/m _/7flvws var. co/ww ar^的酶是分離的和純化的開》式。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水解在pH為 4至10中進(jìn)行。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述水解在pH為6至8 中進(jìn)行。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水解在溫度 為+5。C至+10(TC中進(jìn)行。
13、 根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水解在溫度 為+15。C至+40。C中進(jìn)行。
14、 一種從曲霉J^er^7/M中獲得的酯水解酶在制備富含至少80% ee的(S0 -對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯中的用途。
15、 ~"禾中從黃曲霉柱頭變禾中^sperg/〃wsy/mw v<ar. co/wmwar/s中獲 得的酯水解酶在制備富含至少S0。/。ee的(S)-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯中的用途。
16、 一種制備富含至少80%對映體過量(ee)的-對映體的 3-氨基-3-芳基丙酸的方法，包括在酯水解酶存在的情況下，對應(yīng)體選擇性水解3-氨基-3-芳基丙酸酯的對映體混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(幻-(1)禾Q i -(1)代表<formula>formula see original document page 4</formula>其中，Ar是C4-3o未取代或取代的芳香族基團(tuán)，R是Cw。線性或支 鏈垸基基團(tuán)；和回收水解產(chǎn)物光學(xué)活性酸(A) - (2)。<formula>formula see original document page 4</formula>
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中Ar是苯基或取代的苯基。
18、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中富集的3-氨基-3-芳基丙酸 是(i ) -3-氨基-3-苯基丙酸。
19、 根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的方法，其中所制備的(W) 酸的對映體過量是90%以上。
20、 根據(jù)權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酯水解酶從 曲霉As/ ergz7/^中獲得。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述酯水解酶來自黃曲霉 柱頭變禾中Js/ e《/〃M^^/JavM^ vac co/M附waW"
22、 根據(jù)權(quán)利要求16-21任一項(xiàng)所述的方法，其中酶是在水溶液中、 全細(xì)胞、冷凍的干細(xì)胞、固定于固體載體、保持在膜生物反應(yīng)器中， 或其組合。
23、 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述黃曲霉柱頭變種 J^erg/〃RSy7(Tmy rar co/wwwan^的酶是分離的禾B純化的開鄉(xiāng)式。
24、 根據(jù)權(quán)利要求16-23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水解發(fā)生在 pH為4至10中進(jìn)行。
25、 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述水解在pH為6至8中進(jìn)行。
26、 根據(jù)權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水解在溫度 為+5。C至+100。C中進(jìn)行。
27、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述水解在溫度為+15"C 至+40。C中進(jìn)行。
28、 一種從曲霉j^^^7/w中獲得的酯水解酶在制備富含至少80% ee的(i )-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸中的用途。
29、 ——禾中從黃曲毒柱頭變禾中J5/ ^g7'〃"51 y m^s1 co/wm"ar/s中獲 得的酯水解酶在制備富含至少80% ee的(i )-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸中的用途。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種制備富含至少80％ee的(S)-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法，或制備富含至少80％對映體過量(ee)的(R)-對映體的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法。所述方法包含對應(yīng)體選擇性水解3-氨基-3-芳基丙酸酯的對映體混合物，并回收未水解的光學(xué)活性酯(S)-(I)。也披露了來自曲霉的酯水解酶在此方法中的用途。
文檔編號C12P41/00GK101558159SQ200780037016
公開日2009年10月14日 申請日期2007年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月3日
發(fā)明者A·A·坎特里爾, M·拜克羅夫特, P·A·基恩 申請人:雷迪實(shí)驗(yàn)室(歐洲)有限公司