雙酶法制備甜菊單糖苷的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然化合物的生物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及利用常見(jiàn)的糖巧酶一步法 直接催化制備甜菊單糖巧的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 從甜葉菊葉子中提取的甜菊糖巧不僅是一類高甜度低熱值的天然甜味劑，而且甜 菊糖巧還具有多種藥理活性。新版甜菊糖巧國(guó)標(biāo)（GB8270-2014)指出，甜菊糖巧包括甜菊 巧（Stevioside，Stv)、瑞鮑迪巧ACrebaudioside A，Reb A)、瑞鮑迪巧B(rebaudioside B， Reb B)、瑞鮑迪巧CCrebaudioside C，Reb C)、瑞鮑迪巧DCrebaudioside D，Reb D)、瑞鮑迪 巧F(rebaudioside F，Reb F)、杜克巧A(dulcoside A)、甜茶巧（rubusoside，Ru)、甜菊雙 糖巧（stevio化ioside，訊io)等九種糖巧。運(yùn)些糖巧可W直接應(yīng)用，也可W進(jìn)一步衍生化， 得到更多自然界中鮮有并且具有特殊功能性的糖巧。如對(duì)其中含量最高的甜菊巧Stv進(jìn) 行糖基化可W提高溶解性，降低后苦澀味；又如本發(fā)明人已公開(kāi)一種用來(lái)源于Sulfolobus sp.的β-葡萄糖巧酶催化制備甜菊醇的方法（專利號(hào)：201210352461. 6)，可W-步法得 到高純度甜菊醇；再如酸性水解Stv得到異甜菊醇，然后對(duì)其進(jìn)行修飾，可W得到具有特定 藥理活性的衍生物。
[0003] 甜菊單糖巧（steviolmonoside，Sm，CAS:60129-60-4)是一種在自然界中鮮有的 甜菊糖巧，甜茶葉子（RubussuavissimusS.Lee)醇沉可W得到少量Sm化ohGarYee等， 2009)。水解Stv，RebA等過(guò)程中產(chǎn)生也會(huì)產(chǎn)生Sm，但會(huì)進(jìn)一步水解生成甜菊醇或異甜菊 醇（deOliveiraBΗ等，2007)，因而控制反應(yīng)停在甜菊單糖巧Sm運(yùn)一步，需要較高的反應(yīng) 選擇性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便的方式制備高純度甜菊單糖巧。本發(fā)明選用兩種比 較常見(jiàn)的糖巧酶，一步法催化水解甜菊巧stv制備甜菊單糖巧，具體反應(yīng)方程式如下： 陽(yáng)0化]
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0007] 將甜菊糖巧配制成lOmg/mL到250mg/mL的水溶液，然后在37°C-45°c下恒溫?cái)埌?0. 5h，反應(yīng)的抑值始終控制在7左右。按照順序分別加入一定量?jī)煞N糖巧酶，加入第二種 酶時(shí)反應(yīng)升溫至55°C-75°C，總反應(yīng)lh-24h;過(guò)濾，洗涂，重結(jié)晶即可得甜菊單糖巧。加入兩 種糖巧酶的順序?yàn)?，先為?lái)源于酵母的β-葡萄糖巧酶，然后再加入來(lái)源于黑曲霉的β-葡 萄糖巧酶，時(shí)間間隔為化-12h，加入的比例為1:5。
[0008] 本發(fā)明的有益效果：
[0009] 利用常見(jiàn)的糖巧酶催化甜菊巧stv制備甜菊單糖巧，本發(fā)明具有廉價(jià)，簡(jiǎn)單，高 效，產(chǎn)物純度高，分離容易等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1甜菊單糖巧的離子流圖（a:總離子流圖；b:479. 3選擇性離子流圖） W11] 圖2甜菊單糖巧的質(zhì)譜圖（479. 3, [M,m-田；965. 6,巧Μ,m-田；）
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，其目的僅在于更好的說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容 但并不W任何方式限制本發(fā)明。 陽(yáng)〇1引實(shí)施例1
[0014] 配制甜菊巧溶液50血，濃度為lOmg/mU然后在37°C下恒溫?cái)埌?.化，反應(yīng)的抑 值始終控制在7左右。先按照800U/gStv加入來(lái)源于酵母的β-葡萄糖巧酶，反應(yīng)化；再 加入來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶2000U/gStv，加入第二種酶時(shí)反應(yīng)升溫至55°C，再 反應(yīng)12h;過(guò)濾后用純水洗涂Ξ次，水/甲醇/異丙醇溶液中重結(jié)晶即可得高甜菊單糖巧。 冊(cè)1(：分析5切的轉(zhuǎn)化率為95.0%，5111的產(chǎn)率和純度分別為85.4%和96.0%。 陽(yáng)〇1引實(shí)施例2
[0016] 配制甜菊巧溶液50血，濃度為250mg/mU然后在45°C下恒溫?cái)埌?.化，反應(yīng)的抑 值始終控制在7左右。先按照1500U/gStv加入來(lái)源于酵母的β-葡萄糖巧酶，反應(yīng)12h; 再加入來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶3000U/gStv，加入第二種酶時(shí)反應(yīng)升溫至75°C， 再反應(yīng)化；過(guò)濾后用純水洗涂Ξ次，水/甲醇/異丙醇溶液中重結(jié)晶即可得高甜菊單糖巧。 HPLC分析Stv的轉(zhuǎn)化率為90. 5%，Sm的產(chǎn)率和純度分別為88. 5%和95. 0%。
[0017] 實(shí)施例3
[00化]用甜葉菊提取物配制甜菊巧溶液100血，stv含量為lOOmg/mU然后在40°C下恒溫 攬拌0.化，反應(yīng)的抑值始終控制在7左右。先按照500U/gStv加入來(lái)源于酵母的β-葡 萄糖巧酶，反應(yīng)1她；再加入來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶1500U/gStv,加入第二種酶時(shí) 反應(yīng)升溫至75°C，再反應(yīng)化；過(guò)濾后用純水洗涂Ξ次，水/甲醇/異丙醇溶液中重結(jié)晶即 可得高甜菊單糖巧。HPLC分析Stv的轉(zhuǎn)化率為83. 5%，Sm的產(chǎn)率和純度分別為75. 0%和 90. 8%。
[0019] 實(shí)施例4
[0020] 配制甜菊巧溶液化，濃度為250mg/mU然后在45°C下恒溫?cái)埌?.化，反應(yīng)的抑值 始終控制在7左右。先按照3000U/gStv加入來(lái)源于酵母的β-葡萄糖巧酶，反應(yīng)12h;再 加入來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶3000U/gStv,加入第二種酶時(shí)反應(yīng)升溫至75°C，再 反應(yīng)12h;過(guò)濾后用純水洗涂Ξ次，水/甲醇/異丙醇溶液中重結(jié)晶即可得高甜菊單糖巧。 HPLC分析Stv的轉(zhuǎn)化率為98%，Sm的產(chǎn)率和純度分別為92. 5%和96. 0%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備甜菊單糖苷的方法，其特征在于將甜菊糖苷配制成lOmg/mL到250mg/mL 的水溶液，然后在37°C_75°C下恒溫?cái)嚢?. 5h，按照順序分別加入一定量?jī)煞N糖苷酶，反應(yīng) lh-24h;過(guò)濾，洗滌，重結(jié)晶即可得甜菊單糖苷。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備甜菊單糖苷的方法，其特征是所述的甜菊糖苷為甜 菊苷或是含有甜菊苷的甜葉菊提取物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備甜菊單糖苷的方法，其特征是所述的加入兩種糖苷 酶的順序?yàn)?，先為?lái)源于酵母的β-葡萄糖苷酶，然后再加入來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖苷 酶，時(shí)間間隔為6h-12h，加入的比例為1:5。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備甜菊單糖苷的方法，其特征是所述的溫度為先保持 在37°C-45°C，然后加入第二種糖苷酶后再控制在55°C-75°C，反應(yīng)的pH值始終控制在7 左右。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種制備甜菊單糖苷的方法。屬于天然化合物的合成技術(shù)領(lǐng)域。以常見(jiàn)的糖苷酶為催化劑，一步法催化甜菊糖苷水解制備單糖苷。該種方法具有方法簡(jiǎn)單、選擇性和轉(zhuǎn)化率高、成本低廉、分離提純簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種高效、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的新方法以制備甜菊單糖苷。
【IPC分類】C12P19/56
【公開(kāi)號(hào)】CN105255971
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510707477
【發(fā)明人】萬(wàn)會(huì)達(dá), 李丹, 夏詠梅, 覃曉雨, 郝家軍, 樊健, 謝杰靈, 田加騰
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月27日