專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種海因酶基因及其編碼的氨基酸和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種海因酶基因及其編碼的氨基酸和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：D-氨基酸及其衍生物是醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的重要原材料，被廣泛地用于半合成抗生素、多肽激素、擬除蟲(chóng)菊酯、殺蟲(chóng)劑和甜味劑等的中間物。其中，D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-pHPG)是合成半合成廣譜抗生素阿莫西林、頭孢羥氨芐、頭孢哌酮、頭孢羅奇有頭孢羥胺唑等的重要原料。D-對(duì)羥基苯甘氨酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝需要通過(guò)化學(xué)合成和拆分(D-對(duì)羥基苯甘氨酸的合成過(guò)程如圖1所示)，該工藝存在著收率低，環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的研究和應(yīng)用得到發(fā)展，其過(guò)程如下首先利用化學(xué)手段合成D，L-對(duì)羥基苯海因(D，L-HPH)作為生物酶作用的底物，然后利用生物酶將其轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲縮合得到D，L-對(duì)羥基苯乙內(nèi)酰苯海因(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)立體專(zhuān)一性水解開(kāi)環(huán)生成D-N-氨甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在堿性條件或者存在消旋酶的條件下，未被開(kāi)環(huán)的L-型對(duì)映體消旋化為D-型從而進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化。通過(guò)這種酶促不對(duì)稱(chēng)水解反應(yīng)，可使混消旋的pHPH完全轉(zhuǎn)化為D-HPG。現(xiàn)在，在工業(yè)上已有采用固定化的D-海因酶或固定化細(xì)胞進(jìn)行該反應(yīng)的報(bào)道。酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸在工業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值，因此對(duì)其生產(chǎn)所用的相關(guān)酶的研究和改造有重要意義。而D-海因酶可催化5’單替代海因或二氫尿嘧啶的開(kāi)環(huán)，形成氨基甲酰類(lèi)的中間物，該中間產(chǎn)物可被氨甲酰水解酶降解為D-對(duì)羥基苯甘氨基酸，成為半合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的重要中間體。因而，對(duì)D-海因酶的研究逐漸成為了相關(guān)行業(yè)的熱點(diǎn)研究課題之一。近年來(lái)，人們已經(jīng)從PseudomonasfluorescensDSM84，BacillusstearothermophilisNS1122A，PseudomonasputidaCCRC12857，Agrobacteriumsp.KNK712，AgrobacteriumradiobacterNRRLB11291克隆出編碼海因酶的基因，并對(duì)其進(jìn)行了分子生物學(xué)改造，以改進(jìn)相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)。然而，迄今為止尚未見(jiàn)有克隆來(lái)源于Jannaschiasp.CCS1的海因酶的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種來(lái)源于Jannaschiasp.CCS1的海因酶基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種所述的海因酶基因編碼的氨基酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于，提供一種所述的海因酶基因的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)PCR方法從Jannaschiasp.CCS1基因組擴(kuò)增獲得海因酶基因。再將擴(kuò)增后獲得的海因酶的DNA片段與載體pET28a連接，從而獲得海因酶的重組質(zhì)粒pETJ2。將所述的海因酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E.coliBL21(DE3)中，并將所述的工程菌BL21(DE3)/pETJ2發(fā)酵培養(yǎng)，從而獲得所述的海因酶基因編碼的氨基酸。將所獲得的海因酶基因的表達(dá)產(chǎn)物，以對(duì)羥基苯海因作為底物，制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸，并與來(lái)源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶進(jìn)行了比較。本發(fā)明提供的海因酶基因編碼的氨基酸序列不同于目前已知來(lái)源的海因酶，其在以對(duì)羥基苯海因作為底物時(shí)表現(xiàn)出較高的酶活，明顯高于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。雖然，在本發(fā)明中，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，使用的是pET28a，但是對(duì)本領(lǐng)域的工作人員而言，使用其它的載體來(lái)構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體，如pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010等常用的表達(dá)載體，也是顯而易見(jiàn)的，故也應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。同樣的，對(duì)本領(lǐng)域的工作人員而言，將構(gòu)建好的相應(yīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到其它的微生物，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serratia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)等中，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化型微生物，也是顯而易見(jiàn)的，故也應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。圖1是D-對(duì)羥基苯甘氨酸的合成示意圖。圖2是新的海因酶表達(dá)載體pETJ2的構(gòu)建示意圖。圖3是在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)海因酶的電泳圖。其中各泳道分別為1為誘導(dǎo)前的BL21(DE3)/pETJ2；2為誘導(dǎo)后的BL21(DE3)/pETJ2；3為蛋白Marker。圖4是利用HPLC檢測(cè)海因酶反應(yīng)生成產(chǎn)物的曲線(xiàn)圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》(J.薩姆布魯克等著，2003)中所述的條件進(jìn)行。實(shí)施例1、含有目的基因的表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建1.1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank公布的Jannaschiasp.CCS1的基因組序列，設(shè)計(jì)引物A和B，其序列如下引物A5’-AGGGGGATCCATGAGCAAGGTGATCAAGGG-3’；引物B5’-CTAGAAGCTTTCAAACCCCCGCCGGAATG-3’。1.2、PCR擴(kuò)增用A和B為引物，以來(lái)源于Jannaschiasp.CCS1的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系1×PCRBufferforKODplus，2mMMgSO4，引物A和引物B各0.4μM，dJannaschiasp.CCS1基因組DNA100ng，0.2mMdNTP，1UKODplus/50μl。反應(yīng)條件94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，按操作手冊(cè)，將PCR產(chǎn)物用華舜公司的膠回收試劑盒回收純化約1.5kb的產(chǎn)物。對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。以來(lái)源于Agrobacteriumsp.KNK712的D-海因酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)作為Query，在GenBank中進(jìn)行同源性檢索。結(jié)果顯示，該氨基酸序列(SEQIDNO2)與具有SEQIDNO1記載的氨基酸序列(Q409E0)的同源性為40％，根據(jù)NCBI的BLAST結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)其存在海因酶的保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能具有海因酶的功能。1.3、構(gòu)建載體和工程菌構(gòu)建過(guò)程如圖2所示，具體操作如下參考操作手冊(cè)，用BamHI(購(gòu)自MBI公司)和HindIII(購(gòu)自MBI公司)分別對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET28a載體(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行雙酶切，采用MBI公司的雙酶切緩沖液R作為酶切反應(yīng)的緩沖液。酶切后，產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并割膠回收目的片段(PCR產(chǎn)物酶切后片段大小約為1.5kb，pET28a酶切后大小約為5.4kb)，然后參考操作手冊(cè)，用華舜公司的膠回收試劑盒分別回收并純化PCR產(chǎn)物的酶切后片段和載體pET28a的酶切后片段。取PCR產(chǎn)物酶切后片段和pET28a載體片段各4μl，1μlT4連接酶緩沖液和1μlT4連接酶，于16℃，連接過(guò)夜，收獲連接產(chǎn)物，即為表達(dá)載體pETJ2。取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接入液體培養(yǎng)基中，于37℃，250rpm，培養(yǎng)6-8小時(shí)后，抽提質(zhì)粒，并驗(yàn)證克隆。選取酶切驗(yàn)證正確的克隆測(cè)序，以驗(yàn)證序列是否突變。測(cè)序結(jié)果顯示，目的基因的序列沒(méi)有發(fā)生突變。將構(gòu)建好的表達(dá)載體pETJ2轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)(購(gòu)自Novagen公司)，得到的工程菌命名為BL21(DE3)/pETJ2。雖然，在本實(shí)施例中，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，使用的是pET28a，但是對(duì)本領(lǐng)域的工作人員而言，使用其它的載體來(lái)構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體，如pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010等常用的表達(dá)載體，也是顯而易見(jiàn)的，故也應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。同樣的，對(duì)本領(lǐng)域的工作人員而言，將構(gòu)建好的相應(yīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到其它的微生物，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serratia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)等中，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化型微生物，也是顯而易見(jiàn)的，故也應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例2、目的基因的表達(dá)挑取E.coliBL21(DE3)/pETJ2的單菌落接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，加入終濃度為0.25mM的IPTG，于20℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)。將菌液于12000rpm離心2分鐘后，棄上清。用50mMpH8.0的Tris-HCl緩沖液將沉淀重懸，超聲破碎。將破碎后的細(xì)胞，通過(guò)聚丙烯酰氨凝膠電泳分析目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3的結(jié)果可見(jiàn)，目的蛋白的表達(dá)量約占總蛋白的30％，可通過(guò)在大腸桿菌重組過(guò)量表達(dá)J2，以利于后續(xù)的酶蛋白的固定化和連續(xù)轉(zhuǎn)化的工業(yè)化生產(chǎn)。實(shí)施例3、目的蛋白酶活的測(cè)定將實(shí)施例2中過(guò)夜培養(yǎng)的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，加入終濃度為0.25mM的IPTG，于20℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)。收集菌液，離心，棄去上清，并于-20℃凍融一次，然后用50mMpH8.0的Tris-HCl緩沖液將菌體重懸。將重懸后的菌體加入到含1％對(duì)羥基苯海因、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，40℃反應(yīng)10分鐘，加入3.7％的HCl中止酶反應(yīng)并混勻。將上述反應(yīng)液于12000rpm離心5分鐘，取上清稀釋4倍后利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物生成的量(結(jié)果如圖4所示)，計(jì)算酶活，結(jié)果如表1所示。酶活計(jì)算方法表1、目的蛋白酶活測(cè)定結(jié)果<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="558">O.D.600μmol/min/ml/ODBL21/pETJ22.2±0.10.016±0.002</table></tables>實(shí)施例4、目的蛋白比活的測(cè)定將實(shí)施例2中過(guò)夜培養(yǎng)的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，加入終濃度為0.25mM的IPTG，于20℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)。收集菌液，離心，棄去上清，然后用50mMpH8.0的Tris-HCl緩沖液將菌體重懸。將重懸的菌液壓榨破壁，采用GE公司NiSepharoseHighPerformance純化目的蛋白，并用Bradford方法測(cè)定目的蛋白濃度。將目的蛋白用50mMpH8.0的Tris-HCl稀釋為終濃度0.06mg/mL，加入到含1％對(duì)羥基苯海因pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，40℃反應(yīng)30分鐘，加入3.7％的HCl中止酶反應(yīng)并混勻。將上述反應(yīng)液于12000rpm離心5分鐘，取上清稀釋10倍后利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物生成的量(結(jié)果如圖4所示)，計(jì)算酶比活，結(jié)果如表2所示。用同樣的方法可從含有來(lái)源于Agrobacteriumsp.KNK712海因酶的工程菌(CGMCCNo.0520.2)中表達(dá)、純化得到來(lái)源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶，并在上述同樣的條件下，測(cè)定其活性和比活。表2、目的蛋白比活測(cè)定結(jié)果根據(jù)上述實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推定具有SEQIDNO2的氨基酸序列的蛋白，具有海因酶的功能，因此是一種海因酶；且本發(fā)明的海因酶不同于目前已知來(lái)源的海因酶，其在以對(duì)羥基苯海因作為底物時(shí)，表現(xiàn)出較高的比活，其比活約為來(lái)源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶的4倍，因此，在運(yùn)用雙酶法生產(chǎn)對(duì)羥基苯甘氨酸的工業(yè)生產(chǎn)中可有較廣闊的運(yùn)用前景。序列表&lt;110&gt;中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院&lt;120&gt;一種海因酶&lt;130&gt;P5071012&lt;160&gt;3&lt;170&gt;PatentInversion3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;457&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Agrobacteriumsp.KNK712&lt;400&gt;1MetAspIleIleIleLysAsnGlyThrIleValThrAlaAspGlyIle151015SerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLysIleThrGlnIleGly202530GlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArgTyr354045ValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSer505560PheAsnThrGlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAla65707580AlaCysGlyGlyThrThrThrIleValAspPheCysGlnGlnAspArg859095GlyHisSerLeuAlaGluAlaValAlaLysTrpAspGlyMetAlaGly100105110GlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAspPro115120125ThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIle130135140ThrSerPheLysValPheMetAlaTyrArgGIyMetAsnMetIleAsp145150155160AspValThrLeuLeuLysThrLeuAspLysAlaValLysThrGlySer165170175LeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAlaAspTyrLeuArg180185190AspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu195200205SerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAla210215220LeuAlaGluIleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCys225230235240GluGluSerLeuGluGluValMetArgAlaLysSerArgGlyValArg245250255AlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeuThrLysGluAsp260265270LeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro275280285AlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsn290295300GlyValPheGluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLys305310315320GlyHisLysAspArgGlyArgAsnAspPheArgAlaIleProAsnGly325330335AlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetValTyrGlnGlyValAsn340345350GluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThrArg355360365ProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaVal370375380GlySerAspAlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetVal385390395400IleGluGlnThrAlaMetHisAsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGlu405410415GlyHisLysValLysGlyValProLysThrValLeuLeuArgGlyLys420425430ValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGlyLys435440445PheLeuLysArgArgLysTyrLysGln450455&lt;210&gt;2&lt;211&gt;487&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Jannaschiasp.CCS1&lt;400&gt;2MetSerLysValIleLysGlyGlyThrIleValThrAlaAspArgGln151015TrpGlnAlaAspValLeuIleGluGlyGluLysIleAlaGluIleGly202530GluAsnLeuArgGlyAspGluValIleAspAlaGluGlyAlaTyrVal354045IleProGlyGlyIleAspProHisThrHisLeuGluMetProPheMet505560GlyThrThrAlaAlaGluThrPheGluThrGlyThrPheAlaAlaAla65707580AlaGlyGlyThrThrMetLeuValAspPheCysLeuProGlyGluAsp859095GlySerLeuLeuSerAlaIleAspAlaTrpAspAlaLysSerLysAsp100105110GlnIleCysValAspIleSerTyrHisMetAlaIleThrGlyTrpSer115120125GluSerIlePheAsnGluMetAlaAspValValAsnValArgGlyIle130135140AsnThrPheLysHisPheMetAlaTyrLysGlyAlaLeuMetIleGlu145150155160AspAspGluMetPheSerSerPheLysArgCysAlaGluLeuGlyAla165170175LeuProLeuValHisAlaGluAsnGlyAspIleValGlnGluLeuGln180185190GlnLysTyrMetAlaMetGlyValThrGlyProGluGlyHisAlaTyr195200205SerArgProProGluValGluGlyGluAlaAlaAsnArgAlaIleMet210215220IleAlaAspAlaAlaGlyThrProLeuTyrIleValHisValSerCys225230235240GluGlnAlaHisGluAlaIleArgArgAlaArgGlnLysGlyMetArg245250255ValPheGlyGluProLeuIleGlnHisLeuThrLeuAspGluSerGlu260265270TyrPheAsnLysAspTrpGlnTyrAlaAlaArgArgValMetSerPro275280285ProPheArgAsnLysGluHisGlnAspGlyLeuTrpAlaGlyLeuAla290295300AlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisAlaAlaPheThrAsp305310315320GluGlnLysArgMetGlyValAspAsnPheGlyMetIleProAsnGly325330335ThrGlyGlyLeuGluGluArgMetAlaMetLeuTrpThrArgGlyVal340345350GluThrGlyArgLeuThrProGluGluPheValAlaValThrSerSer355360365AsnIleAlaLysIleLeuAsnIleTyrProMetLysGlyGlyIleAsn370375380ValGlyGlyAspAlaAspIleValValTrpAspProLysLeuGlyArg385390395400ThrIleThrThrAlaThrAlaLysSerIleLeuAspTyrAsnValPhe405410415GluGlyMetGluValSerAlaSerProArgTyrThrLeuSerArgGly420425430AspValValTrpAlaAlaGlyGlnAsnSerGlnProGlnProGlyArg435440445GlyLysPheValLysArgProProAlaAlaSerAlaSerGlnAlaLeu450455460SerLysTrpLysAlaLeuAsnThrProArgLysIleGluArgAspPro465470475480MetAsnIleProAlaGlyVal485&lt;210&gt;3&lt;211&gt;1464&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Jannaschiasp.CCS1&lt;400&gt;3atgagcaaggtgatcaagggcggcacgattgtgaccgcagaccgtcaatggcaggcggac60gtgttgatcgagggcgaaaagattgccgagatcggggagaacctgcgcggggatgaggtg120atcgacgcggaaggcgcctatgtgatcccgggcggcatagacccccacacgcatcttgag180atgcccttcatgggcaccacggcggcggagacgttcgagacgggcacctttgcggcggca240gcgggcggcaccacgatgctggtcgatttctgccttccgggcgaggatggcagccttttg300tccgccatcgatgcctgggacgccaaatcgaaggatcagatctgcgttgatatctcctac360cacatggcgatcaccggctggtcggagagcattttcaatgagatggcggacgttgttaat420gtgcgcggcatcaacacatttaagcatttcatggcctataaaggcgcgctgatgatcgag480gatgacgagatgttttcgtcgttcaagcgctgcgctgaattgggcgcgctgccgctggtc540catgccgaaaacggcgatatcgtccaggagttgcaacagaaatacatggcgatgggcgtg600acggggccggagggtcacgcatattcccgtccgcctgaggtcgaaggggaagccgccaac660cgcgcgatcatgatcgccgacgccgctggcacgccgttgtatatcgtccatgtgtcgtgt720gagcaggcccatgaggccatccgccgtgcccgtcagaaggggatgcgggtcttcggggag780ccactgatccagcacctgacgctggatgagagcgagtatttcaacaaggattggcaatat840gcggcccgccgggtcatgtccccgccgtttcgcaacaaagagcatcaggacggtctttgg900gcaggtcttgccgctgggtccttgcaggttgtggccacggaccacgccgccttcaccgac960gagcaaaagcgcatgggcgtggacaatttcggcatgatccccaacggcaccggcgggctt1020gaggagcgcatggcaatgttgtggacgcgcggcgtggaaacgggccgcctgacgccggaa1080gaattcgttgcggtgacgtcatcgaacatcgccaagatcctcaacatttacccaatgaag1140ggtggcatcaacgtcggcggcgacgcggatatcgtggtctgggacccgaaactgggccgc1200acgatcacgacggcaacggcgaaatctatccttgattacaatgtgttcgagggaatggag1260gtgagcgcctccccccgctacaccctgtcgcgcggggatgtggtgtgggcggcggggcaa1320aacagccagccgcaaccgggccgtgggaaattcgtgaaacggcccccggcggcgagtgcg1380tcccaggcgctgagcaagtggaaggcgttgaacacgccgcgcaagatcgagcgcgacccg1440atgaacattccggcgggggtttga146權(quán)利要求1.一種海因酶基因，其特征在于，所述海因酶基因來(lái)源于Jannaschiasp.CCS1。2.如權(quán)利要求1所述的海因酶基因，其特征在于，所述基因編碼的氨基酸具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求1或2所述的海因酶基因，其特征在于，所述的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的海因酶基因編碼的氨基酸。5.如權(quán)利要求4所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。6.如權(quán)利要求5所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸由具有SEQIDNO3所示的DNA序列的海因酶基因所編碼。7.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。8.如權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。9.如權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述載體包括pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010。10.如權(quán)利要求9所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，載體為pET28a。11.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的海因酶基因的應(yīng)用，其特征在于，用于制備海因酶。12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟A、構(gòu)建重組質(zhì)粒；B、轉(zhuǎn)化宿主菌；C、發(fā)酵培養(yǎng)，獲得海因酶。13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組質(zhì)粒具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。14.如權(quán)利要求13所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。15.如權(quán)利要求14所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述載體包括pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010。16.如權(quán)利要求15所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，載體為pET28a。17.如權(quán)利要求11或12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。18.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的海因酶基因用于制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的應(yīng)用。19.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟A、構(gòu)建重組質(zhì)粒；B、轉(zhuǎn)化宿主菌；C、發(fā)酵培養(yǎng)，制備海因酶發(fā)酵液；D、利用發(fā)酵液將D，L-對(duì)羥基苯海因底物轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸。20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組質(zhì)粒具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。21.如權(quán)利要求20所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。22.如權(quán)利要求21所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述載體包括pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010。23.如權(quán)利要求22所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，載體為pET28a。24.如權(quán)利要求18或19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了一種海因酶基因，以及該基因編碼的氨基酸、包含該基因的重組質(zhì)粒和該基因的應(yīng)用。本發(fā)明提供的海因酶基因所編碼的氨基酸序列不同于目前已知來(lái)源的海因酶，所述海因酶基因的表達(dá)產(chǎn)物在以對(duì)羥基苯海因作為底物時(shí)表現(xiàn)出較高的酶活，其比活明顯高于目前工業(yè)生產(chǎn)中常用的來(lái)源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。文檔編號(hào)C12N9/78GK101058818SQ200710039229公開(kāi)日2007年10月24日申請(qǐng)日期2007年4月6日優(yōu)先權(quán)日2007年4月6日發(fā)明者姜衛(wèi)紅,蔡淵恒,姜世民,陳軍,楊蘊(yùn)劉,楊晟申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院