專利名稱：一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1的基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜味劑是食品工業(yè)中最廣泛的添加劑，按其來源分為天然甜味劑和人工合成甜味齊U。在天然甜味劑中，應(yīng)用最多的是蔗糖，但蔗糖是一種高熱量的甜味劑，攝入過多會導(dǎo)致人體肥胖、糖尿病、齲齒等疾病的發(fā)牛[1’2’3’4]。人工合成的甜味劑，如甜精(dulin，對-乙氧基苯脲)、環(huán)己氨基磺酸鹽(cyclamata)，雖然可以使人們對甜味得到滿足，但相繼被發(fā)現(xiàn)有毒副作用而被禁用；糖精(saccharin，鄰磺酰苯甲酰亞胺)，也因被報(bào)道有致癌作用而可能被限制使用。尋找無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜味劑一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)。甜葉菊(Stevia rebaudiana bertoni)，又名甜菊、糖草，是原產(chǎn)于南美巴拉圭等地的一種野生菊科草本植物，它是目前已知甜度較高的糖料植物之一 [5]。甜菊糖(Steviol glycosides)是從甜葉菊的葉、莖中提取出的一種新型天然甜味劑。它具有高甜度、低熱能的特點(diǎn)，其甜度是蔗糖的150 300倍，熱值僅為蔗糖的1/300[6]。經(jīng)大量藥物實(shí)驗(yàn)證明，甜菊糖無毒副作用，無致癌物，食用安全，經(jīng)常食用可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥[7’8’9]，是一種可替代蔗糖非常理想的甜味劑。甜菊糖可廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業(yè)[11]，并且較應(yīng)用蔗糖可節(jié)省成本60%。甜菊糖是目前世界已發(fā)現(xiàn)并經(jīng)我國衛(wèi)生部、輕工業(yè)部批準(zhǔn)使用的最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑_。 是繼苷蔗、甜菜糖之外第三種有開發(fā)價(jià)值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽(yù)為“世界第三糖源”。甜菊葉中三種最主要的糖甙成分在葉片中的含量通常為甜菊甙(stevioside， stevioside)占葉片干重 9· 1 %,萊鮑迪試 A (rebaudioside A, rebaudioside A 試)占 3. 8%，萊鮑迪甙C(rebaudioside C，RC甙)占 0. 6% [12]。市售甜菊糖一般以 stevioside 為主要成分，該組分甜度為蔗糖的200倍左右，其后味略帶甘苦味。而作為甜菊糖的第二主成分，rebaudioside A甙甜度為蔗糖400倍，口味純正，沒有后苦味。因此，提高rebaudioside A甙相對含量是提高甜菊糖品質(zhì)的關(guān)鍵步驟。目前文獻(xiàn)報(bào)道提高rebaudioside A甙相對含量的策略有(1)培育rebaudioside A甙高含量的甜菊品種，國內(nèi)已經(jīng)嘗試成功通過嫁接方法，獲得rebaudioside A甙含量超過40%品種，但該品種不具備普適性，且品種容易退化，不適宜大面積種植[11];(幻通過純化提高rebaudioside A 與stevioside的比 列，此法由于天然植物中rebaudioside A 甙含量低于stevioside，且二者物理性質(zhì)極為相近，使得純化工藝難度很大，得率較低。這兩種方法的高成本造成目前市場上高rebaudioside A甙含量的甜菊糖價(jià)格很高，含80 % rebaudioside A甙的甜菊糖市價(jià)比一般混合型甜菊糖要高出4 5倍。另有報(bào)道，可以利用環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶修飾法改進(jìn)甜菊糖的口感和味質(zhì)，但是該法嚴(yán)重降低甜度，因此也不是最佳的解決方案?？傊壳耙延械姆椒ǘ疾贿m宜推廣。因此，尋求高效的生物酶法轉(zhuǎn)化途徑已經(jīng)成為提高rebaudioside A甙相對含量的必然趨勢。糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1作為植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一員，可以特異性的催化甜葉菊中的stevioside，生成rebaudioside A甙，因此有著重要的研究價(jià)值。Richman等從甜葉菊的EST中分離了 3種UGTs基因[13]，UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1。體外活性分析表明， UGT85C2催化甜菊醇到甜菊單甙(steviolmonoside)的反應(yīng)，UGT74G1主要催化甜菊雙甙 (steviolbioside)的糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生 stevioside。而 stevioside 至Ij rebaudiosideA 試由UGT76G1 —步糖基化反應(yīng)完成，見圖1。Humphrey等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了此過程[14]。UGT76G1 全稱為 UDP-glycosyltrebaudioside Ansferebaudioside Ase 76G1，其編碼基因(Genbank code :AY345974)全長1616bp，開放讀碼框長度為1374bp，編碼458個(gè)氨基酸。有關(guān)UGT76G1的相關(guān)研究報(bào)道非常少，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶76G1 (UGT76G1)作為糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一員，可以選擇性催化stevioside生成rebaudioside A甙，在甜菊糖生產(chǎn)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本專利首要目的是采用基因工程手段，將UGT76G1在Saccharomyces cerevisiae中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，并該酶的催化特性進(jìn)行研究。其次，考慮到Mccharomyces cerevisiae表達(dá)系統(tǒng)與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，其適度的糖基化修飾過程更適合植物蛋白的表達(dá)[15_18]；此外UGT76G1在催化反應(yīng)時(shí)需要加入U(xiǎn)DPG 作為糖供體，而Mccharomyces cerevisiae系統(tǒng)可能會比大腸桿菌系統(tǒng)提供更多的天然糖供體而減少催化成本?；谝陨峡紤]，將UGT76G1在&iccharomyces cerevisiae系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，可以為利用重組菌進(jìn)行全細(xì)胞催化stevioside生成rebaudioside A甙的工藝奠定基石出。UDPG是一種重要的核苷二磷酸單糖，1950年由Leloir和他的同事在研究半乳糖向葡萄糖轉(zhuǎn)化過程中首次發(fā)現(xiàn)[19]。UDPG是高等植物中活化糖的主要形式，作為葡萄糖基供體參與蔗糖、纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)以及糖脂、糖蛋白的合成代謝。UDPG還是合成其他核苷二磷酸單糖，如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖酸、尿苷二磷酸木糖等的前體。尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成過程如圖2所示。參考文獻(xiàn)[1]舒進(jìn)珍等，中國甜菊栽培及應(yīng)用技術(shù)[M]，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1989年， 98 107.[2]徐任生主編，天然產(chǎn)物化學(xué)[M]，北京科學(xué)出版社，2004年，351 377.[3] Lombardo YB, Drebaudioside Ago S，Chicco A，et al. Long-term administrebaudioside Ation of a sucrose-rich diet to normal rebaudioside Ats relationship between metabolic and hormonal profiles and morphological changes in the endocrine pancreas[J] · Metabolism，1996，245 :1527 1532·[4]Ten S,and Maclaren N. Insulin resistance syndrome in children[J]. Clin Endocrinol Metab，2004，89 :2526 2539.[5]Kovylyaeva GI, Bakaleinik GA, Strobykina IYu, et al. Glycosides from Stevia rebaudiana[J]. Chemistry of Naturebaudioside Al Compounds,2007，43 (1) 81 85.[6]陳慕英，于喜水孫玉華，等.中醫(yī)藥信息[J]· 2001，18(3) :23.[7]JanM C · Geuns · Phytochemistry[M]，2003，64 :913 ·
[8]Carebaudioside Akostas MC, Curry LL, Boileau AC，et al. Overview :the history,technical function and safety of rebaudioside A，a naturebaudioside Ally occurring steviol glycoside, for use in food and beverebaudioside Ages[J]. Food Chem Toxicol,2008,46 Suppl 7 :S1 S10.[9]Shibata H，et al. Glucosylation of steviol and steviol-glucosides in extrebaudioside Acts from Stevia rebaudiana Bertoni[J]. Plant Physiol，1991， 95(1) 152 156.[10]Shibata H， et al.Steviol and steviol-glycosideglucosyltrebaudiosi de Ansferebaudioside Ase activities in Stevia rebaudiana Bertoni—purification and partial charebaudioside Acterization[J]. Arch Biochem Biophys，1995，321 (2) 390 396.[11]Humphrey TViRichman ASiMenassa R，et al. Spatial organisation of four enzymes from Stevia rebaudiana that are involved in steviol glycoside[J]. Plant Mol.Biol，2006，61 :47 62[12]Brebaudioside Andle JE, et al. Steviol glycoside biosynthesis[J]. Phytoehemistry,2007,68(14) :1855 1863.[13]黃應(yīng)森.中國甜菊和甜菊糖甙的分型研究[J].中國糖料，1999，4:26 四..[14]Chatsudthipong V，and Muanprebaudioside Asat C. Stevioside and related compounds :therebaudioside Apeutic benefits beyond sweetness. Pharmacol Ther，2009，121 :41 54.[15]Hilario E，Lataro RC, Alegria MC, et al. High level production of functional muscle alpha tropomyosin in Pichia pastoris [J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,284(4) :955 60.[16]Zani M，Brillard Bourdet M，Lazure C，et al. Purification and charebaudioside Acterization of active recombinant rebaudioside At kallikrein rK9[J]. Biochim Biophys Acta，2001，1547(2) :387 396.[17]Guo RT, Chou LJ, Chen YC, et al. Expression in Pichia pastoris and charebaudioside Acterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[J]. Proteins,2001,43(4) :499 508.[18] Rydberg EH, Sidhu G，Vo HC, et al. Cloning, mutagenesis，and structurebaudioside Al analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[J]. Protein Sci，1999，8 (3) :635 643.[19]Caputto R，Leloir LF, Cardini CE, et al. Isolation of the coenzyme of the galactose phosphate—glucosephosphate trebaudioside Ansformation· J Bio Chem，1950，184 :333-350

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一株能夠表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的工程菌。
本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供上述工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供上述工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方法。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供上述工程菌的應(yīng)用。一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的基因工程菌，它是將UGT76G1編碼基因插入 PYes2載體的EcoRI和BioI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；其中，所述的UGT76G1編碼基因?yàn)镚enBank，No. GenBank :AY345974. 1，該基因序列命名為UGT。上述基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟1)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Ml I雙酶切UGT基因片段和PYes2載體，連接UGT 基因片段純化產(chǎn)物與載體，得到重組質(zhì)粒PYes2-UGT ；2)將重組質(zhì)粒PYes2_UGT轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌 DH5 α -Phs2_UGT，選取陽性克?。?)將鑒定后的陽性克隆的質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母&iccharomyces cerevisiaeYPH499 中，得到基因工程菌YPH499-Pks2-UGT。上述基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方法，以半乳糖為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因工程菌產(chǎn)酶。上述基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方法，具體來說，將基因工程菌按2 5 (ν/ν) %接種量接種到碳源為20g/L葡萄糖的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 16h，然后收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移到碳源為20g/L半乳糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為48 60h ；所述的碳源為20g/L葡萄糖的培養(yǎng)基配方為6. 7g/L YNB, 20g/L葡萄糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸， 0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L 組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/ L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸；所述的碳源為20g/L半乳糖的培養(yǎng)基配方為 6. 7g/L YNB, 20g/L半乳糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸， 0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸， 0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。上述基因工程菌在生產(chǎn)萊鮑迪甙A中的應(yīng)用。即利用全細(xì)胞催化法，將甜菊甙轉(zhuǎn)化為萊鮑迪甙A。具體來說，是以誘導(dǎo)表達(dá)后的基因工程菌為全細(xì)胞催化劑，通過加入表面活性劑改變細(xì)胞的通透性，以甜菊甙和葡萄糖為底物，添加鎂離子以及調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，反應(yīng)得到萊鮑迪甙A。基因工程菌的用量按濕菌體計(jì)為2g/L ；甜菊甙的用量為lg/L ；葡萄糖的用量為 20g/L;所述的表面活性劑為普郎尼克F-68，用量為1 10g/L，優(yōu)選2g/L;鎂離子使用 MgCl2,用量為1 10g/L，優(yōu)選6g/L。所述的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)分別有UMP、丁二酸、乳清酸或檸檬酸，UMP用量為0. 5 3g/ L，優(yōu)選1. 5g/L ；丁二酸用量為5 10g/L，優(yōu)選9g/L ；乳清酸用量為為1 5g/L，優(yōu)選2g/ L ；檸檬酸用量為10 20g/L，優(yōu)選15g/L。所述的反應(yīng)在磷酸鉀緩沖液體系中完成，反應(yīng)pH6. 8 7. 8，優(yōu)選7. 2，反應(yīng)溫度 25 42°C，優(yōu)選37 °C，反應(yīng)時(shí)間12 96h，優(yōu)選72h。
有益效果本發(fā)明在不外加昂貴UDPG的情況下，以廉價(jià)碳源葡萄糖為底物，調(diào)節(jié)酵母體內(nèi)UDPG的代謝途徑，全細(xì)胞催化M甙生成rebaudioside A。其中，添加UMP，最高達(dá)到115mg/L ；添加丁二酸，最高達(dá)到180mg/L ；添加乳清酸，最高達(dá)到270mg/L ；添加檸檬酸，rebaudioside A產(chǎn)量最高達(dá)到675mg/L ；說明添加檸檬酸等物質(zhì)能夠有效促進(jìn)酵母體內(nèi)UDPG的合成。另外，在添加檸檬酸的前提下，研究催化反應(yīng)體系的PH值、反應(yīng)溫度以及時(shí)間，最終獲得最佳反應(yīng)調(diào)節(jié)為PH7. 2、反應(yīng)溫度37°C、反應(yīng)時(shí)間72h，此條件下rebaudioside A產(chǎn)量高達(dá)875mg/L。


圖1糖基轉(zhuǎn)移酶催化甜菊醇生成rebaudioside A甙的途徑。圖2酵母體內(nèi)的UDP-葡萄糖合成代謝途徑。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 重組酵母菌的構(gòu)建。1、糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因的獲取根據(jù)AY345974. 1基因序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列命名為UGT由南京金思瑞公司完成基因合成。根據(jù)UGT基因序列設(shè)計(jì)引物上游引物(-sense含 EcoRI)為5 ‘ -CGGAATTCAAACAATGTCTGAAAATAAGACTGAAACTACTG-3‘下游游引物(-sense含XhoI)為5 ‘ -CCGCTCGAGTTATAATGATGAAATATAAGAAACCAA-3‘所有引物由上海申能博彩公司合成?；虻腜CR條件(50 μ L體系)94°C 變性 5min ；按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性30S，60°C退火30s，72°C延伸^iiin ；最后72°C延伸 lOmin。2、重組工程菌 YPH499-PYes2_UGT 獲得以合成的帶有UGT基因的質(zhì)粒為模板，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將UGT基因片段純化產(chǎn)物和PMD18-T Vector載體雙酶切膠回收產(chǎn)物，用T4連接酶16°C進(jìn)行UGT片段純化產(chǎn)物與PMD18-T Vector的連接，將IOul的連接物產(chǎn)物PMD18-T-UGT熱擊轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化物涂布于含有含lOOug/mlAp的平板上，37°C培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆。獲得正確序列的克隆載體PMD18-T-UGT。分別用EcoRI和BioI雙酶切克隆載體PMD18-T-UGT和PYes2。膠回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出表達(dá)載體PYes2-UGT。將鑒定后正確的陽性克隆載體PYes2-UGT與 Saccharomyces cerevisiae YPH499感受態(tài)混勻，電擊法轉(zhuǎn)化完畢后，加入ImL冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，將菌體懸液涂布于SC-U篩選培養(yǎng)基平板上至于30°C培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。
液體培養(yǎng)基的配方如下
完全培養(yǎng)基YPD :10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。
選擇培養(yǎng)基SC-U 6. 7g/L YNB，20g/L碳源(葡萄糖)，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/ L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸， 0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸，20g/L瓊脂(平板)。
實(shí)施例2 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)。
挑取重組工程菌的單菌落到SC-U培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量接種到碳源為葡萄糖(終濃度為20g/L)的新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)他，此部分為生物量的積累。然后再無菌環(huán)境中，集菌棄上清，洗菌并將菌體轉(zhuǎn)移到碳源為半乳糖(終濃度為20g/L) 的新鮮的篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)間為48h。菌液于6000rpm，4°C離心lOmin，棄上清。
其中，碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基配方為6.7g/L YNB，20g/L葡萄糖，0. lg/L腺嘌呤， 0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。
其中，碳源為半乳糖的培養(yǎng)基配方為6.7g/L YNB，20g/L半乳糖，0. lg/L腺嘌呤， 0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。
實(shí)施例3 酶活測定方法的確立。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀，菌體20mg，用磷酸鉀緩沖液(ρΗ7. 0)洗滌兩次，洗滌后的沉淀置液氮中研磨破碎，并用磷酸鉀緩沖液(PH7. 0)洗出，破碎后的菌液于12000rpm， 4°C離心15min。取上清即為粗酶液。精密稱取樣品，配制成1. 4ml體系，其中stevioside的終濃度為lg/L、UDP-葡萄糖為lg/L，并加入2g/L Mgcl2 ； 10mg/L BSA混勻，最后加入400 μ 1 粗酶液并加入磷酸鉀緩沖液(ΡΗ7.0)至體系為1.細(xì)1，起始反應(yīng)。30°C保溫1 后，高溫煮沸終止反應(yīng)。離心，取上清作為樣品。HPLC方法檢測反應(yīng)體系中rebaudiosideA甙含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rebaudioside A的產(chǎn)量最高可到達(dá)到750mg/L，說明該重組工程菌能夠表達(dá)產(chǎn)酶并且該酶能夠催化stevioside生成rebaudioside A。
HPLC法色譜分析條件如下
色譜柱LichrospherNH2 柱 Q50mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相為乙睛水 (80 20 ；V V)；流速=ImL · mirT1 ；柱溫:40°C ；檢測波長210nm。
實(shí)施例4 建立全細(xì)胞催化反應(yīng)體系。
取實(shí)施例2中的沉淀轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，建立全細(xì)胞催化反應(yīng)體系。此反應(yīng)體系為10ml，其中菌體20mg。底物stevioside lg/L ；20g/L的葡萄糖；MgCl2 4g/L ；通透劑普郎尼克F-685g/L ；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)節(jié)為7. 0，200rpm, 30°C，反應(yīng)4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。通過加入葡萄糖，以此利用酵母代謝途徑產(chǎn)生UDPG作為輔底物的方法，使得rebaudioside A的產(chǎn)量可到達(dá)到60mg/L。
實(shí)施例5 最佳MgCl2濃度。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L，Mgcl2，通透劑普郎尼克F-68 5g/L，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7.0。按上述方法，取六份平行樣，加入的MgCl2濃度分別為 lg/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L, 30°C，200rpm,反應(yīng) 48h 后，取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中MgCl2為10g/L時(shí)，rebaudioside A產(chǎn)量最低為20mg/ L ；MgCl2 為 lg/L 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量為 45mg/L ；MgCl2 為 6g/L 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量最高為82mg/L。
實(shí)施例5 最佳普郎尼克F-68濃度。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L,Mgcl2 6g/L，通透劑普郎尼克F-68，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7.0。按上述方法，取四份平行樣，加入的普郎尼克F-68 濃度分別為化/1、58/1、1(^/1、158/1，301，200印111，反應(yīng)4811后，取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中普郎尼克F-68為lg/L時(shí)rebaudioside A產(chǎn)量最低為 48mg/L ；普郎尼克F-68為15g/L時(shí)，rebaudioside A的產(chǎn)量為65mg/L ；普郎尼克F-68為 10g/L 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量最高為 90mg/L。
實(shí)施例5 加入代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)UMP。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入U(xiǎn)MP，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7. 0。取三份平行樣，加入的 UMP濃度分別為0. 5g/L、l. 5g/L、3g/L，30°C，200rpm，反應(yīng)48h后，取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中UMP為0. 5g/L時(shí)，rebaudioside A產(chǎn)量最低為56mg/L ； UMP 為 3g/L 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量為 91mg/L ；UMP 為 1. 5g/L 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量最高為115mg/L。
實(shí)施例6 加入代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)丁二酸。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入5. 4g/L NaOH，丁二酸，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7. 0。取六份平行樣，加入的丁二酸濃度分別為 5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L，30°C，200rpm，S 應(yīng)4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中丁二酸為5g/L時(shí)， rebaudioside A產(chǎn)量最低為 105mg/L ；丁二酸為 10g/L時(shí)，rebaudioside A的產(chǎn)量為 175mg/ L ；丁二酸為 9g/L 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量最高為 180mg/L。
實(shí)施例7 加入代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)乳清酸。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中， 加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克F_68 10g/L，并加入乳清酸；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7.0。取五份平行樣，加入的乳清酸濃度分別為lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，30°C，200rpm，反應(yīng)48h后，取樣品離心， 將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中乳清酸為5g/L時(shí)，rebaudioside A產(chǎn)量最低為80mg/L ；乳清酸為lg/L時(shí)，rebaudioside A的產(chǎn)量為203mg/L ；乳清酸為2g/L時(shí)，rebaudioside A 白勺/^ ! 270mg/L。
實(shí)施例8 加入代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)檸檬酸。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L，MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入檸檬酸；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7. O。取五份平行樣，加入的檸檬酸濃度分別為10g/L、12g/L、15g/L、18g/L、20g/L，30 °C，200rpm,反應(yīng)4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中檸檬酸為10g/L時(shí)，rebaudioside A產(chǎn)量最低為45%ig/L ；檸檬酸為20g/L時(shí)，rebaudioside A的產(chǎn)量為625mg/L ；檸檬酸為15g/ L rebaudioside A 白勺/^ ! 675mg/L。
實(shí)施例9:最佳反應(yīng)PH。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入檸檬酸15g/L，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，按上述方法共做五個(gè)平行樣，其中PH分別調(diào)至6. 8、7. 0、7. 2、7. 5、7. 8。于30°C，200rpm進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)48h后， 取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中pH為7. 8時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量最低，為306mg/L ；pH為6. 8時(shí)，rebaudioside A的產(chǎn)量為698mg/L ；pH為7. 2時(shí)， rebaudioside A的產(chǎn)量達(dá)到最高，為705mg/L。
實(shí)施例10 最佳反應(yīng)溫度。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, Mgcl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入檸檬酸15g/L ；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7. 2。按上述方法取五份平行樣分別于不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)，251、301、371、421，200印111，反應(yīng)4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中25°C時(shí)，rebaudiosideA的產(chǎn)量最低為 78mg/L ；42°C時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量為 750mg/L ；37°C時(shí)，rebaudiosideA 的產(chǎn)量達(dá)到最高，為835mg/L。
實(shí)施例11 最佳反應(yīng)時(shí)間。
取實(shí)施例2中的菌體沉淀20mg，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, Mgcl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L,并加入檸檬酸15g/L ；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調(diào)至7. 2。于37°C， 200rpm進(jìn)行催化反應(yīng)，分別于反應(yīng)12h、Mh、36h、48h、60h、72h、84h、96取樣，樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中在1 時(shí)，rebaudioside A產(chǎn)量最低，為178mg/ L ；48h 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量為 867mg/L ；72h 時(shí)，rebaudioside A 的產(chǎn)量達(dá)到最高，為 875mg/L。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的基因工程菌，其特征在于它是將UGT76G1編碼基因插入Phs2載體的EcoRI和BioI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；其中，所述的UGT76G1編碼基因?yàn)镚enBank，No. GenBank :AY345974. 1，該基因序列命名為 UGT。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Ml I雙酶切UGT基因片段和PYes2載體，連接UGT基因片段純化產(chǎn)物與載體，得到重組質(zhì)粒PYes2-UGT ；2)將重組質(zhì)粒PYes2_UGT轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌 DH5 α -Phs2_UGT，選取陽性克隆；3)將鑒定后的陽性克隆的質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母&iccharomycescerevisiaeYPH499中， 得到基因工程菌YPH499-Phs2-UGT。
3.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于，以半乳糖為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因工程菌產(chǎn)酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于，將基因工程菌按 2 5%接種量接種到碳源為20g/L葡萄糖的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 16h，然后收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移到碳源為20g/L半乳糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為48 60h ；所述的碳源為20g/ L葡萄糖的培養(yǎng)基配方為6. 7g/L YNB，20g/L葡萄糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. Ig/ L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸；所述的碳源為20g/L半乳糖的培養(yǎng)基配方為6. 7g/L YNB, 20g/L半乳糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸， 0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L 組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L 絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。
5.權(quán)利要求1所述的基因工程菌在生產(chǎn)萊鮑迪甙A中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，利用全細(xì)胞催化法，將甜菊甙轉(zhuǎn)化為萊鮑迪甙A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，以誘導(dǎo)表達(dá)后的基因工程菌為全細(xì)胞催化劑，通過加入表面活性劑改變細(xì)胞的通透性，以甜菊甙和葡萄糖為底物，添加鎂離子以及調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，反應(yīng)得到萊鮑迪甙A。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，基因工程菌的用量按濕菌體計(jì)為2g/L； 葡萄糖的用量為20g/L ；甜菊甙的用量為lg/L ；所述的表面活性劑為普郎尼克F-68，用量為 1 10g/L ；鎂離子使用MgCl2,用量為1 10g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)為UMP、丁二酸、乳清酸或檸檬酸，UMP用量為0. 5 3g/L，丁二酸用量為5 10g/L，乳清酸用量為1 5g/L，檸檬酸用量為10 20g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的反應(yīng)在磷酸鉀緩沖液體系中完成，反應(yīng)pH6. 8 7. 8，反應(yīng)溫度25 42°C，反應(yīng)時(shí)間1 96h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的基因工程菌，它是將UGT76G1編碼基因插入PYes2載體的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；其中，所述的UGT76G1編碼基因?yàn)镚enBank，No.GenBankAY345974.1，該基因序列命名為UGT。本發(fā)明還公開了上述基因工程菌的構(gòu)建方法及在生產(chǎn)萊鮑迪甙A中的應(yīng)用。本發(fā)明在不外加昂貴UDPG的情況下，以廉價(jià)碳源葡萄糖為底物，調(diào)節(jié)酵母體內(nèi)UDPG的代謝途徑，全細(xì)胞催化St甙生成rebaudioside A。
文檔編號C12R1/865GK102559528SQ201210029158
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者嚴(yán)明, 劉歡, 安明東, 安芳芳, 李艷, 王珊珊, 許昇, 許琳, 郝寧, 郝思清, 顧金海, 魏淼 申請人:南京工業(yè)大學(xué)