專利名稱：一種丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(全血微量試條)，它屬于生物化學(xué)法用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。分類號(hào)屬于IPC G01N33/48。
丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferaee ALT)一直是臨床上最常用的、診斷價(jià)值最高的酶，是肝細(xì)胞受損后首先能檢出的肝功能異常指標(biāo)之一，而血清ALT作為肝損害的標(biāo)志酶沿用至今。ALT的測(cè)定是在ALT催化反應(yīng)基礎(chǔ)上進(jìn)行的。
通過測(cè)定生成物之一的丙酮酸來(lái)測(cè)定ALT。目前，臨床上所采用的測(cè)定方法主要有兩類一類叫動(dòng)力學(xué)法，主要有酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法；另一類叫終點(diǎn)法，主要有賴氏比色法和丙酮酸氧化酶比色法。下面就這三個(gè)方法的測(cè)定原理和操作方法做一扼述。
1、酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法該法問世于八十年代，被國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)和我國(guó)衛(wèi)生部臨檢中心推薦為臨床測(cè)定ALT的參考或標(biāo)準(zhǔn)方法，該法的測(cè)定原理為在ALT催化反應(yīng)體系中加入乳酸脫氫酶(LDH)和還原輔酶I(NADH)。當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸后，續(xù)發(fā)下列反應(yīng)在此偶聯(lián)反應(yīng)中，NADH的氧化速率與標(biāo)本中酶活性呈正比，在340mm處監(jiān)測(cè)吸光度的下降速率(-△A/min)，計(jì)算出ALT的活性單位。操作步驟為血清100μl，加入試劑I(100m mol/L Tris緩沖液，500mmol/L L-丙氨酸，0.18m mol/L NADH,1200u/L LDH,pH7.3)1000μl，混勻，37℃溫育5分鐘后，加入試劑Ⅱ(15mmol/Lα-酮戊二酸)100μl，混勻，啟動(dòng)LAT催化反應(yīng)。在波長(zhǎng)340nm，比色杯光徑1.0cm，延滯期30秒，連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度下降速率約60秒。測(cè)定所用儀器是自動(dòng)生化分析儀，并有商品試劑盒供應(yīng)。計(jì)算方法為ALTu/L=ΔA/min×1066220×1.20.1]]>=△A/min×1929式中6220為NADH在340nm的摩爾吸光度，血清稀釋倍數(shù)為12。
2、賴氏比色法該法應(yīng)用較早，七十年代作為全國(guó)推薦方法，至今許多基層醫(yī)療單位仍在廣泛使用。該法的測(cè)定原理為ALT的催化反應(yīng)經(jīng)30分鐘后，加入214一二硝基苯肼終止反應(yīng)，并與反應(yīng)液中的二種α-酮酸反應(yīng)生成相應(yīng)的214-二硝基苯腙。在堿性條件下，兩種苯腙的吸收光譜曲線有差別，在500-520nm處差異最大，以等摩爾濃度計(jì)算，丙酮酸苯腙的呈色強(qiáng)度約為α-酮戊二酸苯腙的三倍，據(jù)此可以算出丙酮酸的生成量。操作步驟為在操作前取適量的底物溶液，(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L,pH7.4)在37℃水浴箱內(nèi)預(yù)溫5min后使用。具體操作按下表進(jìn)行
混勻后，在37℃水浴箱中保溫30分鐘
各管混勻后，置37℃水浴保溫20分鐘，然后每管加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml，室溫放置5分鐘，在波長(zhǎng)505nm處以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定各管吸光度。測(cè)定管史光度減去樣本對(duì)照管吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得ALT活力。測(cè)定所用儀器為分光光度計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定如下①按下表向各管加入相應(yīng)試劑<
<p>②各管加入2,4二硝基苯肼溶液0.5ml，混勻，37℃20分鐘后加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液5.0ml。
③混勻，放置5分鐘后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)505nm處，以蒸餾水調(diào)零后，讀取各管的吸光度。各管吸光度均減去“0”號(hào)管吸光度，所得差值與對(duì)應(yīng)的卡門酶活力單位作圖。
3、丙酮酸氧化酶比色法將該法用于ALT測(cè)定，日本是在七十年代末，我國(guó)是在九十年初，該法的測(cè)定原理為在一定反應(yīng)條件下ALT催化反應(yīng)所產(chǎn)生的丙酮酸在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和硫胺素焦磷酸(TPP)存在下，被丙酮酸氧化酶(PYOD)氧化產(chǎn)生過氧化氫，后者在過氧化物酶(POD)及4-氨基安替比林(4AA)、2,4一二氯苯酚存在下，形成醌亞胺而顯紅色，顏色的深淺與ALT活性成正比。反應(yīng)式如下該法的操作步驟為在空白、測(cè)定和校準(zhǔn)管中分別加入蒸餾水、血清、校準(zhǔn)血清各25μl，于37℃水浴預(yù)溫，加入經(jīng)預(yù)溫至37℃的酶反應(yīng)液100ul，準(zhǔn)15分鐘時(shí)加入終止劑1.5ml，混勻，于510nm比色，以空白管校零，讀取各管吸光度。計(jì)算
測(cè)定所用的儀器是分光光度計(jì)。反應(yīng)試劑為以pH7.0磷酸緩沖液配制，每升含L-丙氨酸500mmol,a-酮戊二酸10mmol,2,4-二氯苯酚6mmol，亞鐵氰化鉀15μmol，丙酮酸氧化酶3000u，過氧化物酶3000u,4-氨基安替比林0.5mmol,FAD 36μmol,TPP 10μmol。終止劑為100mmol/L EDTA-Na2溶液。與該法相配套的試劑盒于近年已經(jīng)上市，該法在國(guó)外還用于干化學(xué)檢測(cè)技術(shù)。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)提供一種丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒。
在我國(guó)肝病發(fā)病率較高，為了預(yù)防與及時(shí)地診治肝病，醫(yī)療衛(wèi)生部門每年都在一定范圍內(nèi)進(jìn)行肝功普查。衛(wèi)生部婦幼所頒布的托幼條例規(guī)定，凡入托入園兒童必須進(jìn)行肝功能檢查，在臨床上眾多的肝功能檢查項(xiàng)目及方法中，酶學(xué)測(cè)定是肝病診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。肝臟是機(jī)體內(nèi)含酶最豐富的器官，當(dāng)肝臟受損時(shí)，可因通透性增加、細(xì)胞壞死等，使血清酶量發(fā)生變化，ALT的變化很具特征性。酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法、賴氏比色法和丙酮酸氧化酶比色法用于臨床醫(yī)學(xué)檢查是成功的，但它們用于ALT的篩查工作則不夠簡(jiǎn)便，主要因原有以下幾點(diǎn)其一血樣采集不夠簡(jiǎn)便，需靜脈取血；其二必須使用分析儀器進(jìn)行測(cè)定，有的需要昂貴儀器，且結(jié)果的判斷不夠直觀，均需計(jì)算；其三賴氏比色法由于方法學(xué)上的限制，酶反應(yīng)不夠完全，測(cè)定結(jié)果不夠準(zhǔn)確，連續(xù)監(jiān)測(cè)法由于儀器種類繁多，試劑來(lái)源不統(tǒng)一，造成測(cè)定結(jié)果的不一致性，室間可比性較差。針對(duì)目前所應(yīng)用的方法在篩查工作中存在的問題，本發(fā)明人研制了一種以全血干化學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，以丙酮酸氧化酶法為原理的微量快速試條法。該法將試條法與丙酮酸氧化酶法相結(jié)合，兼具二者的優(yōu)點(diǎn)，既具試條法的操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷直觀的特點(diǎn)，又具丙酮酸氧化酶法的靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。與上述三種方法相比，該法血樣易獲取，采集末稍微量血即可，測(cè)定不需使用特殊的儀器，測(cè)定速度快。與國(guó)外的干化學(xué)法相比，干化學(xué)法雖可隨機(jī)取樣，但在血樣采集后必須立即放入儀器進(jìn)行操作，且干化學(xué)血液分析儀每次只能測(cè)試一份樣品，儀器價(jià)格昂貴，常用于急癥病人的監(jiān)測(cè)，該法既可隨機(jī)取樣單個(gè)操作，更適合批量標(biāo)本集中采樣，成批進(jìn)行測(cè)定，為群體普查如兒童入托入園、新兵入伍、婚檢以及邊遠(yuǎn)貧困地區(qū)的肝功能篩查工作提供了理想的測(cè)定方法，也為設(shè)備條件差和技術(shù)力量薄弱的基層衛(wèi)生單位提供了一種方便，可靠的ALT檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒，包括酶試劑、基質(zhì)液、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶參考血清、參考血清復(fù)溶液以及試條，其特征在于酶試劑的組成為丙酮酸氧化酶3IU/L，過氧化物酶3IU/L，維生素C氧化酶5IU/L，黃素腺嘌呤二核苷酸36μmol/L；基質(zhì)液的組成為L(zhǎng)-丙氨酸0.50mol/L,α-酮戊二酸0.003mol/L,2,4-二氯苯酚6mmol/L,4-氨基安替比林0.5mmol/L，亞鐵氰化鉀0.01 68g/L；試條主要有轉(zhuǎn)運(yùn)膜和反應(yīng)膜組成，轉(zhuǎn)運(yùn)膜(4)覆蓋反應(yīng)膜(2)并與之相連。還包括樣品稀釋液，組成為氯化鈉0.154mol/L，磷酸二氫鈉273.9mg/L，磷酸氫二鈉1.52g/L。還包括滴瓶，一次性定量采血管和酶標(biāo)反應(yīng)板。試條還包括底片、墊片和同心孔，底片(7)上放有墊片(6)，在底片和墊片的前部有一同心孔(5)，同心孔上蓋有反應(yīng)膜(2)。試條還包括保護(hù)膜和加樣孔，保護(hù)膜(1)包在轉(zhuǎn)運(yùn)膜(4)上，其上有一加樣孔(3)。
一種利用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括以下步驟(1)將基質(zhì)液加入酶試劑中，放置3-5分鐘后再輕輕搖勻使之溶解完全，配置成酶工作液，嚴(yán)禁倒置，(2)用參考血清復(fù)溶液溶解參考血清，配置出ALT含量為60U/L的參考血清，(3)采取末稍血30μl，加到試條加樣孔中，待血液全部滲入后，再向加樣孔中加入樣品稀釋液1滴，放置2-3分鐘，(4)剝?nèi)ケＷo(hù)膜，可見稀釋血清已轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)膜上，用鑷子從試條背面小孔處向上剝反應(yīng)膜使翹起，再用鑷子從試條正面取下反應(yīng)膜放入酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，(5)取參考血清30μl代替全血，加到試條加樣孔中，其他過程與步驟(3)和(4)相同，(6)同時(shí)在樣品及參考血清酶標(biāo)板的每一反應(yīng)孔中均加入酶工作液1滴，充分混合，酶標(biāo)板立即置37℃恒溫水浴箱支架上，保溫20分鐘，(7)將酶標(biāo)板從恒溫水浴箱取出，對(duì)照參考血清孔顏色判定結(jié)果，凡比參考血清反應(yīng)孔顏色深者即為陽(yáng)性，應(yīng)再作定量測(cè)定。


圖1為試條的主視圖。
圖2為試條的剖視圖。
圖3為轉(zhuǎn)運(yùn)膜的示意圖。
圖4為底片的示意圖。
圖5為ALT標(biāo)準(zhǔn)色板。
1、丙酮酸氧化酶試條法的檢測(cè)原理。
該試劑盒主要由試條和試劑兩部分組成。試條主要由轉(zhuǎn)運(yùn)膜和反應(yīng)膜組成。該法的檢測(cè)原理為將微量全血滴在轉(zhuǎn)運(yùn)膜上，轉(zhuǎn)運(yùn)膜將全血快速轉(zhuǎn)移分離血清，將血清轉(zhuǎn)移至反應(yīng)膜上，然后在反應(yīng)膜上直接滴加酶工作液，經(jīng)15分鐘保溫進(jìn)行丙酮酸氧化酶法的一系列反應(yīng)而呈紅色，與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)照，或與參考血清按同法操作所顯顏色相比較，判斷結(jié)果是否正常。
試條的結(jié)構(gòu)特征，組成和技術(shù)特征如下(參見附圖1-4)轉(zhuǎn)運(yùn)膜為過濾紙，反應(yīng)膜為PFO2紙(即6902-M型醫(yī)用紙，產(chǎn)地天津)，保護(hù)膜為鋁箔紙，其上有一加樣孔；墊片和底片均為塑料板。試條結(jié)構(gòu)為在底片7上放有一墊片6，在底片和墊片的前部有一同心孔5，同心孔上蓋有一反應(yīng)膜2，反應(yīng)膜與轉(zhuǎn)運(yùn)膜4相連接，轉(zhuǎn)運(yùn)膜覆蓋在反映膜上，其弧形頂端與反映膜的圓心相吻接，保護(hù)膜1包在前部，右部上端有一小孔3為加樣孔。
底片的作用是起支撐作用，同時(shí)為了手持操作方便；墊片是為了墊高同心孔，并維持一定的柔軟性；同心孔是接收過量的反應(yīng)液；轉(zhuǎn)運(yùn)膜的作用是將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)膜上，其技術(shù)特征是在短時(shí)間內(nèi)使血球與血清迅速分離，阻滯血球擴(kuò)散并沉積在轉(zhuǎn)運(yùn)膜基底部，血清定向快速轉(zhuǎn)移至反應(yīng)膜，并無(wú)溶血現(xiàn)象，轉(zhuǎn)運(yùn)膜本身不吸附被測(cè)成分，反應(yīng)膜的作用是特異吸附反應(yīng)物，對(duì)反應(yīng)膜的技術(shù)要求是質(zhì)地疏松，均勻一致，具有一定的緊度、厚度，保證一定的容血量，擴(kuò)散速度快、滲透性好。
2、試劑盒組成A、樣品稀釋液B、酶試劑C、基質(zhì)液D、ALT參考血清E、滴瓶
F、參考血清復(fù)溶液G、一次性定量采血管H、試條I、酶標(biāo)反應(yīng)板3、試劑盒的制造(1)試劑的制造A．樣品稀釋液的配方氯化鈉0.154mol/L磷酸二氫鈉273.9mg/L磷酸氫二鈉2.51g/LB．酶試劑的配方丙酮酸氧化酶3IU/L過氧化物酶3IU/L維生素C氧化酶5IU/L黃素腺嘌呤二核苷酸36μmol/LC．基質(zhì)液的配方L-丙氨酸0.5mol/Lα-酮戊二酸0.003mol/L2,4-二氯苯酚6mmol/L4-氨基安替比林0.5mmol/L亞鐵氰化鉀0.0168g/L(2)試條的制造基底材料切割→貼墊片→沖孔→貼反應(yīng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)膜→貼保護(hù)膜→切成試條→包裝入袋。
4、試劑盒的使用方法配制酶工作液用基質(zhì)液(C)3.5ml加入酶試劑(B)中復(fù)溶成酶工作液，放置3-5分鐘后再輕輕搖勻使之溶解完全。嚴(yán)禁倒置，溶解后將酶工作液倒入丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶漓瓶(E)中備用。
配制參考血清用參考血清復(fù)溶液(F)-ml復(fù)溶參考血清(D)，配制出參考血清ALE=60U/L。
方法一、適用于群體檢測(cè)①用定量采血管取末稍血30μl，加到試條加樣孔中。
②待血液全部滲入后(約2-3分鐘)再?gòu)募訕涌字屑尤霕悠废♂屢?A)1滴(約25μl)，放置2-3分鐘。
③剝?nèi)ケＷo(hù)膜，可見稀釋血清已轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)膜上，用鑷子從試條背面小孔處向上撥反應(yīng)膜使翹起。再用鑷子從試條正面取下反應(yīng)膜放入酶標(biāo)板反應(yīng)孔中。
④ALT參考反應(yīng)膜的制備取參考血清30μl代替全血，加到試條加樣孔中，其它過程同②、③。
⑤同時(shí)在標(biāo)本及參考血清酶標(biāo)板每一反應(yīng)孔中均加入酶工作液1滴(約25μl)充分混合，酶標(biāo)板立即置37℃恒溫水浴箱支架上，保溫20分鐘。
⑥結(jié)果觀察從恒溫水箱取出后，對(duì)照參考血清孔顏色判讀結(jié)果。凡比參考血清反應(yīng)孔顏色淺者為ALT正常，與參考血清顏色相近者視為弱陽(yáng)性，凡比參考血清反應(yīng)孔顏色明顯深者即視為陽(yáng)性應(yīng)再做定量測(cè)定。也可以對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)色板判讀結(jié)果。
方法二、適用于門診單項(xiàng)檢查①用定量采血管取末稍備30μl，加到試條加樣孔中。
②待血液全部滲入后(約2-3分鐘)再?gòu)募訕涌字屑尤霕悠废♂屢?A)③1滴(約25μl)放置2-3分鐘。
③剝?nèi)ケＷo(hù)膜，可見稀釋血清已轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)膜上，用鑷子去掉轉(zhuǎn)運(yùn)膜，借助試條上端及中端不干膠將試條貼在塑料反應(yīng)托架上，使反應(yīng)膜正置托架空隙處。
④在反應(yīng)膜上漓加酶工作液1滴(約25μl)立即置37℃恒溫水浴箱托架上，準(zhǔn)時(shí)計(jì)時(shí)，反應(yīng)20分鐘。
⑤結(jié)果判斷取出試條，觀察反應(yīng)膜顏色變化，并對(duì)照色板判讀結(jié)果。凡比45u顏色淺為正常，深者即視為陽(yáng)性，應(yīng)進(jìn)一步測(cè)定。
該產(chǎn)品對(duì)ALT的檢測(cè)效果可以從以下幾個(gè)方面評(píng)價(jià)1．重現(xiàn)性①同一份血清同時(shí)做20次，結(jié)果色澤變化一致，同一份混合血清分別做20次，結(jié)果色澤變化一致。
②取酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)得酶活力分別為32、54和120U血清分別加入經(jīng)生理鹽水洗滌三次的“O”型血球，按血清61％、血球39％比例配成全血血樣。按上述試條法的方法一操作，同時(shí)測(cè)定10次，每份測(cè)3條，各條結(jié)果顏色變化一致。以上樣本分次測(cè)定10次，每份測(cè)2條，結(jié)果顏色變化一致。
重現(xiàn)性試驗(yàn)的結(jié)果表明，試條法具有良好的重現(xiàn)性。
2．對(duì)比實(shí)驗(yàn)試條法與酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法對(duì)比選擇樣本100份，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定ALT活力，其中45例介于10-50U,35例介于50-100U,25例介于100-400U，向血清中加入經(jīng)生理鹽水洗滌三次“O”型血球，按血清61％、血球39％配成全血。經(jīng)用試條法測(cè)試，符合率為100％。結(jié)果表明試條法的測(cè)定結(jié)果與連續(xù)監(jiān)測(cè)法基本一致，試條法具有良好的準(zhǔn)確性。
3．穩(wěn)定性試驗(yàn)該項(xiàng)試驗(yàn)主要考察試劑的穩(wěn)定性，分為兩個(gè)部分的內(nèi)容①對(duì)連續(xù)三個(gè)批號(hào)的產(chǎn)品在一年內(nèi)穩(wěn)定性的考察，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料如下
產(chǎn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料一從連續(xù)三批(批號(hào)960901,960902,960903)產(chǎn)品中隨機(jī)抽樣，每批抽3盒，每盒測(cè)定5次，觀察不同時(shí)間1)酶試劑復(fù)溶時(shí)間；2)復(fù)溶后清晰度；3)空白值；4)參考血清反應(yīng)膜變化；5)值控血清(正常值、病理值)實(shí)測(cè)結(jié)果。
逐項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與制檢規(guī)程中質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定試劑的開瓶后有效期限。制檢規(guī)程中的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見表1，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料見表2。
表1．制檢質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)<
>表2．批號(hào)，960901
<p>注測(cè)定的正常值、病理值血清為BOEHRINGER MANNHEIM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為I8963710和I8789408。
表2．批號(hào)960902
注測(cè)定的正常值、病理值血清為BOEHRINGER MANNHEIM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為I8963710和I8789408。
表3．批號(hào)960903
注測(cè)定的正常值、病理值血清為BOEHRINGER MANNHEIM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為I8963710和I8789408。結(jié)果表明，該產(chǎn)品放置一年內(nèi)基本穩(wěn)定。
②用戶使用時(shí)配制酶工作液的穩(wěn)定性考察，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料如下
產(chǎn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料二從連續(xù)三批(批號(hào)970801,970802,970803)產(chǎn)品中隨機(jī)抽樣，每批抽2盒，每盒測(cè)定5次，觀察試劑復(fù)溶后在冰箱2-8℃保存和室溫保存不同時(shí)間。
(1)空白值；(2)參考血清反應(yīng)膜變化；(3)質(zhì)控血清(正常值、病理值)實(shí)測(cè)結(jié)果逐項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與制檢規(guī)程中質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定試劑的開瓶后有效期限。制檢規(guī)程中的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見表1，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料見表2。
表1、制檢質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
表2、批號(hào)970801開瓶后2-8℃保存
注1．試驗(yàn)時(shí)間為1997年10月；9.9表示9日上午9時(shí)；12.16表示12日下午16時(shí)。
2．測(cè)定的正常值、病理值血清為BM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為18962710和18789408。
表2、批號(hào)970801開瓶后室溫保存
注1．試驗(yàn)時(shí)間為1997年10月；9.9表示9日上午9時(shí)。
2．測(cè)定的正常值、病理值血清為BM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為18962710和18789408。
表2、批號(hào)970802開瓶后2-8℃保存
注1．試驗(yàn)時(shí)間為1997年10月；9.9表示9日上午9時(shí)；12.16表示12日下午16時(shí)。
2．測(cè)定的正常值、病理值血清為BM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為18962710和18789408。
表2、批號(hào)9170802開瓶后室溫保存
<p>2．測(cè)定的正常值、病理值血清為BM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為18962710和18789408。
表2、批號(hào)970803開瓶后2-8℃保存
注1．試驗(yàn)時(shí)間為1997年10月；9.9表示9日上午9時(shí)；12.16表示12日下午16時(shí)。
2．測(cè)定的正常值、病理值血清為BM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為18962710和18789408。
表2、批號(hào)970803 開瓶后室溫保存
注1．試驗(yàn)時(shí)間為1997年10月；9.9表示9日上午9時(shí)。
2．測(cè)定的正常值、病理值血清為BM公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為18962710和18789408。結(jié)果表明酶工作液2-8℃保存，可穩(wěn)定8天，室溫可穩(wěn)定8小時(shí)。
實(shí)施例該產(chǎn)品經(jīng)天津肝病研究所、天津兒童保健所、天津市第三中心醫(yī)院和天津市天和醫(yī)院的臨床使用，認(rèn)為試條法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，是ALT分析和篩選試驗(yàn)的理想方法。該法與酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法及賴氏法呈良好的相關(guān)性。四家醫(yī)院的臨床使用考核資料如下丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)微量快速試劑盒應(yīng)用報(bào)告一、材料和方法1、對(duì)象1996-1997年6月在我院門診及查體工作中應(yīng)用，共檢測(cè)2780人份。
2、試劑使用北京遠(yuǎn)東協(xié)和生物技術(shù)公司丙氨酸微量快速試劑盒。
3、方法受檢者均從末梢取血。取30ul全血，加到試條加樣孔中，待2分鐘轉(zhuǎn)移，加樣品稀釋液一滴，37℃保溫15分鐘，取出對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)色板觀察結(jié)果。
二、結(jié)果1、定性實(shí)驗(yàn)ALT＜40u/L或＜20賴氏單位為正常；ALT＞40u/L或＞20賴氏單位為陽(yáng)性，2、在受檢的2780人中，定性實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者共31人，占1.11％，對(duì)定性陽(yáng)性者用連續(xù)監(jiān)測(cè)法做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果ALT均大于40u/L(范圍42-215u/L)。兩種方法結(jié)果一致。
三、結(jié)論北京遠(yuǎn)東協(xié)和生物技術(shù)公司生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒用血量少、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于ALT肝功能實(shí)驗(yàn)初篩檢查。
丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)四種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)比觀察丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)實(shí)驗(yàn)方法大致有以下四種1．ALT酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法(簡(jiǎn)稱方法1)；2．ALT賴氏法(方法2)；3．丙酮酸氧化酶法(方法3)；4．ALT微量快速試條法(方法4)。擬對(duì)四種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)比，并在普查中實(shí)際應(yīng)用，報(bào)告如下一、實(shí)驗(yàn)方法和材料1、ALT測(cè)定方法①酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法TOSHIBA TBA-40中生藥盒②賴氏法北化藥盒用HITACHI-220A紫外分光光度計(jì)比色③丙酮酸氧化酶法北京遠(yuǎn)東協(xié)和藥盒BIO-RAD450酶標(biāo)儀比色④微量快速試條法北京遠(yuǎn)東協(xié)和藥盒2、觀察對(duì)象(1)任選肝炎門診血清標(biāo)本71例，其中有ALT正常和異常者。
(2)在華北電建1060名職工查體中分別取靜脈血按方法1、4進(jìn)行試驗(yàn)，方法4用血清代替全血按試條法做轉(zhuǎn)移，以反應(yīng)膜測(cè)定ALT活力，做篩選實(shí)驗(yàn)。
二、結(jié)果1．正常參考值(1)國(guó)際單位表示ALT＜40u/L為正常；ALT≥40u/L為陽(yáng)性；(2)賴氏單位表示ALT＜20“u”為正常；ALT≥20“u”為陽(yáng)性；2．按四種測(cè)定方法對(duì)71例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與北京遠(yuǎn)東協(xié)和公司方法3藥盒做相關(guān)檢驗(yàn)(1)方法1與方法3:r=0.9823,Y=10.1789+1.0462X；(2)方法2與方法3:r=0.9719,Y=4.5031+0.4464X；(3)方法1ALT≥40u/L有34例(范圍40.3-328u/L)，以方法4做篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性；(4)國(guó)際單位值(u/L)與賴氏單位值(U)之比為2.05∶1。
3．華北電建1060名職工查體結(jié)果，方法1異常者123例，占11.51％。用方法4做篩選實(shí)驗(yàn)也均為陽(yáng)性。其中有5例方法1為35-40u/L，方法4判為陽(yáng)性。主要是為防止漏診。
三、結(jié)論1、丙酮酸氧化酶法測(cè)定ALT與傳統(tǒng)的酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法和賴氏法有較好的相關(guān)關(guān)系。該法用血量少、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，開辟了一種ALT終點(diǎn)分析的可靠方法。
2、丙酮酸氧化酶法為一種終點(diǎn)分析方法，其測(cè)得單位值與傳統(tǒng)的賴氏法單位值比較為2.05∶1；此值的確定對(duì)酶的連續(xù)監(jiān)測(cè)法和終點(diǎn)分析方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比提供了依據(jù)。
3、微量快速試條法，只需末梢血一滴快速測(cè)定，可作為ALT檢測(cè)的一種篩選方法。尤其適合于兒童和成人的普查應(yīng)用。
4、華北電建普查結(jié)果表明，在某些集體作業(yè)工作生活的人群中，吃、住在一起，衛(wèi)生條件難以保證，極易造成肝炎傳播。提示此類人群應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，以做到對(duì)肝炎的早期防治。
權(quán)利要求
1．一種丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒，包括酶試劑、基質(zhì)液、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、參考血清、參考血清復(fù)溶液以及試條，其特征在于酶試劑的組成為丙酮酸氧化酶3IU/L，過氧化物酶3IU/L，維生素C氧化酶5IU/L，黃素腺嘌呤二核苷酸36μmol/L；基質(zhì)液的組成為L(zhǎng)-丙氨酸0.50mol/L,a-酮戊二酸0.003mol/L，顯色劑，亞鐵氰化鉀0.0168g/L；試條主要有轉(zhuǎn)運(yùn)膜和反應(yīng)膜組成，轉(zhuǎn)運(yùn)膜(4)覆蓋在反應(yīng)膜(2)的一半處。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的顯色劑為2,4-二氯苯酚6mmol/L和4-氨基安替比林0.5mmol/L。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包括樣品稀釋液，組成為氯化鈉0.154mol/L，磷酸二氫鈉273.9mg/L，磷酸氫二鈉1.52g/L。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包括漓瓶，一次性定量采血管和酶標(biāo)反應(yīng)板。
5，根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試條還包括底片、墊片和同心孔，底片(7)上放有墊片(6)，在底片和墊片的前部有一同心孔(5)，同心孔上蓋有反應(yīng)膜(2)。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于試條還包括保護(hù)膜和加樣孔，保護(hù)膜(1)包在轉(zhuǎn)運(yùn)膜(4)上，其上有一加樣孔(3)。
7．一種利用權(quán)利要求1所述的試劑盒測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括以下步驟(1)將基質(zhì)液加入酶試劑中，放置3-5分鐘后再輕輕搖勻使之溶解完全，配置成酶工作液，嚴(yán)禁倒置，(2)用參考血清復(fù)溶液溶解參考血清，配置出ALT含量為60IU/L的參考血清，(3)采取末稍血30μl，加到試條加樣孔中，待血液全部滲入后，再向加樣孔中加入樣品稀釋液1滴，放置2-3分鐘，(4)剝?nèi)ケＷo(hù)膜，可見稀釋血清已轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)膜上，用鑷子從試條背面小孔處向上剝反應(yīng)膜使翹起，再用鑷子從試條正面取下反應(yīng)膜放入酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，(5)取參考血清30μl代替全血，加到試條加樣孔中，其他過程與步驟(3)和(4)相同，(6)同時(shí)在樣品及參考血清酶標(biāo)板的每一反應(yīng)孔中均加入酶工作液1滴，充分混合，酶標(biāo)板立即置37℃恒溫水浴箱支架上，保溫20分鐘，(7)將酶標(biāo)板從恒溫水浴箱取出，對(duì)照參考血清孔顏色判定結(jié)果，凡比參考血清反應(yīng)孔顏色淺者為ALT正常，與參考血清顏色相近者視為弱陽(yáng)性，凡比參考血清反應(yīng)孔顏色明顯深者即視為陽(yáng)性應(yīng)再做定量測(cè)定；也可以對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)色板判讀結(jié)果，淺紅色為ALT正常，粉紅色為弱陽(yáng)性，深紅色視為陽(yáng)性，應(yīng)進(jìn)一步做定量測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒,包括酶試劑、基質(zhì)液、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、參考血清、參考血清復(fù)溶液以及試條,其特征在于:酶試劑的組成為:丙酮酸氧化酶3IU/L,過氧化物酶3IU/L,維生素C氧化酶5IU/L,黃素腺嘌呤二核苷酸36μmol/L;基質(zhì)液的組成為:L－丙氨酸0.50mol/L,α－酮戊二酸0.003mol/L,顯色劑,亞鐵氰化鉀0.0168g/L;試條主要有轉(zhuǎn)運(yùn)膜和反應(yīng)膜組成,轉(zhuǎn)運(yùn)膜覆蓋在反應(yīng)膜的一半處。
文檔編號(hào)C12Q1/52GK1231341SQ9810124
公開日1999年10月13日 申請(qǐng)日期1998年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月3日
發(fā)明者田慶春 申請(qǐng)人:北京遠(yuǎn)東協(xié)和生物技術(shù)有限公司