一種編碼l-丙氨酸氧化酶的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼L-丙氨酸氧化酶的基因及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸之一，是血液中氮的優(yōu)良運(yùn)輸工具，也是 一種有效的生糖氨基酸。D-丙氨酸主要由體內(nèi)的L-丙氨酸消旋或從食物中直接攝取而 得。自然環(huán)境中的其它生物，如植物、昆蟲、脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物等，也檢測發(fā)現(xiàn)D-丙氨 酸。對鳥類和哺乳動(dòng)物而言，丙氨酸是非必需氨基酸，可由食物中的糖降解為丙酮酸后轉(zhuǎn)化 而得。丙氨酸依照其分子結(jié)構(gòu)的手性和旋光性，可分為L-丙氨酸（左旋物質(zhì)）、D-丙氨酸 (右旋物質(zhì)）和DL-丙氨酸（消旋物質(zhì)）。D-丙氨酸在自然界中廣泛存在。在人體組織和 體液中有游離的D-丙氨酸，人腦的灰質(zhì)和白質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)，在各類肽、蛋白質(zhì)中還有大量 結(jié)合物。
[0003] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，D-丙氨酸有可預(yù)防腎結(jié)石、協(xié)助葡萄糖代謝，緩和低血糖等生理功能。 用作營養(yǎng)增補(bǔ)劑，可高效調(diào)節(jié)營養(yǎng)平衡。D-丙氨酸是一種重要的有機(jī)手性源，可用作手性 藥物、手性添加劑、手性助劑等，廣泛應(yīng)用于制藥及食品行業(yè)。D-丙氨酸作為一種有光學(xué)活 性的有機(jī)酸，在某些手性化合物不對稱合成過程中的作用不可替代的，如用作生產(chǎn)新型廣 譜抗生素、D-丙氨醇、多肽合成過程的丙氨酸保護(hù)劑。D-丙氨酸還具有一定的免疫抑制活 性，也可抑制某些植物的生長。
[0004]目前D-氨基酸的制備方法主要有化學(xué)合成法、對映體拆分法、以及生物合成法。 化學(xué)合成法主要是通過化學(xué)的方法直接合成D-丙氨酸，但是這個(gè)方法復(fù)雜，產(chǎn)物純度低， 不利于大規(guī)模生產(chǎn)。對映體拆分法主要是通過各種方法如色譜柱，離子交換樹脂等方法對 DL-丙氨酸直接進(jìn)行拆分，但是該方法成本太高，產(chǎn)量低，不適合大規(guī)模生產(chǎn)?，F(xiàn)有的生產(chǎn) D-丙氨酸的一些方法，由于收率較低、拆分劑價(jià)格昂貴、成本偏高等原因，導(dǎo)致D-丙氨酸售 價(jià)過高，應(yīng)用受限。
[0005] 無論采用何種方法制備D-丙氨酸，都有工藝流程長、步驟多、副產(chǎn)物去除過程復(fù) 雜，收率低，成本高且易污染環(huán)境等缺點(diǎn)，從而限制了D-丙氨酸的生產(chǎn)和市場推廣。因此， 研究開發(fā)一種工藝路線短、生產(chǎn)成本低的D-丙氨酸生產(chǎn)方法變得十分迫切和必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種L-丙氨酸氧化酶的基因克隆與表 達(dá)的方法，開發(fā)出一種生產(chǎn)工藝路線短、成本低的D-丙氨酸生產(chǎn)方法。
[0007] 本發(fā)明解決問題所采用的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種編碼L-丙氨酸氧化酶的基因，其是從已構(gòu)建的酵母菌cDNA文 庫中獲得，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本發(fā)明獲得的L-丙氨酸氧化酶是編碼L-丙氨酸氧化酶基因表達(dá)產(chǎn)物，該酶由423 個(gè)氨基酸組成，其分子量為49523. 12Da，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)質(zhì)粒，它由表達(dá)質(zhì)粒和編碼L-丙氨酸氧化酶的基 因重組而得。
[0011] 優(yōu)選的是，所述的表達(dá)質(zhì)粒為真核表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA。
[0012] 本發(fā)明還提供一種基因工程菌，其是由重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌而得。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種利用編碼L-丙氨酸氧化酶基因制備L-丙氨酸氧化酶的方 法，包含以下步驟：
[0014] (1)克隆編碼L-丙氨酸氧化酶的基因；
[0015] (2)將編碼L-丙氨酸氧化酶基因與表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；
[0016] (3)將重組表達(dá)質(zhì)粒線性化與純化；
[0017] (4)將純化后的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌，篩選后獲得基因工程菌；
[0018] (5)將基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)，純化鑒定后獲得L-丙氨酸氧化酶。
[0019] 優(yōu)選的是，步驟（4)中所述的受體菌為畢赤酵母X-33。
[0020] 優(yōu)選的是，步驟（5)中所述的基因工程菌利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0021] 優(yōu)選的是，所述甲醇添加至終濃度0.6% (v/v)。
[0022] 本發(fā)明還提供了L-丙氨酸氧化酶在D-丙氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于：所述 L-丙氨酸氧化酶能高效水解DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，其酶解反應(yīng)條件是：溫度30°C，避 光條件下反應(yīng)32h。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是：
[0024]1、本發(fā)明是從酵母菌的cDNA中直接獲取的L-丙氨酸氧化酶基因。
[0025] 2、本發(fā)明涉及到該L-丙氨酸氧化酶基因克隆、與之相對應(yīng)的氨基酸序列及其在 受體菌畢赤酵母X-33中的表達(dá)，該表達(dá)酶可以高效水解L-丙氨酸，為生物法合成D-丙氨 酸提供了一種新的方法。
[0026] 3、本發(fā)明的L-丙氨酸氧化酶能高效水解DL-丙氨酸的方法簡單高效，實(shí)現(xiàn)不對稱 降解法降解DL-丙氨酸生產(chǎn)D-丙氨酸，既提高其轉(zhuǎn)化效率、縮短D-丙氨酸的工藝路線，又 減少環(huán)境污染。
【附圖說明】
[0027] 圖1為LA0基因、重組質(zhì)粒Pmll和PCR鑒定圖，是以重組克隆載體為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收產(chǎn)物和？？扣2&4分別經(jīng)過？11111和乂6&1進(jìn)行雙酶切，其結(jié)果是通過0.8%瓊脂糖 凝膠電泳檢測；其中，在圖1-1中M為DNAMaker;1為LA0基因PCR圖；圖1-2中M為DNA Mark;1為表達(dá)載體pPICZaA;2為重組載體。
[0028] 圖2為重組子LA0在畢赤酵母X-33(P.pastorisX-33)中表達(dá)圖，是用含空 pPICZaA載體的重組菌作為空白對照，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后提取菌體蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分析； 其中M為DNAMark;第1孔為原始菌株表達(dá)LA0;第2-5孔為重組載體表達(dá)的LA0。
[0029]圖3為酶促反應(yīng)液高效液相色譜圖，是將酶促反應(yīng)液預(yù)處理后，用反相高效液相 色譜法檢測反應(yīng)結(jié)果，檢測條件為：C18柱（5ym，250mmX4. 6mm)，流動(dòng)相乙腈-異丙醇 (7 : 3)，柱溫30°C，流速1. 0mL/min，UV檢測波長280nm;其中保留時(shí)間為9. 315為L-丙氨 酸氧化酶氧化酶。
[0030] 圖4為標(biāo)品D-丙氨酸高效液相色譜圖，標(biāo)品D-丙氨酸反相高效色譜法檢測結(jié)果， 檢測條件為：astec手性柱（5iim，150mmX4. 6mm)，流動(dòng)相：甲醇體積為分?jǐn)?shù)為33%，磷酸氫 二鈉濃度為〇. 〇lmol/L，PH= 6. 0,流速0. 05ml/min，柱溫25°C，檢測波長為200nn，進(jìn)樣量 5ul〇
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 夕卜，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0032] 實(shí)施例:
[0033] 1、文庫來源和質(zhì)粒
[0034] 酵母菌cDNA文庫和pPICZaA均由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0035] 2、主要試劑
[0036]表達(dá)宿主菌P.pastorisX-33 (野生型）、抗生素Zeocin均購自invitrogen公司。 Pm11酶和Xbal酶均購自TaKaRa生物工程公司。
[0037] 3、方法
[0038] 3.1、基因的克隆與測序
[0039] 以自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25iiL的反應(yīng)體系：10Xbuffer2. 5iiL， dTNP0?L，正反向引物各 0?L，cDNA模板 0?L，RTaq酶 0? 25iiL，補(bǔ)水至 25iiL。PCR 條件為：第一步：95°C5min，第二步：94°C50s，第三步：52°C45s，第四步：72°C2min，第五 步：72°ClOmin;其中第二步至第四步循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳