專利名稱：一種比法盧定的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多肽固相合成領域，尤其涉及比法盧定(Bivalirudin)的固相合成方法。
背景技術：
在肽合成的技術方面取得了突破性進展的是R. Bruce Merrifield，他設計了一種 肽的合成途徑并定名為固相合成途徑。首先將一個氨基被封閉基團保護的氨基酸共價連接 在固相載體上；在去保護劑的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相 載體上了。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過試劑活化，羧基被DCC活化的第二 個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就 生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達 到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護基，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了 合成好的肽。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端(羧基端) 向N端(氨基端)合成。凝血酶抑制劑被認為是很有前途的抗血栓藥通過凝血酶進行的蛋白水解過程 是血液凝結控制的關鍵所在。抗凝血肽比伐盧定(bivalirudin)，即所謂的“二價水蛭 素(hirulog)”。水蛭素是一種獲自吸血水蛭-醫(yī)用水蛭Hirudo medicinalis的有效治 療性凝血酶肽抑制劑，其包含20個氨基酸，屬于強有力的凝血酶直接抑制劑。比伐盧定 (bivalirudin)是一種近年來應用于臨床的直接凝血酶抑制劑，于2000年批準在美國上 市，其有效抗凝成分為水蛭素衍生物片段，通過直接并特異性抑制凝血酶活性而發(fā)揮抗凝 作用，作用可逆而短暫。比法盧定可以作為普通肝索和血小板糖蛋白II b/11 a拮抗劑的 替代藥物應用于非高?；颊叩慕浧す诿}介入治療。US20070093423A公開了一種多肽固相合成比法盧定的方法，其采用固液相合成方 法，將 Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly 和 Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu兩個片段耦合反應形成比法盧定。該方法的成本較高，產生的雜質
多，產品純度有限。US20090062511A公開了一種固相合成比法盧定的方法，其采用固相合成方法，操 作繁瑣，產生的雜質多。因此，本領域迫切需要提供一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低 廉、得到的比法盧定純度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的[Bivalirudin-Gly](即 Bivalirudin 少一 Gly)和[Bivalirudin+Gly](即 Bivalirudin 多一 Gly)雜質。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法。本發(fā)明提供了一種比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，所述的方法包括步驟(1)在縮合劑存在下，將Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽樹脂縮合，得
4到如式III所示的多肽樹脂；(2)將如式III所示的多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(3)在縮合劑存在下，將Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽樹脂縮 合，得到如式IV所示的多肽樹脂；(4)通過固相合成的方法將氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的 順序依次同如式IV所示的多肽樹脂上的多肽縮合，形成如式II所示的多肽樹脂；和(5)在切割劑的存在下，使式II所示多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所 示的比法盧定； 其中，所述的Fmoc-Asn (Trt)-Gly-OH通過下述步驟得到⑴將Z-Asn (Trt) -OH和H-Gly-OBzl. TosOH混合，進行液相多肽縮合，得到 Z-Asn (Trt)-Gly-OBzl ；(ii)將 Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl 進行氫化還原，得到 H-Asn(Trt)-Gly-OH ；禾口(iii)將 H-Asn (Trt) -Gly-OH 和 Fmoc 保護基混合，得到 Fmoc-Asn (Trt) -Gly-OH0所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通過下述步驟得到(a)將H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，進行液相多肽縮合，得到Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl ；(b)將 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl 進行氫化還原，得到 H_GIy-GIy-GIy-GIy-OH ；禾口(c) W H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 禾口 Fmoc 保護基 M 合，得至Ij Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OHo所述的H-Gly-Gly-OBzl通過將Boc-Gly-OH和H-Gly-OBzl進行液相多肽縮合后 脫保護基得到。所述的Z-Gly-Gly-OH通過將Z-Gly-OH和H-Gly-OMe進行液相多肽縮合后還原得 到。在本發(fā)明提供的制備方法中，所述去保護劑以其總體積計，其中含有3-20%哌啶 和0.5-10%二環(huán)脒(DBU)；優(yōu)選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質 0-20% 1-羥基苯并三唑(HOBt)、0-8% 3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4 (3H)-酮(Η00ΒΤ)在另一優(yōu)選例中，所述的去保護劑含有5-15%哌啶和1-7%二環(huán)脒(DBU)；優(yōu)選， 所述去保護劑還含有選自下述的一種或多種物質0. 5-10% 1-羥基苯并三唑(HOBt)、 2-5% 3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4 (3H)-酮 3-羥基-1,2,3-苯并三嗪 _4 (3H)-酮(Η00ΒΤ)。在本發(fā)明提供的制備方法的步驟⑷中，Arg同多肽樹脂進行縮合時將 Fmoc-Arg(Pbf) -OH和五氟苯酚以及縮合劑混合，使Fmoc-Arg(Pbf) -OH和樹脂上的多肽進 行縮合。在本發(fā)明提供的制備方法中，所述縮合在選自下述的一種或多種縮合劑的存在下 進行N，N，- 二異丙基碳二亞胺(DIC)、0_ (7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N' ,N'-四甲 基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N, N, N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲 基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N, N, N-四甲基脲六氟磷 酸(HBTU)/N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷 鱗六氟磷酸(PyBOP)、1_羥基苯并三唑(HOBt)。在本發(fā)明提供的制備方法中，述的縮合用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控。在另一優(yōu)選例中，脯氨酸(Pro)之后的縮合反應使用Chloranil and Kaiser測試 法進行監(jiān)控。在本發(fā)明提供的制備方法的步驟(5)中，在各物質配比為95-60三氟乙酸 (TFA) 5-10三異丙基硅烷(TIS) 5-30水的切割劑存在下進行。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低廉、得到的比 法盧定純度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的[Bivalirudin-Gly](即Bivalirudin少一 Gly)和[Bivalirudin+Gly](即 Bivalirudin 多一 Gly)雜質。


圖1顯示了實施例1獲得的比法盧定1的HPLC檢測圖譜。圖2顯示了實施例2獲得的比法盧定2的HPLC檢測圖譜。
具體實施例方式發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了在多肽固相合成比法盧定的過程 中，將通過多肽液相合成方法得到的Asn(Trt)-Gly和Gly-Gly-Gly-Gly片段進行縮合，可以簡化純化過程，有效去除主峰前后[Bivalirudin-Gly]和[Bivalirudin+Gly]雜峰，并且
提高純化收率。本發(fā)明使用含有DMF、哌啶、DBU、HOBt, HOOBT的去保護劑，針對-Asn-Gly-結構， 使用含有哌啶、DBU、HOOBT和HOBt中的一種或多種物質組成的保護劑尤其有效。另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在多肽固相合成比法盧定的過程中，針對縮合步驟，可加入 含有HOBt/DIC或TBTU/NMM的縮合劑，并且在縮合過程中進行監(jiān)測；而針對縮合精氨酸 (Arg)的步驟，其中還需含有五氟苯酚，可以有效降低成本。本發(fā)明中所使用的縮寫的含義列于下表 如本文所用，“固相合成”或“多肽固相合成(solid phase peptidesynthesis)" 是一種本領域熟知的多肽合成技術，包括但不限于下述方法將一個氨基被保護的氨基酸 共價連接(鍵合)在固相載體上；在去保護劑存在下，脫掉氨基的保護基，使第一個氨基酸 就接到了固相載體上了 ；然后氨基被封閉(保護)的第二個氨基酸的羧基通過N，N' - 二 環(huán)己基碳二亞胺(DCC^Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸 再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應(縮合)形成肽鍵，這樣在固相載體上就 生成了一個帶有保護基的二肽；重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達 到所需要的肽鏈長度；最后脫去氨基的保護基，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵(切割)， 得到合成好的肽。如本文所用，“去保護劑”是指可以將連接在氨基酸上的氨基保護劑去除的化學試 劑，所述的氨基保護劑可以使本領域熟知的，例如但不限于，F(xiàn)moc，Boc;優(yōu)選地，本發(fā)明的去 保護劑含有以其總體積計，含有3-20%哌啶和0.5-10%二環(huán)脒(DBU)；優(yōu)選，所述的去保 護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0-20% 1-羥基苯并三唑(HOBt)、0-10% 3-羥 基-1，2，3-苯并三嗪-4 (3H)-酮(HOOBT)。如本文所用，“縮合劑”是指使一個氨基酸的氨基和另一個氨基酸的羧基縮合形成 肽鍵的化學試劑，可以使本領域熟知的，例如但不限于，碳二亞胺、ByPOB、HATU、TBTU。
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如本文所用，“切割劑”是指將同樹脂鍵合的多肽和樹脂分離的化學試劑，可以使 本領域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。在本發(fā)明的一個實例中，本發(fā)明多肽固相合成比法盧定的制備方法包括以下步 驟第一步，將Fmoc-亮氨酸(Fmoc-Leu)和樹脂鍵合，得到連接有亮氨酸的樹脂；可以
使用本領域所熟知的樹脂使，優(yōu)選Wang樹脂，更優(yōu)選Wang樹脂的替代率為0. 6-1. 4mmol/ g ；第二步，將本發(fā)明的去保護劑和連接有亮氨酸的樹脂混合，脫除Fmoc基團；第三步，將Fmoc-Tyr (tBu) -OH和樹脂上的Leu進行縮合形成肽鍵，得到 Fmoc-Tyr (tBu) -Leu-樹月旨；第四步，使用本發(fā)明的去保護劑脫除Fmoc基團；第五步，重復上述肽鍵形成步驟，使肽鏈從C端向N端生長，直至得到Fmoc-Asp (0 tBu) "-Phe12-Glu (OtBu) 13_G1u (OtBu) 14-IIe15-Pro16-Glu (OtBu) 17_G1u (OtBu) 18-Tyr (tBu) 19_L eu20-樹脂；(OtBu/tBu是保護基，最后會被脫除)第六步，使用本發(fā)明的去保護劑脫除Fmoc基團；第七步，將Fmoc-Asn (Trt) -Gly-OH和樹脂上的多肽縮合，形成Fmoc-Asn (Trt) 9_G Iy10-Asp (OtBu) "-Phe12-Glu (OtBu) 13_G1u (OtBu) 14-IIe15-Pro16-Glu (OtBu) 17_G1u (OtBu) 18-Ty r(tBU)19-LeU2°-樹脂；第八步，使用本發(fā)明的去保護劑脫除Fmoc基團；第九步，將Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和樹脂上的多肽縮合，形成Fmoc-Gly5-Gly6 -Gly7-Gly8-Asn (Trt) 9-Gly10-Asp (OtBu) "-Phe12-Glu (OtBu) 13_G1u (OtBu) 14-I Ie15-Pro16-Glu ( OtBu) 17-G1u (OtBu) 18-Tyr (tBu) 19-Leu20-樹脂；第十步，使用本發(fā)明的去保護劑脫除Fmoc基團；第十一步，重復上述肽鍵形成步驟，使肽鏈從C端向N端生長，直至得到Boc-D-Ph e'-Pro'-Arg (Pbf) '-Pro4-G 1 y5-G1 y6-G 1 y7-G1 y8-Asn (Trt) 9-Gly10-Asp (OtBu) "-Phe12-Glu (Ot Bu) 13-G1u (OtBu) 14-IIe15-Pro16-Glu (OtBu) 17_G1u (OtBu) 18-Tyr (tBu) 19-Leu20-樹脂；第十二步，在切割劑存在下，使多肽樹脂上的如式I所示多肽和樹脂分離，得到比 法盧定；所述切割劑中含有TFA、TIS和水。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，第一步中將1. 0-3. O倍的Fmoc-Leu-OH和Wang樹脂反應。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，第三、第五、第七、第九、和/或第十一步肽鍵形成的反 應中，將1. 5-4. 5倍樹脂當量的Fmoc-氨基酸(或多肽)，1. 5-3. O倍樹脂當量的HOBt用 lmL/g樹脂量的DMF溶解后排加入到樹脂中，再加入2. 0-6. O倍樹脂當量的DIC或TBTU反 應90鐘后，將上述溶液在10°C下，再用DMF將上述溶液稀釋至4mL/g樹脂的體積，反應6小 時。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，在上述第十一步肽鍵形成的反應中，有關 Fmoc-Arg(Pbf) -OH的縮合步驟是這樣進行的1. 5-6. O當量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟 苯酚，用3毫升每克樹脂量的DMF溶解后，再加入1. 5-6. O當量的縮合劑，如DIC或HATU或 TBTU或PyBOP，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg (Pbf) -OPfp酯/DMF溶液加入到樹脂中，攪拌反應12-36小時。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述的縮合(即肽鍵形成的反應)用茚三酮顯色 法(Kaiser)監(jiān)控。更佳地，脯氨酸(Pro)之后的縮合反應(就是Pro后面的一個氨基酸， 如 l#Boc-D-Phe-0H，3#Fmoc-Arg(pbf)-0H，15#Fmoc-IIe-OH 的縮合)使用 Chloranil 和 Kaiser測試法進行監(jiān)控。有關茚三酮顯色法(Kaiser)、Chloranil和Kaiser測試法，及其監(jiān)控方法可以參 見文獻 VIRENDER K. SARIN, et al. "Quantitative Monitoring of Solid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction"ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 117,147-157(1981)、 E. KAISER, et al. “Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides" SHORT COMMUNICATIONS 595-598(Received October 28，1969)、和 THORKILD CHRISTENSEN "A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid Phase Peptide Synthesis Using Chlorani1，，Acta Chemica Scandinavica B 33(1979)763-766。通過本發(fā)明提供的制備方法得到的比法盧定，產率可以是90-125%，其純度可以 達到80% -91%。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，還可以將第十二步得到的比法盧定進行沉降， 即將第十二步得到的如式I的多肽和MTBE或乙醚混合，形成多肽沉淀；較佳地，是用冰水浴 或本領域熟知的其它致冷劑將MTBE或乙醚冷卻至零下10至0°C，用另一種醚洗滌、分離。 將沉淀混合物過濾或離心分離沉淀，得到純化的比法盧定，其純度可達到80%以上。本發(fā)明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、大大節(jié)約成本通過比較樹脂、特殊氨基酸的合成等方面的傳統(tǒng)工藝和本發(fā)明 的工藝，可以降低成本約50%。2、降低雜質，提高純度本發(fā)明提供的固液相片段合成方法，消除了由Gly引起的主峰前后雜，前雜含量 [Bivalirudin+Gly] < 0. 2%，后雜含量[Bivalirudin-Gly] < 0. 6%03、危險系數(shù)降低采用少量乙醚，大大提高了生產的安全性。乙醚閃點_45°C，沸點34.6°C，為極易 燃化學物品。甲基叔丁基醚閃點_28°C，沸點55. 3°C。4、環(huán)保，產生廢棄物少本發(fā)明的生產工藝完全為固相合成法，因此幾乎為無水生產，洗滌用的有機溶劑 可回收循環(huán)再利用，產生廢棄物少。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數(shù)、比率、比例、或份數(shù)按
重量計。本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在 1. Z-Gly-Gly-OMe 的合成將Z-Gly-OH(104. 55g)和 H-Gly-OMe. HCl (69. 05g)溶解在 DMF(600mL)中，冷卻 該溶液至內溫0°C。向溶液中加入HOBt (74. 32g)和EDC. HCl (105. 44g)，加入NMM調節(jié)反 應液PH值到8，NMM加畢，移除冷浴，在室溫下反應。用TLC監(jiān)測反應，反應畢，反應液用 EtOAc (600ml)稀釋，用5% H3P04 (600ml)洗滌，水相再用Et0Ac(300ml)萃取，合并有機相， 依次用5% H3P04，飽和食鹽水洗滌一次，飽和NaHC03洗滌三次，飽和食鹽水洗滌一次。再 用無水Na2S04干燥，過濾、濃縮得到白色固體(Z-Gly-Gly-OMe)。2. Z-Gly-Gly-OH 的合成將Z-Gly-Gly-OMe (280. 34g)溶解在THF(200mL)中，將該溶液冷卻至內溫低于 0°c。向該溶液中滴加IN NaOH溶液(150ml)。加畢，內溫升至1°C，繼續(xù)攪拌反應。用TLC 檢測反應，反應畢，用EtOAc (200ml)萃取溶液三次，有機相棄除，水相用6NHC1調節(jié)pH至3， 濾出生成的固體沉淀，用H20洗滌三次，干燥得到白色固體(Z-Gly-Gly-OH)。3. Boc-Gly-Gly-OBzl 的合成將Boc-Gly-OH(19. 3g)，H-Gly-OBzl. TosOH(44. 5g)和 HOBt (17. 84g)溶解在 DMF (500ml)中，將該溶液冷卻至0°C，加入EDC. HCl (25. 3g)，用NMM調節(jié)pH值至8，撤去冷 浴，室溫反應(20°C )過夜。反應液用EtOAc稀釋，用5% H3P04洗滌，水層用EA萃取。合 并有機相，依次用5% H3P04,飽和食鹽水洗滌一次，飽和NaHC03洗滌三次，飽和食鹽水洗滌 一次，再用無水Na2S04干燥，過濾、濃縮得白色固體(Boc-Gly-Gly-OBzl)。4. H-Gly-Gly-OBzl. TFA 的合成將Boc-Gly-Gly-OBzl(29. 02g)溶解在 DCM(150ml)中，在 0°C下，加入 50mlTFA。所
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100暈升的溶液中溶質的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1制備比法盧定1一、液相法合成 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 片段反應式為得溶液攪拌反應，去除溶劑得到油狀物(H-Gly-Gly-OBzl. TFA)。5. Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl 的合成將H-Gly-Gly-OBzl. TFA(36g)溶解在 DMF(500ml)中，在 0°C 時，加入 NMM 調節(jié) pH 值至 7。在上述溶液中，加入 Z-Gly-Gly-OH (22. 64g), HOBt (12. 16g)，EDC. HCl (17. 25g)。用 NMM調節(jié)pH值至8，移除冷浴，在室溫下反應。反應完畢，將反應生成的沉淀過濾出，依次用 5% H3P04，飽和 NaHC03 溶液，水洗滌，干燥得固體(Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl)。6. H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的合成在40 "C,將 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl (38. 5g)溶解在 DMF(IL)中，加入 Pd/ C(10%，10g)，加氫還原。反應畢，過濾去除固體，濾液棄去。將濾渣用200mL IN NaHC03溶 液攪拌，過濾得濾液，直接用于下一步。7. Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的合成將上一步所得溶液降溫，加入Fmoc-OSu的THF溶液，體系渾濁。移除冷浴，在室溫 下反應。加入INHCl調節(jié)pH值至2至3，過濾出生成沉淀，用水和EA洗滌，干燥得固體。粗品溶解在70°C的DMF中，加入到4倍體積的水和4倍體積的飽和食鹽水混合溶 液中，沉淀析出。所得固體用水洗滌，干燥得到產品(Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，純度為 98. 54% )。二、固相法合成D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu -Glu-Tyr-Leu裝載將氨基酸樹脂裝入一個合適大小的固相合成反應器中。每克樹脂用10-15 毫升DMF溶脹2-3小時。Fmoc-亮氨酸鍵合步驟2. O equivalent mol (倍當量的)Fmoc-亮氨酸，經2，6_二 氯苯甲酰氯和吡啶活化與Wang樹脂(替代率0. 6-1. 4mmol/g)在N，N- 二甲基甲酰胺溶液 中反應。Fmoc脫除步驟用15%哌啶/5% DBU的DMF溶液30分鐘脫除Fmoc基團。再用 DMF洗滌樹脂1遍；甲醇洗滌樹脂3遍；DMF洗滌樹脂3遍。Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 縮合步驟3. O 倍樹脂當量的 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH, 3. O當量的HOBT用3mL/g樹脂量的DMF溶解后加入到樹脂中， 再加入3. O倍樹脂當量的DIC。用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控。增長的肽鏈用DMF、甲醇 洗滌樹脂。Boc-D-Phe-OH最后一個氨基酸縮合縮合步驟3. O倍樹脂當量的 Boc-D-Phe-OH (氨基酸#1) (3. O當量)，3. O倍樹脂當量的HOBt用3mL/g樹脂量的DMF溶解 后加入到樹脂中，再加入3. O倍樹脂當量的DIC，反應。Fmoc-Arg (Pbf) -OH 縮合步驟3. O 當量的 Fmoc-Arg (Pbf) _0H 和五氟苯酚用 3 毫升每克樹脂量的DMF溶解后，再加入3. O當量的DIC，攪拌45分鐘，將上述活化好的 Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到樹脂中，攪拌反應3小時。如果縮合反應在21-24 小時仍未完全，重復上述Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp活化酯的縮合。反應監(jiān)控/重復縮合縮合反應用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控，如果是脯氨酸 (Pro)之后的縮合反應則用Chloranil and Kaiser測試法監(jiān)控。
合成完畢洗滌步驟完成多肽序列的所有氨基酸縮合后，樹脂用甲醇、DMF洗滌， 干燥直至恒重，并根據(jù)樹脂增重計算合成產率。切割液配制在一個夾套玻璃反應釜里將三氟乙酸(TFA)/三異丙基硅烷(TIS)/ 7jC，按95 2.5 2. 5 (體積比)(士 10% )的配比混合，配制切割液。切割將多肽樹脂加入到冷卻的切割液中，維持混合液溫度在0-15°C。然后將反 應混合液回溫至18-28°C，并在此溫度下攪拌反應120-180分鐘。接著，用反應釜底過濾板， 過濾分離混合液，用三氟乙酸洗滌過濾掉的樹脂，每克多肽樹脂0. 5-1. OmL的三氟乙酸量。 收集所有濾液，去除樹脂。沉淀用冰水浴或者其它致冷劑將甲基叔丁基醚(MTBE)冷卻至0_8°C，將濃縮后 的多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。將沉淀混合物在0-10°C靜置60-80分鐘。用離心機 分離沉淀。用甲基叔丁基醚洗滌沉淀，然后再次用離心機分離沉淀。產品干燥將多肽固體轉移到一個合適的容器中，干燥得到比法盧定1。經測定，雜質[Bivalirudin-Gly]含量為0. 17%，雜質[Bivalirudin+Gly]含量為 0. 07%。實施例2制備比法盧定2一、液相法合成 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 片段反應式為 1. Z-Gly-Gly-OMe 的合成將Z-Gly-OH(104. 55g)和 H-Gly-OMe. HCl (69. 05g)溶解在 DMF(600mL)中，冷卻 該溶液至內溫0°C。向溶液中加入HOBt (74. 32g)和EDC. HCl (105. 44g)，加入NMM調節(jié)反 應液PH值到8，NMM加畢，移除冷浴，在室溫下反應。用TLC監(jiān)測反應，反應畢，反應液用 EtOAc (600ml)稀釋，用5% H3P04 (600ml)洗滌，水相再用EA (300ml)萃取，合并有機相，依 次用5% H3P04，飽和食鹽水洗滌一次，飽和NaHC03洗滌三次，飽和食鹽水洗滌一次。再用 無水Na2S04干燥，過濾、濃縮得到白色固體(Z-Gly-Gly-OMe)。2. Z-Gly-Gly-OH 的合成將Z-Gly-Gly-OMe (280. 34g)溶解在THF(200mL)中，將該溶液冷卻至內溫低于 0°c。向該溶液中滴加IN NaOH溶液(150ml)。加畢，內溫升至1°C，繼續(xù)攪拌反應。用TLC檢測反應，反應畢，用EtOAc (200ml)萃取溶液三次，有機相棄除，水相用6NHC1調節(jié)pH至3， 濾出生成的固體沉淀，用H20洗滌三次，干燥得到白色固體(Z-Gly-Gly-OH)。3. Boc-Gly-Gly-OBzl 的合成將Boc-Gly-OH(19. 3g)，H-Gly-OBzl. TosOH(44. 5g)和 HOBt (17. 84g)溶解在 DMF (500ml)中，將該溶液冷卻至0°C，加入EDC. HCl (25. 3g)，用NMM調節(jié)pH值至8，撤去冷 浴，室溫反應(20°C )過夜。反應液用EtOAc稀釋，用5% H3P04洗滌，水層用EA萃取。合 并有機相，依次用5% H3P04,飽和食鹽水洗滌一次，飽和NaHC03洗滌三次，飽和食鹽水洗滌 一次，再用無水Na2S04干燥，過濾、濃縮得白色固體(Boc-Gly-Gly-OBzl)。4. H-Gly-Gly-OBzl. TFA 的合成將Boc-Gly-Gly-OBzl(29. 02g)溶解在 DCM(150ml)中，在 0°C下，加入 50mlTFA。所 得溶液攪拌反應，去除溶劑得到油狀物(H-Gly-Gly-OBzl. TFA)。5. Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl 的合成將H-Gly-Gly-OBzl. TFA(36g)溶解在 DMF(500ml)中，在 0°C 時，加入 NMM 調節(jié) pH 值至 7。在上述溶液中，加入 Z-Gly-Gly-OH (22. 64g), HOBt (12. 16g)，EDC. HCl (17. 25g)。用 NMM調節(jié)pH值至8，移除冷浴，在室溫下反應。反應完畢，將反應生成的沉淀過濾出，依次用 5% H3P04，飽和 NaHC03 溶液，水洗滌，干燥得固體(Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl)。6. H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的合成在40 "C,將 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl (38. 5g)溶解在 DMF(IL)中，加入 Pd/ C(10%，10g)，加氫還原。反應畢，過濾去除固體，濾液棄去。將濾渣用200mL IN NaHC03溶 液攪拌，過濾得濾液，直接用于下一步。7. Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的合成將上一步所得溶液降溫，加入Fmoc-OSu的THF溶液，體系渾濁。移除冷浴，在室溫 下反應。加入INHCl調節(jié)pH值至2至3，過濾出生成沉淀，用水和EA洗滌，干燥得固體。
粗品溶解在70°C的DMF中，加入到4倍體積的水和4倍體積的飽和食鹽水混合溶 液中，沉淀析出。所得固體用水洗滌，干燥得到產品(Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，純度為 98. 54% )。二、液相法合成 Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OBzl 片段反應式為 1. Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl 的合成將Z-Asn(Trt)-0H(10. 17g), H-Gly-OBzl. TosOH(7. 42g) ,H0Bt(2. 97g)溶解在 DMF 中，降溫至0°C，加入EDC.HCl(4.22g)。加入NMM調節(jié)pH值至8，室溫下反應。反應液用EA 稀釋，用5% H3P04洗滌，水相用EA萃取，合并有機相用5% H3P04 (SOmL)洗滌三次，飽和食 鹽水洗滌一次。產品從有機相中析出，過濾，干燥得到部分白色產品。濃縮濾液得到粗品， 用EA(50ml)重結晶，得到白色產品(Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl,純度為99. 78% )02. Fmoc-Asn (Trt) -Gly-OH 的合成
將Z-Asn (Trt)-Gly-OBzl (3. 66g)溶解在DMF (35ml)中，加入Pd/C，加氫還原反應。 反應液用水(40ml)稀釋，攪拌lOmin，過濾。所得濾液，降溫至0°C，加入Fmoc-OSu (1. 88g)， 用IN NaOH調節(jié)pH8，接著用10% Na2C03調節(jié)pH至8_9，反應至反應體系渾濁，冰水浴冷卻， 調節(jié)PH值到2-3。所得固體置入2-8°C冰箱過夜，過濾，用水洗滌固體，干燥得到粗品(純 度 75. 90% )。將粗品加熱溶解在MeOH(500ml)中，降至室溫后，置入冰箱。過濾所得固體，干燥 得到產品(純度98. 7% )0三、固相法合成D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu -Glu-Tyr-Leu裝載將氨基酸樹脂裝入一個合適大小的固相合成反應器中。每克樹脂用10-15 毫升DMF溶脹2-3小時。Fmoc-亮氨酸鍵合步驟2. O倍當量的Fmoc-亮氨酸，經2，6_ 二氯苯甲酰氯和吡啶 活化與Wang樹脂(替代率0. 6-1. 4mmol/g)在N，N- 二甲基甲酰胺溶液中反應。Fmoc脫除步驟用15 %哌啶/5 % DBU的DMF溶液30分鐘脫除Fmoc基團。再用 DMF洗滌樹脂1遍；甲醇洗滌樹脂3遍；DMF洗滌樹脂3遍。Fmoc-Asn (Trt)-Gly-OH 縮合步驟3. O 倍樹脂當量的 Fmoc-Asn (Trt)-Gly-OH，3. O 當量的HOBt用3mL/g樹脂量的DMF溶解后加入到樹脂中，再加入.3. O倍樹脂當量的DIC， 反應。用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控。增長的肽鏈用DMF洗滌樹脂；甲醇洗滌樹脂。Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 縮合步驟3. O 倍樹脂當量的 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH, 3. O當量的HOBT用3mL/g樹脂量的DMF溶解后加入到樹脂中， 再加入3. O倍樹脂當量的DIC，反應。用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控。增長的肽鏈用DMF、 甲醇洗滌樹脂。Boc-D-Phe-OH最后一個氨基酸縮合縮合步驟3. O倍樹脂當量的 Boc-D-Phe-OH (氨基酸#1) (3. O當量)，3. O倍樹脂當量的HOBt用3mL/g樹脂量的DMF溶解 后加入到樹脂中，再加入3. O倍樹脂當量的DIC，反應。Fmoc-Arg (Pbf) -OH 縮合步驟3. O 當量的 Fmoc-Arg (Pbf) _0H 和五氟苯酚用 3 毫升每克樹脂量的DMF溶解后，再加入3. O當量的DIC，攪拌45分鐘，將上述活化好的 Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到樹脂中，攪拌反應3小時。如果縮合反應在21-24 小時仍未完全，重復上述Fmoc-Arg (Pbf)-OPfp活化酯的縮合。反應監(jiān)控/重復縮合縮合反應用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控，如果是脯氨酸 (Pro)之后的縮合反應則用Chloranil and Kaiser測試法監(jiān)控。合成完畢洗滌步驟完成多肽序列的所有氨基酸縮合后，樹脂用甲醇、DMF洗滌， 干燥直至恒重，并根據(jù)樹脂增重計算合成產率。切割液配制在一個夾套玻璃反應釜里將三氟乙酸(TFA)/三異丙基硅烷(TIS)/ 水，按95 2.5 2. 5 (體積比)(士 10% )的配比混合，配制切割液。切割將多肽樹脂加入到冷卻的切割液中，維持混合液溫度在0-15°C。然后將反 應混合液回溫至18-28°C，并在此溫度下攪拌反應120-180分鐘。接著，用反應釜底過濾板， 過濾分離混合液，用三氟乙酸洗滌過濾掉的樹脂，每克多肽樹脂0. 5-1. OmL的三氟乙酸量。收集所有濾液，去除樹脂。沉淀用冰水浴或者其它致冷劑將甲基叔丁基醚(MTBE)冷卻至0_8°C，將濃縮后 的多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。將沉淀混合物在0-10°C靜置60-80分鐘。用離心機 分離沉淀。用甲基叔丁基醚洗滌沉淀，然后再次用離心機分離沉淀。產品干燥將多肽固體轉移到一個合適的容器中，干燥得到比法盧定2。經測定，雜質[Bivalirudin-Gly]含量為0. 19%，雜質[Bivalirudin+Gly]含量為 0. 42%。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質技術內容范 圍，本發(fā)明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術 實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將 被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
權利要求
一種比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc Asn(Trt) Gly OH和如式V所示的多肽樹脂縮合，得到如式III所示的多肽樹脂；(2)將如式III所示的多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(3)將Fmoc Gly Gly Gly Gly OH和如式VI所示的多肽樹脂縮合，得到如式IV所示的多肽樹脂；(4)通過固相合成的方法將氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的順序依次同如式IV所示的多肽樹脂上的多肽縮合，形成如式II所示的多肽樹脂；和(5)使式II所示多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的Fmoc-Asn(Trt) -Gly-OH通過下 述步驟得到⑴將Z-Asn(Trt)-OH和H-Gly-OBzl. TosOH混合，進行液相多肽縮合，得到 Z-Asn (Trt)-Gly-OBzl ；(ii)將Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl 進行氫化還原，得到 H-Asn(Trt)-Gly-OH ；禾口(iii)將H-Asn (Trt) -Gly-OH 和 Fmoc 保護基混合，得到 Fmoc-Asn (Trt) -Gly-OH。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通過 下述步驟得到(a)將H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，進行液相多肽縮合，得到 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl ；(b)將Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl 進行氫化還原，得到 H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH ；禾口(c)將H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 和 Fmoc 保護基混合，得到 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的H-Gly-Gly-OBzl通過將 Boc-Gly-OH和H-Gly-OBzl進行液相多肽縮合后脫保護基得到。
5.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的Z-Gly-Gly-OH通過將Z-Gly-OH 和H-Gly-OMe進行液相多肽縮合后還原得到。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述去保護劑以其總體積計，其中含 有3-20%哌啶和0.5-10%二環(huán)脒(DBU)；優(yōu)選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種 或多種物質0-20% 1-羥基苯并三唑(HOBt)、0-8% 3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4 (3H)-酮 (HOOBT)
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑷中Arg同多肽樹脂進行縮合時 將Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚以及縮合劑混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-OH和樹脂上的多肽 進行縮合。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述縮合在選自下述的一種或多種縮 合劑的存在下進行N，N，- 二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N， N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸 (TBTU) /N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲 基脲六氟磷酸(HBTU)/N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)、(苯并三唑-1-基-氧) 三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyBOP)U-羥基苯并三唑(HOBt)。
9.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的縮合用茚三酮顯色法(Kaiser) 監(jiān)控。
10.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)在各物質配比為95-60三氟 乙酸(TFA) 5-10三異丙基硅烷(TIS) 5-30水的切割劑存在下進行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，所述的方法包括步驟(1)在縮合劑存在下將Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽樹脂縮合，得到如式III所示的多肽樹脂；(2)將如式III所示的多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(3)在縮合劑存在下將Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽樹脂縮合，得到如式IV所示的多肽樹脂；(4)通過固相合成的方法將氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至D-Phe的順序依次同如式IV所示的多肽樹脂上的多肽縮合，形成如式II所示的多肽樹脂；和(5)在切割劑的存在下使式II所示多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；
文檔編號C07K1/06GK101906150SQ20101021454
公開日2010年12月8日 申請日期2010年6月28日 優(yōu)先權日2010年6月28日
發(fā)明者劉亞東, 張國慶, 張若平, 白俊才 申請人:上海昂博生物技術有限公司