專利名稱：：含藻藍(lán)蛋白提取物的抗病毒組合物及藻藍(lán)蛋白的提取的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藻類生物體的提取物及其應(yīng)用，特別是藻藍(lán)蛋白的提取和應(yīng)用。藻藍(lán)蛋白廣泛存在于藍(lán)綠藻中，它在葉綠素出現(xiàn)之前已在地球上進(jìn)化了幾十億年。由于它既含有鎂又含有鐵，所以藻藍(lán)蛋白質(zhì)又被視為葉綠素和血紅素的先驅(qū)，是植物和動物共同的生命之源。藻藍(lán)蛋白除含有豐富的高質(zhì)量蛋白質(zhì)外，還富集多種人體所需要的礦物質(zhì)，特別是鈣，因此開發(fā)和利藻藍(lán)蛋白意義重大。對于藻藍(lán)蛋白的提取和應(yīng)用，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明的目的之一是提供一種含藻藍(lán)蛋白提取物的抗病毒劑，其中含有治療有效量的藻藍(lán)蛋提取物和／或藥物上可接受的載體。本發(fā)明的另一目的是提供一種提取藻藍(lán)蛋白的方法，此方法包括下列步驟a．將藍(lán)綠藻粉溶于5-20倍水中，低溫保持8-30小時，b．固液分離，將溶液的pH值調(diào)至酸性，放置，c．收集所得固體為藻藍(lán)蛋白粗品。圖1為藻蛋白的U．V．掃描圖譜；圖2為藻蛋白分離后的U．V．掃描圖譜。本發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種含藻藍(lán)蛋白提取物的抗病毒組合物，所述組合物中包含治療有效量的藻藍(lán)蛋白提取物和／或藥物學(xué)上可接受的載體。所述藻藍(lán)蛋白提取物以如下步驟制備a．將藻粉溶于5-20倍水中，低溫保持8-30小時，b．固液分離，將溶液的pH值調(diào)至酸性，放置，c．收集所得固體為藻藍(lán)蛋白粗品。其中步驟a中的藻粉優(yōu)選為螺旋藻粉，而且其中水的用量優(yōu)選為藻粉的8-15倍，最好是10倍，由于藻藍(lán)蛋白易在高溫下破壞，因此整個提取過程必須保持低溫，通常10-15℃為宜。步驟b中的溶液的pH值優(yōu)選調(diào)節(jié)至3．8-4．2。由本發(fā)明的含藻藍(lán)蛋白提取物的抗病毒組合物具有有效地抑制病毒的復(fù)制和繁殖的能力。本發(fā)明中所述的治療有效量由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易掌握，通常根據(jù)患者的情況，病癥，年齡，體重等情況而定。由于藻藍(lán)蛋白提取物無毒，因此，根據(jù)需要，藥物組合物可以直接由藻藍(lán)蛋白提取物制成。當(dāng)組合物中含有其它藥物學(xué)上可接受的載體時，它們可由制藥領(lǐng)域常規(guī)方法制得。所述藥物學(xué)上可接受的載體包括本領(lǐng)域常規(guī)使用的那些，如溶劑，各種賦形劑，解崩劑等。所述藥物組合物可制成溶液，口服液，糖漿，丸劑，片劑，沖劑，粉劑，顆粒劑，栓劑等劑型形式。以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。1．氨基酸分析精確稱取實(shí)施例1產(chǎn)物約0．2mg產(chǎn)品．加入1ml5．7NHCl，抽氣后封口，在110℃下水解24小時，開管后真空抽干鹽酸，加入50ml雙蒸水，再真空抽干，殘?jiān)秒p蒸水稀釋至100ml或者00ml(根據(jù)樣品濃度決定)．用Backman121MB氨基酸分析儀測定各樣品的氨基酸組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1表1．氨基酸含量分析數(shù)據(jù)表(mg／g樣品)氨基酸分析結(jié)果表明樣品中含有豐富的氨基酸，其中天冬氨酸和酪氨酸的含量尤高，而天冬氨酸能加速肌肉中ATP、CP及糖原的合成，又有利于乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)。2．元素分析結(jié)果準(zhǔn)確稱取實(shí)施例1所得樣品約0．1克，滴加濃硝酸加熱使其水解后，加入雙氧水約0．5ml，用蒸餾水稀釋至50ml，再用等離子光譜儀(JCAP9000ST型)進(jìn)行定量分析。供本實(shí)驗(yàn)用的測試液濃度為2．42mg／ml，元素含量以ng／ml表示。所得分析結(jié)果如下<tablesid="table2"num="002"><table>元素含量元素含量Pb0．0621Mo0．0041Au0．0056Cr0．00271Fe4．556Mn0．1821Mg13．62Co0．0113Si6．920P50．18Al2．358Ba0．1946Ti0．0755B0．3915Cu0．0972Sr0．1320Ni0．0247In0．0639Zn0．4016La0．0698Cd0．0613Ce0．0497Bi0．0454Y0．0055Ga0．0747Sc0．0025Ag0．0152Be0．0041Ca59．41As-V0．0149Nd0．2402</table></tables>3．生化分析(1)U．V．光譜藻蛋白經(jīng)SephadexG-100柱層析后被分為兩個主要的色素蛋白，即分子量較大的黃色蛋白和分子量較小的藍(lán)色蛋白，如圖1所示。其中使用SephadexG100柱(2×105cm)，洗脫劑采用0．05M磷酸緩沖液，PH8．0，流速3．5ml／min。如圖2所示，藻蛋白經(jīng)分離后的成分中Emax670nm(黃色蛋白)，Emax615nm(藻藍(lán)蛋白)，650nm(別藻藍(lán)蛋白)。(2)化學(xué)穩(wěn)定性藻藍(lán)蛋白提取物凍干粉在干燥的室溫條件下，可保存兩年不退色，不變質(zhì)。質(zhì)檢方法1)蛋白含量測定[試劑]BSA，購自中科院東方儀器公司，批號90090。Shimadzu公司UV-240分光光度計(jì)。雙縮脲法(1)制做標(biāo)準(zhǔn)曲線分別量取0，0．15，0．30，0．60，0．90，1．20，1．50ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白貯存液(1．2mg／ml)，用雙蒸水補(bǔ)足到1．5ml／管，各加入1．5ml6％NaOH和0．15ml雙縮脲試劑，混勻，在室溫下靜置20分鐘，于310nm處比色，畫出OD值與樣品濃度的相關(guān)曲線。(2)測定樣品(藻藍(lán)蛋白)中蛋白含量稱取樣品13．2mg，用雙蒸水溶解并定溶至50ml，測量方法同上。2)灰份含量測定灼燒法[測定方法]測定灰份(包括無機(jī)鹽類物質(zhì))，采用灼燒、恒重、稱量法測定。3)氨基酸分析精確稱取約0．2mg樣品，加入1ml5．7NHCl，抽氣后封口，在110℃下水解24小時。開管后真空抽干鹽酸，加入50ml雙蒸水，再真空抽干。殘?jiān)秒p蒸水稀釋至100ml或200ml(根據(jù)樣品濃度決定)。用Backman121MB氨基酸分析儀測定各樣品的氨基酸組成。4)無菌實(shí)驗(yàn)．[測定指標(biāo)](1)樣品經(jīng)乳酸發(fā)酵及EMB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，大腸桿菌數(shù)不超過3個；(2)樣品經(jīng)牛肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)后，總菌數(shù)小于100個。4．功效(1)增加機(jī)體內(nèi)T-細(xì)胞的數(shù)量-T淋巴細(xì)胞檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動物及藥品實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，體重18～22克，疫檢合格。環(huán)磷酰胺(注射用)上海第十二制藥廠生產(chǎn)。藥劑實(shí)施例1制得的干粉，于實(shí)驗(yàn)前配制成20μg／ml和10μg／ml的藥液。實(shí)驗(yàn)方法將小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，給藥組每只每日腹腔注射環(huán)磷酰胺10mg／kg，再經(jīng)口灌胃給藥液，每只每日0．2ml，即相當(dāng)于0．2mg／kg(高劑量組)和0．1mg／kg(低劑量組)；陽性對照組每只每日腹腔注射環(huán)磷酰胺10mg／kg，在經(jīng)口灌胃常水0．2ml；空白對照組不注射、不給藥，只經(jīng)口灌胃常水0．2ml／只／日。連續(xù)給藥10天后，停藥3天，取小鼠眼眶血做白細(xì)胞推片、孵育、染色后，T淋巴細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果注射環(huán)磷酰胺后應(yīng)造成小鼠T-淋巴細(xì)胞明顯下降，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥組反而出現(xiàn)上升，尤其是高劑量組其上升結(jié)果與對照組相比呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0．01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藥液具有較好的提高機(jī)體免疫力的功能。臨床試用證明它對愛滋病(HIV-1)病毒、單皰疹病毒、流感A病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等都有很好的抑制作用。(2)對皮膚中膠原蛋白含量的影響哺乳動物及人類皮膚中膠原蛋白的含量是隨著年齡的增長而逐漸降低的。在膠原蛋白的氨基酸組成中，羥脯氨酸占12～14％。而其它組織中幾乎不含羥脯氨酸。含量高且穩(wěn)定的羥脯氨酸成分是膠原蛋白的一大特點(diǎn)。因此，通過定量測定皮膚中羥脯氨酸含量可作為測定皮膚衰老程度的一項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)材料和儀器1)實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，體重28-30g，雌雄兼用。2)儀器UV-可見掃描儀。3)試劑羥脯氨酸(進(jìn)口分裝)；氯胺-T；對-二甲氨基苯甲醛；過氯酸；檸檬酸緩沖液，pH6試驗(yàn)制劑藻藍(lán)蛋白提取物2)樣品處理取上述精確稱重的試劑樣品置10ml具塞刻度試管中，加6NHCl2．0ml，混勻，密塞，置烘箱中于105℃酸解18小時，取出放至室溫后，加10NNaOH2．0ml(使pH6)，過濾，濾液加水稀釋至5．0ml，即為樣品溶液。3)測定步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線精確稱取干燥至恒重的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50．0mg，用0．01NHCl溶解并稀釋至100ml(1ml相當(dāng)于500μ)，此為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液2．0ml，加水稀釋至100ml(1ml相當(dāng)于10μ羥脯氨酸)，即為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。取10μg／ml標(biāo)準(zhǔn)液0、0．2、0．4、0．6、0．8及1．0ml，分別置10ml具塞刻度試管中，用水將各管體積調(diào)整至1．0ml，再各加入檸檬酸緩沖液1．0ml和氯氨-T液1．0ml，混勻，放置6分鐘，再向各管內(nèi)加入過氯酸液1．0ml，混勻，放置5分鐘，各管加入P-DMAB液1．0ml，混勻，75℃水浴放置10分鐘，迅速冷卻至室溫，并用水調(diào)整總體積為5．0ml。以第一管做空白對照，于562nm波長測定吸收度，以羥脯氨酸含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定精確量取樣品溶液200μl，至具塞刻度試管內(nèi)，加水至1．0ml后，按上述制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣操作方法，測定樣品溶液的吸收度，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中羥脯氨酸含量。由此可得到實(shí)驗(yàn)組和對照組動物皮膚中羥脯氨酸和膠原蛋白的百分含量(以膠原蛋白中羥脯氨酸含量為13％)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每毫克干皮膚中的羥脯氨酸的濃度表示于表1，表中所列數(shù)據(jù)均為用每組10只動物所測得的平均值。表1各組皮膚中羥脯氨酸含量注1．空白對照組即正常組；2．陰性對照組為只涂抹實(shí)驗(yàn)組的基質(zhì)，不含藥物成分；3．陽性對照組為涂抹SOD防曬霜；4．Phc實(shí)驗(yàn)組為涂抹試驗(yàn)試劑和基質(zhì)所制備的樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的羥脯氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組和陽性對照組，經(jīng)生物學(xué)統(tǒng)計(jì)具有非常明顯的差異。組織學(xué)觀察結(jié)果取空白對照組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組三組實(shí)驗(yàn)小鼠的背部皮膚各一小塊，制成石蠟連續(xù)切片，經(jīng)H．E．染色后進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果表明(1)實(shí)驗(yàn)組角化層比兩個對照組的角化層薄，尤其與空白對照組相比更為明顯。這說明藻藍(lán)蛋白提取物能促進(jìn)角質(zhì)降解使角質(zhì)化層變薄，并具有一定的延緩衰老的作用。(2)實(shí)驗(yàn)組表皮層細(xì)胞的體積明顯增大，細(xì)胞質(zhì)豐富，核內(nèi)染色質(zhì)粗而多，細(xì)胞育良好，細(xì)胞數(shù)量也有增加，并以生發(fā)層為主，這些都說明了細(xì)胞的代謝增殖狀況良好。(3)實(shí)驗(yàn)組的真皮層膠原纖維呈平行和相互交錯的排列，纖維細(xì)胞增多，說明膠原代謝更新的狀況良好，這對增強(qiáng)皮膚抵抗力和彈性有一定的作用。權(quán)利要求1．含藻藍(lán)蛋白提取物的抗病毒組合物，其中含有治療有效量的藻藍(lán)蛋白提取物和／或藥物學(xué)上可接受的載體，其中藻藍(lán)蛋白提取物是以下列步驟制得的a．將藍(lán)綠藻粉溶于5-20倍水中，低溫保持8-30小時，b．固液分離，將溶液的pH值調(diào)至酸性，放置，c．收集所得固體為藻藍(lán)蛋白粗品。2．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述藻粉選自螺旋藻粉。3．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中步驟a中水的用量為藻粉的8-15倍。4．根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中步驟a中水的用量為藻粉的10倍。5．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中步驟b中溶液的pH值調(diào)節(jié)至3．8-4．2。6．藻藍(lán)蛋白提取物的制備方法，其中包括步驟a．將藍(lán)綠藻粉溶于5-20倍水中，低溫保持8-30小時，b．固液分離，將溶液的pH值調(diào)至酸性，放置，c．收集所得固體為藻藍(lán)蛋白粗品。7．根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中藻粉選自螺旋藻粉。8．根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中步驟a中水的用量為藻粉的8-15倍。9．根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中步驟a中水的用量為藻粉的10倍。10．根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中步驟b中溶液的pH值調(diào)節(jié)至3．8-4．2。全文摘要本發(fā)明提供了含藻藍(lán)蛋白提取物的抗病毒組合物以及提取藻藍(lán)蛋白的方法。文檔編號A61P31/00GK1281727SQ9911083公開日2001年1月31日申請日期1999年7月22日優(yōu)先權(quán)日1999年7月22日發(fā)明者劉兆乾,丁健,郭振泉,齊清申請人:齊清