專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻氯離子通道基因OsCLC、其編碼蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬涉及一種水稻氯離子通道基因OsCLC、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上超過(guò)半數(shù)人口的主要糧食作物，基因組測(cè)序工作已經(jīng)初步完成，并且是一種分子生物研究的良好模型。在導(dǎo)致作物產(chǎn)量潛力不能充分發(fā)揮的主要原因一非生物逆境的傷害中，鹽化是限制生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量的重要因素，鹽脅迫致使植物光合下降、能耗增加、衰老加速、產(chǎn)量下降或最終因碳饑餓而死亡然而，有關(guān)植物耐鹽機(jī)理的生理和分子生物學(xué)研究大都集中在Na+上，涉及Cl-的研究則很少。
陰離子通道廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物中，具有重要的生理學(xué)作用，但對(duì)其研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于陽(yáng)離子通道。作為重要的陰離子通道之一，氯離子通道(ChlorideChannel，CLC)一般被認(rèn)為與細(xì)胞膨壓及滲透調(diào)節(jié)、離子穩(wěn)態(tài)、胞內(nèi)pH、氣孔運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、金屬耐性、信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多功能有關(guān)。1990年，Hechenberger等利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)在電鰩屬石紋魚(yú)(Torpedo marmorata)的放電器官中首次分離到氯離子通道蛋白基因CLC-O，之后在細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物和植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了CLC基因的新成員。拓?fù)鋵W(xué)的研究顯示，CLC通道一般由10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(domains)組成，N-末端和C-末端同位于胞質(zhì)內(nèi)，不同于傳統(tǒng)的陽(yáng)離子通道中單孔通道，CLC通道通常以二聚體雙孔形式存在。目前已在哺乳動(dòng)物(人和鼠)上共發(fā)現(xiàn)9種CLC通道蛋白，據(jù)其同源性程度的大小，可分成3個(gè)亞家族，研究表明有些人類(lèi)遺傳病是由CLC通道基因造成的變化。而同時(shí)，關(guān)于植物氯離子通道基因的報(bào)告數(shù)量是十分有限的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種水稻氯離子通道基因OsCLC。
本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。
本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種水稻氯離子通道基因OsCLC，其特征在于該基因具有SEQ NO 7所示的堿基序列。
上述的水稻氯離子通道基因OsCLC編碼蛋白，其特征在于具有SEQ NO 8所示的氨基酸序列。
上述的水稻氯離子通道基因OsCLC的克隆方法，其特征在于該方法具有如下步驟a.水稻的分化愈傷組織的培養(yǎng)；b.水稻氯離子通道基因OsCLC的克隆采用Trizol法提取步驟a中所得的水稻分化愈傷組織的總RNA，以該總RNA為模板，采用Oligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；再經(jīng)PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR的反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min→(94℃30s，62℃40s，72℃150s)×35循環(huán)→72℃延伸10min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；然后將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-19-T載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)籃白斑法篩選得到陽(yáng)性克隆，該陽(yáng)性克隆即為水稻氯離子通道基因OsCLC；所采用的Oligo(dT)18引物分別為5’端引物為5’-CGATGGCGCCAAGGGACCAGTCAT-3’，3’端引物為5’-TACTAGCGAGCGTCAGAAGACGAG-3’。
上述的水稻的分化愈傷組織的培養(yǎng)方法的具體步驟為成熟水稻種子剝?nèi)シf殼，70％乙醇漂洗1min，0.1％升汞浸泡20min；無(wú)菌水沖洗4-5次后接種在MS+2，4-D2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于黑暗處26℃下培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；兩周后將愈傷組織置于分化培養(yǎng)基MS+6-BA2mg/L+KT2mg/L+NAA0.2mg/L上，收集分化的愈傷組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃。
本發(fā)明從水稻分化的愈傷組織中克隆到的一個(gè)全長(zhǎng)為2429bp的水稻氯離子通道蛋白基因OsCLC。開(kāi)放閱讀框編碼長(zhǎng)為808個(gè)氨基酸(分子量為88kD)的蛋白質(zhì)，跨膜區(qū)分析顯示具有11個(gè)跨膜區(qū)域，聚類(lèi)分析顯示OsCLC基因?yàn)镃LC家族的新成員。該OsCLC基因的表達(dá)水平在一定時(shí)間范圍內(nèi)與鹽濃度升高呈正相關(guān)變化，能對(duì)鹽脅迫環(huán)境壓力呈現(xiàn)出表達(dá)響應(yīng)。并且該基因在酵母突變株中能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分互補(bǔ)GEF1功能，部分地抑制對(duì)NaCl的敏感，并恢復(fù)生長(zhǎng)功能；對(duì)pH值變化敏感；對(duì)不同陽(yáng)離子無(wú)敏感現(xiàn)象。
圖1為水稻氯離子通道基因OsCLC編碼的氨基酸序列跨膜分析結(jié)果。
圖2為水稻氯離子通道基因OsCLC編碼的氨基酸序列的聚類(lèi)分析結(jié)果。
At示擬南芥；Os示水稻；Nt示煙草；St示馬鈴薯；Sc示釀酒酵母。用于分析的序列在GenBank中的序列號(hào)如下CLC-0(CAA40078)；CLC-1(CAA44683)；CLC-2(CAA45500)；CLC-3(BAA04471)；CLC-4(CAA54417)；CLC-5(CAA91216)；CLC-6(CAA58292)；CLC-7(CAA91556)；AtCLC-a(CAA96057)；AtCLC-b(CAA96058)；AtCLC-c(CAA96059)；AtCLC-d(CAA96065)；StCLC(CAA71369)；ScCLC(CAA80663)；OsCLC-1(BAB97267)；OsCLC-2(BAB97268)；CLC-Nt1(CAA64829)圖3為水稻氯離子通道基因OsCLC實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表達(dá)量變化結(jié)果。
圖4為水稻氯離子通道基因OsCLC在釀酒酵母突變株中的功能補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1WTBY4741；2MutantYJR040W；3pGAL1::OsCLC轉(zhuǎn)化子；4pYES2轉(zhuǎn)化子具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.)或植物分子生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一OsCLC全長(zhǎng)編碼區(qū)的克隆與分析(一)分化的愈傷組織制備成熟水稻種子剝?nèi)シf殼，70％乙醇漂洗1min，0.1％升汞浸泡20min；無(wú)菌水沖洗4-5次后接種在MS+2，4-D2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于黑暗處26℃下培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；兩周后將愈傷組織置于分化培養(yǎng)基MS+6-BA2mg/L+KT2mg/L+NAA0.2mg/L上，收集分化的愈傷組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃。
(二)總RNA提取采用Trizol法提取水稻分化愈傷組織的總RNA，以總RNA為模板，采用Oligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，Oligo(dT)18分別為5’端引物為5’-CGATGGCGCCAAGGGACCAGTCAT-3’，3’端引物為5’-TACTAGCGAGCGTCAGAAGACGAG-3’，經(jīng)PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min→(94℃30s，62℃40s，72℃150s)×35循環(huán)→72℃延伸10min，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)籃白斑法篩選得到陽(yáng)性克隆，交Sangon公司測(cè)序；用MEGA3.0進(jìn)行聚類(lèi)分析，用TMHMM2.0軟件進(jìn)行跨膜區(qū)域分析。
結(jié)果顯示該陽(yáng)性克隆一個(gè)全長(zhǎng)為2429bp的水稻氯離子通道蛋白基因(GenBankDQ272692)，命名為OsCLC，參見(jiàn)圖1。開(kāi)放閱讀框編碼長(zhǎng)為808個(gè)氨基酸(分子量為88kD)的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為8.1。經(jīng)過(guò)BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果顯示OsCLC編碼的氨基酸序列和CLC-Nt1、AtCLC-a、AtCLC-b、AtCLC-c、AtCLC-d的同源性分別達(dá)到59％、54％、52％、58％和47％。OsCLC具有11個(gè)疏水的跨膜區(qū)，在第2和第3跨膜區(qū)之間及第3跨膜區(qū)中存在3個(gè)保守區(qū)域的氨基酸序列GSGIPE(182aa)、GKAGPLVH(224aa)和PVGGVLF(283aa)，與之前其他物種中報(bào)道存在的被認(rèn)為與通道的陰離子選擇性有關(guān)的3個(gè)高度保守的氨基酸序列(GxGxPE、GKxGPxxH和PxxGxLF)相一致。與所報(bào)道其他物種的CLC基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，OsCLC基因是CLC蛋白家族之中的新成員。
實(shí)施例二鹽誘導(dǎo)的OsCLC基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(一)樣品制備根據(jù)水稻OsActin基因(GenbankX15865)序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物5’端引物(5′-TTG TGA GGG ACA TGA AGG AGA A-3′)；3’端引物(5′-TAT GAA GGA AGG CTGGAA GAG G-3′)片斷長(zhǎng)度為193bp，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參照。針對(duì)目的基因OsCLC設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，5’端引物5′-ACA TCG TAT TTC CTG GGC ATT T-3′；3’端引物5′-CAG TCA TTC TCA TTG ATC CTC C-3′，片斷長(zhǎng)度為179bp。以實(shí)施例一中合成的cDNA第一鏈為模板，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃，5min，經(jīng)如下30次循環(huán)94℃，20s，57℃，20s，72℃，20s；最后72℃延伸5min。接著分別將兩種產(chǎn)物連接入pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α，通過(guò)籃白斑法篩選得到陽(yáng)性克隆，堿法提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定確定獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒。
Trizol法提取0mM NaCl、50mM NaCl、100mM NaCl、200mM NaCl 4個(gè)鹽溶液濃度環(huán)境中分別耐受生長(zhǎng)0hr、1hr、8hr、16hr、24hr葉片的總RNA。以O(shè)ligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)模板-20℃存放待用。
(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作以超純水按10倍遞級(jí)稀釋成102、103、104、105、106、107、108、109個(gè)拷貝數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。分別對(duì)內(nèi)參照和目的基因質(zhì)粒進(jìn)行拷貝數(shù)定量，以拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，并求解回歸方程。
(三)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20μl反應(yīng)體系中分別加入SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 10μl、引物(20μM)每條0.4μl、待測(cè)樣品模板1μl，補(bǔ)ddH2O至20μl。
(四)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94℃5min；變性94℃30s，退火57℃20s，延伸72℃20s，熔解83℃1s；熔解后讀板；循環(huán)數(shù)為40；72℃延伸5min；熔解曲線(xiàn)溫度范圍設(shè)置為65.0℃至95.0℃，每間隔0.3℃讀數(shù)一次，每次1s。反應(yīng)在OpticonTM2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(MJ Research公司)中進(jìn)行。
通過(guò)PCR定量擴(kuò)增，根據(jù)兩次平行測(cè)定，每次每份樣品平行重復(fù)3個(gè)反應(yīng)，由兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別推算出OsActin基因和OsCLC所對(duì)應(yīng)的DNA拷貝數(shù)，每個(gè)樣品的OsCLC拷貝數(shù)和OsActin基因拷貝數(shù)的比值即可比較出在50mM NaCl、100mM NaCl、200mM NaCl鹽溶液濃度環(huán)境中分別耐受生長(zhǎng)0hr、1hr、8hr、16hr、24hr 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)OsCLC在葉片中的表達(dá)情況變化。
OsCLC在鹽脅迫環(huán)境下的表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的梯度增加，OsCLC的表達(dá)量當(dāng)鹽脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)1小時(shí)后上調(diào)至最高峰，其中50mM NaCl、100mM NaCl、200mM NaCl環(huán)境下的表達(dá)量分別達(dá)到起始量的1.46倍、1.23倍和1.42倍，8小時(shí)后50mM環(huán)境下的表達(dá)量維持1.23倍，100mM和200mM則下降至0.98和0.97倍。16小時(shí)后50mM環(huán)境下的表達(dá)量也回落至0.92倍，直至24小時(shí)之后，各濃度環(huán)境下表達(dá)量則無(wú)明顯變化。
因此，說(shuō)明在鹽脅迫條件下，OsCLC基因的表達(dá)水平在一定時(shí)間范圍內(nèi)與鹽濃度升高呈正相關(guān)變化，能對(duì)鹽脅迫環(huán)境壓力呈現(xiàn)出表達(dá)響應(yīng)。
實(shí)施例三突變體功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(一)重組質(zhì)粒的構(gòu)建以實(shí)施例一中合成的cDNA第一鏈為模板，設(shè)計(jì)特異性引物含Sac I位點(diǎn)的5’端引物(5’-AGC TGA GCT CGA TGG CGC CAA GGG ACC A-3’)；含Xbal I的3’端引物(5’-TAG CTC TAG AGA AGA CGA GGT TGG TGA A-3’)。所得產(chǎn)物經(jīng)Sac I和Xbal I酶切后插入到穿梭載體pYES2中，先在大腸桿菌DH5α中表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒pGAL1::OsCLC(Apr+)，通過(guò)Apr篩選得到的陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Sac I和Xbal I酶切鑒定為陽(yáng)性后用醋酸鋰法[12]轉(zhuǎn)化入釀酒酵母突變株YJR040W(gef1::kam)中，在CM省卻成分培養(yǎng)基(Ura-)上，30℃培養(yǎng)3-5天后生長(zhǎng)出pGAL1::OsCLC(Ura+)和pYES2空載體轉(zhuǎn)化子酵母菌落，分別提取酵母DNA作為模板，利用1.2.2小節(jié)中設(shè)計(jì)的OsCLC基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性菌落。
(二)酵母培養(yǎng)野生型釀酒酵母菌株BY4741、釀酒酵母突變株YJR040W、重組質(zhì)粒pGAL1::OsCLC(Ura+)轉(zhuǎn)化子和pYES2空載體轉(zhuǎn)化子分別在pH＝5、pH＝6、pH＝7以及分別添加NaCl(250mM)、NaCl(500mM)、NaCl(750mM)和NaCl(1M)的YPG培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-7天。
功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同pH值的YPG培養(yǎng)基中功能性互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30℃恒溫培養(yǎng)3天后，在pH＝6的環(huán)境下pGAL1::OsCLC(Ura+)能夠部分互補(bǔ)GEF1功能，恢復(fù)生長(zhǎng)功能效果最明顯。
在YPG培養(yǎng)基中添加NaCl(250mM)、NaCl(500mM)和NaCl(750mM)后生長(zhǎng)4天后；添加NaCl(1M)生長(zhǎng)7天后，pGAL1::OsCLC能夠部分互補(bǔ)GEF1功能，部分地抑制對(duì)NaCl的敏感，恢復(fù)生長(zhǎng)功能。隨著培養(yǎng)基中鹽濃度增加，功能互補(bǔ)程度越明顯。
在培養(yǎng)基中添加相同Cl-濃度、不同陽(yáng)離子類(lèi)型的鹽，包括NaCl、CaCl2、KCl和MgCl2培養(yǎng)、數(shù)天后結(jié)果表明不同類(lèi)型的陽(yáng)離子對(duì)于pGAL1::OsCLC恢復(fù)生長(zhǎng)情況并無(wú)影響(數(shù)據(jù)不顯示)。
因此，OsCLC基因在酵母突變株中能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分互補(bǔ)GEF1功能，部分地抑制對(duì)NaCl的敏感，并恢復(fù)生長(zhǎng)功能；對(duì)pH值變化敏感；對(duì)不同陽(yáng)離子無(wú)敏感現(xiàn)象。
序列表<110>上海大學(xué)<120>水稻氯離子通道基因OsCLC、其編碼蛋白及其克隆方法<160>8<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1CGATGGCGCC AAGGGACCAG TCAT 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2TACTAGCGAG CGTCAGAAGA CGAG 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3TTGTGAGGGA CATGAAGGAG AA 22
<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4TATGAAGGAA GGCTGGAAGA GG 22<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5AGCTGAGCTC GATGGCGCCA AGGGACCA 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6TAGCTCTAGA GAAGACGAGG TTGGTGAA 28<210>7<211>2429<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>
<223>
<400>71 cgatggcgcc aagggaccag tcatgtgggg acggcggcga ggtggatccg gagggtggca61 tcgaggcgcc actcctctcc tccggctcct cgttcttcca ggacccggcg cacgaggacg121 gcgatggcga cgaggaggcg cgacggcggc ggcggaggtt cctcctcgcc ggccgctccc181 agtccaacac cacctcccag gtggccctcg tcggcgtcgg cgtgtgcccc atcgagagcc241 tcgactacga gttgatcgag aacgaagtgt tcaagcagga ctggagggcg cgggggcggg301 gtcacatcct gcgctacgtg gcgctcaagt gggccctctg cttcctcgtc ggcgtcctct361 ccgccgccgc cggattcgtc gccaacctcg gcgtcgagaa cgtcgccggc gccaagttcg421 tcgtcacctc caatctcatg ctcgccggca gatacgggac agcgtttgcg gtgttcctgg481 tttcgaattt cgcccttacg atgttagcaa cggtgctgac ggtgtatgtg gcgccggcgg541 cggccgggtc gggcatccct gaggtgaagg cttacttgaa cggggttgat gcccccgaca601 tattttctct aaagaccctg gtggtgaaga ttgtgggttg cattgctgca gtatcatcat661 cattgcatgt gggaaaagct ggtcctctag tacacacagg tgcatgcatt gcatctatac721 ttggacaagg tgggtcaagt aaatatcacc tgacatgtaa atggctaagg tacttcaaga781 atgataggga ccgaagggac cttgttactt gtggtgctgg tgctggtatt gctgctgctt841 tccgggcacc agttggtgga gtcctgtttg ctcttgaagc agtgtcttca tggtggagga901 gtgccctact ctggcgagca tttttcacaa cagcaatggt tgctgttgtg cttagggcat961 tgatagactt ctgcaaaagt gacaagtgtg gcttgtttgg gaaaggtgga cttataatgt1021 ttgatgtgac ttcagattac atcacctacc atttggtcga tttaccgcca gtaatcactc1081 taggagttct tggtggagta ctaggaagct tgcacaactt tttcctggac aaggttcttc1141 gtctctacaa ttttattaac gagaaagggc aaaagtacaa gctgctcctg gctgcagtag1201 tcaccatttg tacatcctgt tgtctcttcg gcttgccatg gattgcttct tgcaaacctt1261 gtccaagtga caccgaagaa gcctgtccat ccataggaag atctggtaat tttaagaagt1321 atcagtgtgc aatgaatgag tacaatgact tagctagcct gttcttcaac accaacgatg1381 acaccattag aaacctttac agtgctggca ctgatgatga attccatatc tcttcaatac1441 ttgtcttctt cttcacatcg tatttcctgg gcattttcag ctatggcctt gctttaccat1501 ccggcctttt tgtgccagtt attttgacag gtgcaactta tggccgcctt gttggcatgt1561 taattgggtc ccaatcaaca ttagatcatg gcctttttgc agttcttggc tctgctgccc1621 ttctaggagg atcaatgaga atgactgtct cagtttgtgt cgtcatccta gagctgacta1681 ataatttact tatgcttcct ttggttatgc tggtccttct catatcgaag acagtggcag1741 atgcttttaa tgcaaatatt tatgatttgc ttgttaaatt gaaaggattt ccttatctcg1801 aaggccatgt tgaaccttac atgaggcaat tgtctgtcag tgatgttgta actggtcctc1861 tacaggcatt caatggcata gagaaggttg gccatatagt gcatgtctta aggacaactg1921 gacataatgg ttttcctgtt gttgatgagc caccattttc agattctcct gtcttatttg1981 gtctagttct tagagcccac ttgcttgttc tgctgagaaa gaaagatttc attcctaact2041 gctcagcttc agcactggat gcttccaagc aattcttgcc tcatgatttt gctaaacctg2101 gctcaggaaa gcatgacaga atagaggaaa tagaattcag tgcagaagaa ctggaaatgt2161 tcgtagattt gcatccgttc acaaacacgt ctccttacac tgtggtcgag actatgtctt2221 tggctaaggc ccatgtgctt ttccgcgaag ttggattgag gcatcttttg gttctaccaa2281 aatcgtctaa gagagcgcct gttgtaggca tactgacaag gcacgacttc atgcctgagc
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權(quán)利要求
1.一種水稻氯離子通道基因OsCLC，其特征在于該基因具有SEQ NO 7所示的堿基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻氯離子通道基因OsCLC編碼蛋白，其特征在于具有SEQ NO 8所示的氨基酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻氯離子通道基因OsCLC的克隆方法，其特征在于該方法具有如下步驟a.水稻的分化愈傷組織的培養(yǎng)；b.水稻氯離子通道基因OsCLC的克隆采用Trizol法提取步驟a中所得的水稻分化愈傷組織的總RNA，以該總RNA為模板，采用Oligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；再經(jīng)PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR的反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min→(94℃30s，62℃40s，72℃150s)×35循環(huán)→72℃延伸10min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；然后將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-19-T載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)籃白斑法篩選得到陽(yáng)性克隆，該陽(yáng)性克隆即為水稻氯離子通道基因OsCLC；所采用的Oligo(dT)18引物分別為
5’端引物為5’-CGATGGCGCCAAGGGACCAGTCAT-3’，
3’端引物為5’-TACTAGCGAGCGTCAGAAGACGAG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水稻氯離子通道基因OsCLC的克隆方法，其特征在于所述的水稻的分化愈傷組織的培養(yǎng)方法的具體步驟為成熟水稻種子剝?nèi)シf殼，70％乙醇漂洗1min，0.1％升汞浸泡20min；無(wú)菌水沖洗4-5次后接種在MS+2，4-D2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于黑暗處26℃下培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；兩周后將愈傷組織置于分化培養(yǎng)基MS+6-BA 2mg/L+KT 2mg/L+NAA 0.2mg/L上，收集分化的愈傷組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃。
全文摘要
水稻氯離子通道基因OsCLC、其編碼蛋白及其克隆方法。該基因具有SEQ NO 3所示的堿基序列。該基因從水稻分化的愈傷組織中克隆達(dá)到，其全長(zhǎng)為2429bp。開(kāi)放閱讀框編碼長(zhǎng)為808個(gè)氨基酸(分子量為88kD)的蛋白質(zhì)，跨膜區(qū)分析顯示具有11個(gè)跨膜區(qū)域，聚類(lèi)分析顯示OsCLC基因?yàn)镃LC家族的新成員。該OsCLC基因的表達(dá)水平在一定時(shí)間范圍內(nèi)與鹽濃度升高呈正相關(guān)變化，能對(duì)鹽脅迫環(huán)境壓力呈現(xiàn)出表達(dá)響應(yīng)。并且該基因在酵母突變株中能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分互補(bǔ)GEF1功能，部分地抑制對(duì)NaCl的敏感，并恢復(fù)生長(zhǎng)功能；對(duì)pH值變化敏感；對(duì)不同陽(yáng)離子無(wú)敏感現(xiàn)象。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101054586SQ200710038698
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者劉志學(xué), 康敏華, 劉特, 杜喜玲 申請(qǐng)人:上海大學(xué)