一種玉米耐鹽基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種玉米耐鹽基因ZmHKTl;lb及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽脅迫是影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素之一。據(jù)統(tǒng)計，在全世 界范圍內(nèi)，大約有4. 5億公頃的可耕作土地正在遭受著不同程度的鹽漬化，而且由于全球 氣候的不斷變化以及不合理的施肥灌溉等原因，土壤鹽漬化的范圍也將不斷擴大，這將嚴(yán) 重地制約我國的經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展。因此，除了利用一些傳統(tǒng)的手段和方法來改善土壤外， 培育耐鹽農(nóng)作物新品種已成為當(dāng)務(wù)之急。由于植物耐鹽性狀自身的復(fù)雜性，使得采用傳統(tǒng) 的育種方法很難獲得具有耐鹽特性的優(yōu)良品種。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過導(dǎo)入外源基因 來提高農(nóng)作物的耐鹽性已成為現(xiàn)代作物育種的主要潮流。
[0003] 利用基因工程技術(shù)將具有優(yōu)良性狀的基因轉(zhuǎn)入植物，以此來開發(fā)高效的轉(zhuǎn)基因作 物新品種是一項具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)。就目前的研宄情況而言，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提 高作物耐鹽性方面已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，已有的部分研宄表明，將耐鹽基因過表達(dá)或者 轉(zhuǎn)入其它生物中，其異源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和翻譯產(chǎn)物可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。
[0004] HKT轉(zhuǎn)運蛋白是一類非常重要的蛋白質(zhì)，根據(jù)其第一個孔環(huán)結(jié)構(gòu)（poredomain， PD)氨基酸組成的不同主要將其分成兩大類，不同類型的HKT轉(zhuǎn)運蛋白在功能上具有顯著 的差異。近年來，有關(guān)小麥、水稻、擬南芥等植物的fflT轉(zhuǎn)運蛋白在植物耐鹽過程中發(fā)揮的 作用已經(jīng)被先后報道，但是關(guān)于玉米中的HKT轉(zhuǎn)運蛋白在植物耐鹽過程中的作用的研宄尚 未見報道。
[0005] 因此，有必要對與玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白的編碼蛋白進(jìn)行分離，從而為后期利用玉米 KHT轉(zhuǎn)運蛋白對植物進(jìn)行定向改造奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠在植物中穩(wěn)定高效表達(dá)玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白的玉 米耐鹽基因及重組載體和應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種編碼玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白的基因 ZmHKTl;lb，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人在對玉米的耐鹽機制進(jìn)行研宄的過程中，對玉米進(jìn)行鹽脅迫處理 后提取玉米葉片總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到了如SEQIDN0:1所示的DNA序列。
[0009] 具體的，所述基因ZmHKTl;lb是按照以下方式獲得的：
[0010] 將生長10天的玉米B73幼苗從蛭石：營養(yǎng)土比例為1:1的花盆中取出，并洗掉玉 米根部的蛭石。然后將幼苗根部浸入濃度為250mmol/LNaCl溶液中通氣培養(yǎng)，取鹽脅迫處 理lh后的玉米葉片為材料，進(jìn)行RNA的提取等后續(xù)試驗。
[0011] 以鹽脅迫處理后的玉米B73葉片為材料，提取葉片總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以 cDNA為模板，分別在其5'UTR和3'UTR設(shè)計In-fusion引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游引物 為：ZmHKTl;lb-infusion-F(SEQIDNO:3)，下游引物為ZmHKTl;lb-infusion-R:(SEQ IDN0:4)。50yL反應(yīng)體系：5XTransStartFastPfuBuffer10yL，TransStartFastPfu DNAPolymerase1yL，2. 5mMdNTPs5yL，ZmHKTl;lb-infusion-F1.5yL，ZmHKTl; lb-infusion-R1.5yL，cDNA2yL，ddH20 29yL。反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性 5min，然后 95°C解 鏈30sec，56°C退火30sec，72°C延伸45sec，反應(yīng)32個循環(huán)，72°C延伸7min。將PCR產(chǎn)物切 膠回收后用凝膠回收試劑盒（AXYGEN)回收純化獲得SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于：由SEQIDNO: 2所示的氨基 酸序列組成。
[0013] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列在不影 響其活性的條件下，對該序列進(jìn)行取代、缺失或插入一個或幾個氨基酸以獲得具有同等活 性的蛋白質(zhì)。
[0014]本發(fā)明還提供了所述基因的重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體為pCAMBIA3301-ZmHKTl；lb〇
[0015] 本發(fā)明還提供了含有所述基因的工程菌，包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基 因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0016] 可選的，所述基因工程菌內(nèi)含有重組載體pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb的核苷酸片 段，
[0017] 本發(fā)明還提供了玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因ZmHKTl;lb在轉(zhuǎn)化植物中的應(yīng)用。
[0018] 進(jìn)一步地，所述植物包括玉米、煙草、水稻、棉花、大豆、高粱。優(yōu)選的，當(dāng)所述植物 為煙草時，能夠取得最好的提高耐鹽能力的效果。
[0019] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用是在煙草內(nèi)轉(zhuǎn)化所述基因ZmHKTl;lb，從而使得玉米表達(dá)具 有SEQIDNO:2所不的氣基酸序列的蛋白，提尚煙草的耐鹽能力。
[0020] 本發(fā)明所獲得的有益效果在于：提供了一種能夠在植物中穩(wěn)定高效表達(dá)玉米HKT 轉(zhuǎn)運蛋白的基因ZmHKTl;lb及重組載體，本發(fā)明所提供的基因ZmHKTl;lb可以應(yīng)用于提高 轉(zhuǎn)基因作物的耐鹽能力。
【附圖說明】
[0021] 圖1為植物重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb片段圖譜
[0022] 其中ZmHKTl;lb代表玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因。
[0023] 圖2為ZmHKTl;lb轉(zhuǎn)基因煙草植株T2代的PCR鑒定
[0024]M，D2000Maker;1，H20;2,野生型煙草；3和4,分別為2-3、2-8轉(zhuǎn)基因株系。擴增 產(chǎn)物大小為942bp。
[0025] 圖3為ZmHKTl;lb轉(zhuǎn)基因煙草植株T2代的RT-PCR分析
[0026]M，D2000Maker;1，H20;2,野生型煙草；3和4,分別為2-3、2-8轉(zhuǎn)基因株系。目的 基因ZmHKTl;lb的擴增產(chǎn)物大小均為259bp，參照基因Actin的擴增產(chǎn)物大小為106bp。
[0027] 圖4為T2代ZmHKTl;lb轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在不同濃度NaCl處理后的生長狀況
[0028]I表示在OmMNaCl處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的生長狀況，II表示在200mM NaCl處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的生長狀況，III在300mMNaCl處理下轉(zhuǎn)基因株系與 野生型煙草的生長狀況。其中2-3和2-8是轉(zhuǎn)基因株系。
[0029] 圖5為鹽脅迫對T2代ZmHKTl;lb轉(zhuǎn)基因煙草幼苗鮮重的影響
[0030] 橫坐標(biāo)代表不同的煙草株系，縱坐標(biāo)代表煙草幼苗的鮮重（FW)。200表示在200mM NaCl處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草幼苗的鮮重變化情況，300表示在300mMNaCl處理下 轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草幼苗的鮮重變化情況。WT代表野生型煙草幼苗，2-3和2-8是轉(zhuǎn) 基因幼苗。**表示有極顯著差異（P〈〇. 01)。
[0031] 圖6為鹽脅迫對T2代ZmHKTl;lb轉(zhuǎn)基因煙草幼苗主根長的影響
[0032] 橫坐標(biāo)代表不同的煙草株系，縱坐標(biāo)代表煙草幼苗的主根長（MRL)。200表示在 200mMNaCl處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草幼苗的鮮重變化情況，300表示在300mMNaCl 處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草幼苗的鮮重變化情況。WT代表野生型煙草幼苗，2-3和2-8 是轉(zhuǎn)基因幼苗。**表示有極顯著差異（P〈〇. 01)。
【具體實施方式】
[0033] 下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0034] 實施例1玉米HKT轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因ZmHKTl;lb的獲得以及植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb的構(gòu)建。
[0035] 將生長10天的玉米B73幼苗從蛭石：營養(yǎng)土為1:1的花盆中取出，并洗掉玉米根 部的蛭石。然后將幼苗根部浸入濃度為250mmol/LNaCl溶液中通氣培養(yǎng)，取處理lh后的玉 米葉片為材料，進(jìn)行RNA的提取等后續(xù)試驗。
[0036] 以鹽脅迫處理后的玉米B73葉片為材料，按照北京全式金生物技術(shù)有限公司 生產(chǎn)的RNA提取試劑盒EasyPure?PlantRNAKit的說明書提取葉片總RNA，按照北京 全式金生物技術(shù)有限公司提供的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptllFirst-StandcDNA SynthesisSuperMix的說明書，取1yg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，分別在其 5'UTR和 3'UTR設(shè)計In-fusion引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游引物為：ZmHKTl;lb-infusion-F: (SEQIDN0:3)，下游引物為ZmHKTl;lb-infusion-R:(SEQIDN0:4)。50yL反應(yīng)體 系：5XTransStartFastPfuBuffer10yL,TransStartFastPfuDNAPolymerase1yL， 2. 5mMdNTPs5yL，ZmHKTl;lb-infusion-F1. 5yL，ZmHKTl;lb-infusion-R1. 5yL，cDNA 2yL，ddH20 29yL〇
[0037] PCR反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5min，然后95°C解鏈30sec，56°C退火30sec，72°C延伸 45sec，反應(yīng)32個循環(huán)，72°C延伸7min。將PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN)回收純化。
[0038] 提取植物表達(dá)載體pCAMBIA3301質(zhì)粒DNA并用Ncol和BstEII雙酶切，20yL酶切 體系為：10父冊811打6^.121^，叱〇111^，88七￡1111^，質(zhì)粒0嫩41^，(1(11120 12 1^，37。〇 水浴酶切l(wèi)h后，60°C水浴酶切l(wèi)h。將pCAMBIA3301線性化質(zhì)粒大片段用凝膠回收試劑盒 (AXYGEN)回收純化。然后將上述PCR產(chǎn)物與pCAMBIA3301酶切純化產(chǎn)物進(jìn)行In-fusion HD 反應(yīng)，5yL反應(yīng)體系：5X In-fusion HD Enzyme premix lyL，PCR產(chǎn)物2 yL，pCAMBIA3301 酶切純化產(chǎn)物2 y L，50°C水浴反應(yīng)20min，然后取2. 5 y L反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5 a感受態(tài)細(xì) 胞，提取陽性質(zhì)粒，獲得如圖1所示結(jié)構(gòu)的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-ZmHKTl ;lb，進(jìn) 行酶切電泳檢測和測序驗證，獲得如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0039] 實施例2農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
[0040]制備農(nóng)桿菌感受態(tài)，并將含ZmHKTl ;lb基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，詳細(xì)過程如下：從含有50yg/mL利福平的YEB平板上挑取EHA105單克隆，接種于50ml含50yg/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中， 200rpm，28°C培養(yǎng)至OD值為0