專利名稱：一種藻藍蛋白提取物的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種藻藍蛋白提取物的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
螺旋藻是一種食品巨型藻，其營養(yǎng)價值得到了廣泛報道。作為螺旋藻中的主要蛋 白組成，藻藍蛋白由α、β兩種脫輔基蛋白和色基組成，在620nm具有最大吸收，在640nm 具有較強的紅色熒光特性?；谒苄院?，熒光強度高和抗氧化等性能，藻藍蛋白既可以作 為天然色素添加劑應(yīng)用于食品和化妝品工業(yè)，同時又可以開發(fā)成熒光試劑用于醫(yī)學診斷、 免疫化學及生物工程等研究領(lǐng)域，另外作為一種重要的生理活性成分，還可以制成藥品用 于醫(yī)療保健上。目前，藻藍蛋白的制備方法主要包括離子交換層析和凝膠過濾層析。這兩 種方法操作繁瑣，很難實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，在保證蛋白活性的基礎(chǔ)上，研發(fā)高效、經(jīng)濟可 以大規(guī)模制備的分離技術(shù)成為藻藍蛋白開發(fā)的關(guān)鍵。鑒于藻藍蛋白不僅可以提供人體必需的氨基酸，而且對腫瘤細胞有較強的親和 力，對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出顯著的殺傷效果，其營養(yǎng)及藥學價值得到了廣泛報道。最近的諸 多數(shù)據(jù)表明，藻藍蛋白具有抗氧化特性，并在涉及到活性氧的炎癥，動脈粥樣硬化，癌癥等 多種疾病的防治中表現(xiàn)出良好的藥效。在十二種炎癥模型中，藻藍蛋白都表現(xiàn)出與劑量依 存的消炎活性。利用其清除活性氧，抑制環(huán)氧酶_2活性和柱狀細胞中組氨釋放等作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種藻藍蛋白提取物的制備和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種藻藍蛋白提取物將螺旋藻粉在-20°C 4°C下通過反復(fù)凍融法破碎螺旋藻 細胞壁得到粗提物；用質(zhì)量分數(shù)為50-60%的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質(zhì)粗提物；而后 采用雙水相萃取純化蛋白質(zhì)粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。所述藻藍蛋白提取物水溶液的吸光度特點為A6w28tl ^ 3. 0 士 0. 2， A6207650 ^ 2. 2士0. 1。所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水， 微溶于乙醇和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、 干燥的條件下可長期保存。制備方法將螺旋藻粉在-20°C 4°C下通過反復(fù)凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到 粗提物；用質(zhì)量分數(shù)為50-60%的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質(zhì)粗提物；而后采用雙水相 萃取純化蛋白質(zhì)粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。所述藻藍蛋白提取物溶液冷凍干燥，即得到藻藍蛋白提取物。所述雙水相萃取的 水相質(zhì)量組成分別為4%的PEG、15%的氯化鉀和10%的pH7. 0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀 水溶液組成。所述超滲除鹽采用30KDa的濾膜進行超滲除鹽。應(yīng)用所述藻藍蛋白提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明依次采用硫酸銨沉淀、雙水相萃取和超滲除鹽，避免了傳統(tǒng)層析技術(shù)的弊端，可以大規(guī)模生產(chǎn)藻藍蛋白提取物。將所得藻藍蛋白提取物采用灌 胃的方式將其對S180肉瘤小鼠進行不同劑量給藥，結(jié)果表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制效果，并且 對脾臟和胸腺并沒有表現(xiàn)出明顯的毒性。與傳統(tǒng)的化療藥物(環(huán)磷酰胺)相比較，其水溶 性好、毒副作用低、給藥方便。


圖la.為本發(fā)明實施例制備過程各樣品的紫外可見光譜表征圖。圖lb.為本發(fā)明實施例制備藻藍蛋白提取物的熒光光譜表征圖。圖2a.為本發(fā)明實施例制備所得藻藍蛋白提取物硫酸鋅染色紫外成像電泳表征 圖。圖2b.為本發(fā)明實施例制備所得藻藍蛋白提取物考馬斯亮藍染色成像電泳表征 圖。圖3a.為本發(fā)明實施例例制備所得藻藍蛋白提取物在4°C時不同PH值磷酸鹽溶液 中的光譜穩(wěn)定性圖。圖3b.為本發(fā)明實施例例制備所得藻藍蛋白提取物在25°C時不同pH值磷酸鹽溶 液中的光譜穩(wěn)定性圖。
具體實施例方式藻藍蛋白提取物以螺旋藻藻粉為原料制備的藻藍蛋白提取物主要由藻藍蛋白組成。其水溶液的吸 光度特點為 A6207280 ^ 3.0 + 0.2, A6207650 ^ 2.2 + 0. I0所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇 和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、干燥的條件 下長期保存。實施例1制備稱取IOg市售螺旋藻藻粉(深圳生物科技公司)，懸浮于150mL水中攪拌混勻后， 于-20 4°C反復(fù)凍融三次，破碎螺旋藻細胞壁，得到粗提物。將所得粗提物在9000rpm下離 心IOmin取上清。將上清液中加入約44克硫酸銨，充分攪拌溶解，4°C靜置4h后，9000rpm， 離心IOmin棄上清。所得沉淀用30mL純水溶解后，采用雙水相萃取純化蛋白質(zhì)粗提物，其中 雙水相萃取條件為1.2kg雙水相體系，其中各組成的質(zhì)量分數(shù)分別為4%的PEG、15%的氯 化鉀、10%的pH 7. 0磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀水溶液，充分振蕩后，在40°C靜置2小時充分 分層取上相。將上清液利用30KDa的濾膜超滲除鹽，純化后蛋白溶液冷凍干燥得到可以室 溫保存的螺旋藻藻粉提取的藻藍蛋白提取物。藻藍蛋白提取物中主要成分為藻藍蛋白，(參 見圖la、b和圖2a、b)，其水溶液的吸光度特點為A62Q/28Q 3. 0士0. 2，A6207650 2. 2士0. 1。該方法將硫酸銨沉淀、雙水相萃取和超滲等多種方法結(jié)合，避免了傳統(tǒng)層析柱技 術(shù)的弊端，有利于規(guī)模放大和工業(yè)生產(chǎn)。此外，本方法中硫酸銨沉淀后樣品無需除鹽，直接 溶解進而通過一次雙水相萃取技術(shù)，共同透析除鹽實現(xiàn)了藻藍蛋白提取物的制備，將藻藍 蛋白的純度提高了 6倍，與文獻對比，提高了純度效率，同時簡化了操作步驟。
其中文獻為 Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001, 76 1273-1280.所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇 和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、干燥的條件 下長期保存。圖Ia為室溫下測定的制備過程中所得提取物水溶液的紫外可見吸收光譜。如圖 所示，反復(fù)凍融法破碎螺旋藻細胞后離心上清在260nm處具有較強的吸收峰，其A62W約為 0. 5，表明藻藍蛋白的純度很低，其中含有較多的核酸分子；經(jīng)過硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)粗提 物在260nm處的吸收峰相對降低，A62(i/28(i相對提高，這表明硫酸銨沉淀除去了部分核酸分子 和雜蛋白；經(jīng)過雙水相萃取并超滲除鹽后得到的藻藍蛋白提取物在280nm和620nm處有明 顯的吸收峰，A6207280約為3. 0，A6207650約為2. 2，這表明雙水相萃取和超滲步驟進一步出去了 核酸分子和雜蛋白，所得到藻藍蛋白提取物中主要成分為藻藍蛋白。圖Ib為室溫下測定的藻藍蛋白提取物水溶液的熒光光譜。如圖所示，該藻藍蛋白 提取物在500nm的光激發(fā)條件下，其熒光發(fā)射峰在640nm處，這進一步證明了藻藍蛋白提取 物中主要成分為藻藍蛋白。。圖2a、b分別為藻藍蛋白提取物的5-12% SDS-PAGE不連續(xù)電泳的硫酸鋅染色和 考馬斯亮藍染色結(jié)果。電泳泳道從左到右依次為反復(fù)凍融法破碎螺旋藻細胞破壁后的粗 提物；制備所得藻藍蛋白提取物；蛋白質(zhì)Ma rker0如圖所示，硫酸鋅染色和考馬斯亮藍染 色均可看到明顯的α、β亞基條帶。證明兩種亞基上均連有色基，亞基的分子量大小約為 18kDa 和 20kDa。圖3a、b分別為4°C和25°C時，pH 3. 0 10. 0磷酸鹽溶液中，藻藍蛋白提取物在 620nm處的吸光度隨時間的變化。由圖可見，4°C時，該提取物的pH 5. 0 7. 0磷酸鹽溶 液在一周內(nèi)吸收光譜基本穩(wěn)定，其他PH值溶液在620nm的吸光度均表現(xiàn)不同程度的降低， 且在第一天的降低最為明顯，其中PH 10.0的磷酸鹽溶液最不穩(wěn)定。25°C時，該提取物pH 5. 0的磷酸鹽溶液在一周內(nèi)的光譜較為穩(wěn)定，pH 4. 0,6. 0,7. 0的磷酸鹽溶液從第三天開始 620nm的吸光度顯著降低，其他pH值溶液從第一天開始620nm的吸光度顯著降低，其中pH 10.0的磷酸鹽溶液最不穩(wěn)定。由此可見，該提取物的水溶液適于在中性或者偏酸性環(huán)境低 溫避光保存。實施例2采用上述提取所得藻藍蛋白提取物對移植S 180肉瘤小鼠的灌胃給藥效果實驗SPF昆明小鼠，18 22g，雄性，青島藥檢所動物中心提供。S 180肉瘤瘤株移 自中國醫(yī)學科學院，本室傳代，在無菌操作下，每鼠右前腋窩部皮下接種腫瘤細胞懸液 0. 2ml (鏡檢含瘤細胞數(shù)9 X IO7個/ml)。小鼠接種腫瘤細胞次日，按體重隨機分5組，每 組8只，于接種后24h給藥。小鼠灌胃或腹腔注射藥品均以生理鹽水溶解，容積均按體重為 0. lml/10go陰性對照組灌胃生理鹽水，陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(CY)25mg/kg*d，大、 中、小3個劑量給藥組分別灌胃給藥藻藍蛋白提取物50mg/kg · d，100mg/kg · d和200mg/ kg ·(!，連續(xù)給藥10d。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死后剝?nèi)×鰤K、胸腺、脾臟，電子天平稱 濕重，按下列公式求出腫瘤抑制率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，并用SPSS軟件進行顯著性檢驗(t檢驗)。 表1藻藍蛋白提取物灌胃給藥對小鼠S180肉瘤的抑制效果。
*代表與對照組對比有顯著性差異，P < 0. 05。 表1表明，與陰性對照組相比，25mg/kg · d環(huán)磷酰胺腹腔注射給藥和50mg/kg · d， 100mg/kg -d^OOmg/kg-d藻藍蛋白提取物灌胃給藥10天，均能達到明顯抑制S180肉瘤生 長的效果，具有顯著性差異。表2藻藍蛋白提取物灌胃給藥對S180肉瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響。 *代表與對照組對比有顯著性差異，P < 0. 05。表2表明，與陰性對照組相比，25mg/kg · d環(huán)磷酰胺腹腔注射給藥對小鼠的胸腺指 數(shù)和脾指數(shù)造成顯著性影響，而50mg/kg · d，100mg/kg · d，200mg/kg · d藻藍蛋白提取物灌 胃給藥10天，未對小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)造成顯著性影響。
權(quán)利要求
一種藻藍蛋白提取物，其特征為將螺旋藻粉在 20℃～4℃下通過反復(fù)凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到粗提物；用質(zhì)量分數(shù)為50 60％的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質(zhì)粗提物；而后采用雙水相萃取純化蛋白質(zhì)粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。
2.按權(quán)利要求1所述的藻藍蛋白提取物，其特征為所述藻藍蛋白提取物水溶液的吸 光度特點為 A6207280 ^ 3.0 + 0.2, A6207650 ^ 2.2 + 0. I0
3.按權(quán)利要求1所述的藻藍蛋白提取物，其特征為所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末 狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相 對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、干燥的條件下可長期保存。
4.一種按權(quán)利要求1所述的藻藍蛋白提取物的制備方法，其特征為將螺旋藻粉 在-20°C 4°C下通過反復(fù)凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到粗提物；用質(zhì)量分數(shù)為50-60%的 硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質(zhì)粗提物；而后采用雙水相萃取純化蛋白質(zhì)粗提物，并用超滲 除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。
5.按權(quán)利要求4所述的藻藍蛋白提取物的制備方法，其特征為所述藻藍蛋白提取物 溶液冷凍干燥，即得到藻藍蛋白提取物。
6.按權(quán)利要求4所述的藻藍蛋白的制備方法，其特征為所述雙水相萃取的水相質(zhì)量 組成分別為4%的PEG、15%的氯化鉀和10%的pH7. 0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀水溶液組 成。
7.按權(quán)利要求4所述的藻藍蛋白提取物的制備方法，其特征為所述超滲除鹽采用 30KDa的濾膜進行超滲除鹽。
8.一種按權(quán)利要求1所述的藻藍蛋白提取物的應(yīng)用，其特征在于所述藻藍蛋白提取 物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種藻藍蛋白提取物的制備和應(yīng)用。藻藍蛋白提取物將螺旋藻粉在-20℃～4℃下通過反復(fù)凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到粗提物；用質(zhì)量分數(shù)為50-60％的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質(zhì)粗提物；而后采用雙水相萃取純化蛋白質(zhì)粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。主要由藻藍蛋白組成，其水溶液的吸光度特點為A620/280≈3.0±0.2，A620/650≈2.2±0.1。本發(fā)明主要結(jié)合硫酸銨沉淀、雙水相萃取和透析除鹽等方法得到了藻藍蛋白提取物，并將所得藻藍蛋白提取物對S180肉瘤小鼠進行不同劑量給藥，表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制效果，并且對脾臟和胸腺并沒有表現(xiàn)出明顯的毒性。
文檔編號C07K14/415GK101891809SQ20101021438
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者劉少芳, 李富超, 秦松, 董曉弟, 郭雪潔, 陳英杰 申請人:中國科學院海洋研究所