專利名稱：一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及該基因在植物鉀高效利用和耐鹽性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鉀是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，廣泛分布于植物的各組織和器官，是植物細胞內(nèi)含量最豐富的一價陽離子。鉀在植物眾多生理功能中發(fā)揮著重要的作用，如維持細胞離子平衡、調(diào)節(jié)細胞膨壓、調(diào)節(jié)各種酶的活性以及參與蛋白質(zhì)合成等，維持高并且相對穩(wěn)定的鉀含量對植物生長至關(guān)重要。植物缺鉀會出現(xiàn)明顯的缺鉀癥狀，表現(xiàn)為易倒伏，葉片易失水，耐旱耐鹽性降低，葉片發(fā)黃和組織壞死等。耕地土壤缺鉀會導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降。因此，維持植物生長過程中鉀營養(yǎng)供給十分重要。我國的大部分耕地供鉀不足，其中嚴重缺鉀土地約2000萬公頃，占耕地總面積的20%以上。并且，我國鉀礦資源匱乏，鉀肥的年產(chǎn)量十分有限，缺鉀狀況嚴重影響著我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展。同時，土壤鹽潰化是一個全球性的生態(tài)問題。過量的鈉離子對植物的成長具有毒害作用，大部分農(nóng)作物在鹽脅迫狀態(tài)下不能正常生長，表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，發(fā)芽率降低，器官生長和分化受到抑制，新陳代謝減緩等癥狀。土壤鹽潰化不僅會造成糧食減產(chǎn)，也是土地荒漠化和耕地退化的主要原因之一，嚴重制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。研究表明，不同種類的植物或同種植物的不同品種對土壤缺鉀和鹽脅迫的生理反應(yīng)及對鉀的吸收利用效率存在明顯差異，并且這種差異性是可以遺傳的，說明植物這種性狀是由遺傳基因控制的。在高鹽環(huán)境下仍具有鉀吸收能力，進而維持高的K+/Na+比是決定植物的耐鹽性的關(guān)鍵因素。因此，植物鉀吸收能力與其耐鹽性息息相關(guān)。自從20世紀90年代以來，許多負責植物鉀吸收及轉(zhuǎn)運的鉀離子通道基因和鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因被相繼克隆和鑒定。其中，鉀離子通道在植物鉀吸收中起著重要的作用，研究鉀離子通道基因，為我們深入認識和理解作物體內(nèi)鉀的吸收及利用機制，進而提高鉀的有效利用率具有積極的作用。目前，已有一些植物的鉀離子通道被克隆并鑒定出來，如OsAKTl (水稻)，AKTl (擬南芥)，ZMK1 (玉米)，MIRK(甜瓜)和MKTl (冰葉日中花)等。然而這些基因大部分來自甜土植物，并且多數(shù)對Na+敏感，其中包括來自鹽生植物的MKTl。在土壤既缺鉀又有鹽潰化的情況下，只有對Na+不敏感的鉀轉(zhuǎn)運蛋白才能正常發(fā)揮功能，使轉(zhuǎn)基因作物既耐低鉀又耐鹽，因此考慮從真鹽生植物鹽角草中分離對Na+不敏感的鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因。所以，本專利采用雙子葉鹽生植物鹽角草為實驗材料。 鹽角草(Salicornia europaea): —年生雙子葉草本植物,藜科鹽角草屬，一般生于鹽堿地、鹽湖旁及海邊。鹽角草屬植物是迄今為止報道過的地球上最耐鹽的陸生高等植物類群之一，其在600mM鹽濃度條件下也能吸收鉀離子，維持植物正常生長。(鹽角草種子采于大連市營城子海邊的鹽堿地，并于實驗室中種植，用含300mM NaCl的l/2Hoagland營養(yǎng)液定期灌溉。自然條件下培養(yǎng))。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明公開一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼蛋白及該基因在植物鉀吸收及耐鹽性方面的應(yīng)用。該基因是從鹽角草中分離出來的，具有K+吸收功能，是一種雙親和性鉀通道蛋白。這預(yù)示著它在農(nóng)作物鉀高效利用方面的應(yīng)用價值，可減少鉀肥的施用，從而降低生產(chǎn)成本。該基因能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在缺鉀及鹽脅迫條件的K+吸收能力，同時減少對Na的攝入，提聞了 K /Na ,從而提聞了植物的耐鹽性。這種提聞轉(zhuǎn)基因植物的耐土壤低鉀和耐鹽的特性，可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物上，從而應(yīng)對日益嚴重的土壤缺鉀和鹽潰化問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:本發(fā)明的目的之一在于提供具有鉀吸收功能的鉀離子通道蛋白基因，該基因是從鹽角草中分離出來的，具有下列核苷酸序列之一:①該基因具有序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列；②該基因與序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性，且編碼相同蛋白質(zhì)的堿基序列。本發(fā)明的目的之二在于提供了具有上文所述鉀離子通道蛋白的編碼蛋白，該蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基序列組成；且提供了該鉀離子通道蛋白的衍生蛋白質(zhì)，即由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而產(chǎn)生的具有相同的生物學(xué)功能的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明的目的之三在 于提供一種重組表達載體，該重組表達載體上含有上文所述的鉀離子通道蛋白基因；且在優(yōu)選的技術(shù)方案中，是以PBI121作為表達載體，本發(fā)明的實施例中，具體公開了重組載體的構(gòu)建方法和鑒定方法。本發(fā)明的目的之四在于提供一種含有上文所述重組表達載體的宿主細胞；且在優(yōu)選的技術(shù)方案中，該宿主細胞為根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株，本發(fā)明的實施例中，具體公開了根癌農(nóng)桿菌GV3101為宿主菌的實驗方法。本發(fā)明的目的之五在于提供上文所述的鉀離子通道蛋白基因在提高轉(zhuǎn)基因植物在不同鉀濃度環(huán)境下K+的利用率方面的應(yīng)用；以及該基因在提高轉(zhuǎn)基因植物在低鉀和鹽脅迫環(huán)境下K+的利用率和耐鹽性方面的應(yīng)用；尤其在優(yōu)選的技術(shù)方案中，該基因在改良擬南芥性狀中有較好的應(yīng)用效果?？傊?，本發(fā)明的基因SeAKTl具有鉀離子通道蛋白的功能，本發(fā)明的實施例證明它能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在3mmol和100 μ mo I濃度K+環(huán)境下的K+吸收效率和在缺鉀、鹽脅迫下的K+吸收能力，提高K+/Na+，進而提高植物鉀利用效率及耐鹽性，同時也預(yù)示著它在農(nóng)作物鉀高效利用和耐鹽性方面的應(yīng)用價值。


圖1為SeAKTl基因克隆PCR電泳圖。其中，A為保守區(qū)部分片段克隆；B為3’端部分片段克隆；C為5’端部分片段克??；D為ORF全長PCR電泳圖。Ml:DL2000marker ；M2:λ -EcoT14marker。圖中結(jié)果顯示:A:克隆所得保守區(qū)片段長度約為750bp ；B:克隆所得3’端片段約為2000bp ；C:克隆所得5’端片段長度約為800bp ；D =SeAKTl開放性閱讀框長度為2577bp。將上述克隆所得序列測序后進行blast比對，結(jié)果表明所得片段均與Shaker家族鉀離子通道基因存在較高同源性。圖2為本發(fā)明的SeAKTl基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)圖。圖中結(jié)果顯示該基因具有S1-S6六個跨膜結(jié)構(gòu)域，cNMP結(jié)合位點及ANK結(jié)構(gòu)域。從而表明SeAKTl是典型的Shaker家族內(nèi)向整流型鉀離子通道。圖3為本發(fā)明的鉀通道蛋白SeAKTl疏水性分析圖。圖中結(jié)果顯示該蛋白具有S1-S6六個跨膜結(jié)構(gòu)域，cNMP結(jié)合位點及ANK結(jié)構(gòu)域，從而表明SeAKTl是一個跨膜蛋白，并具有Shaker家族鉀離子通道蛋白的一般結(jié)構(gòu)特征。圖4為本發(fā)明的SeAKTl基因編碼的蛋白的進化分析圖。圖中結(jié)果顯示該基因與AKTl亞族中的Mktpl和NKTl等親緣關(guān)系較近，表明該編碼蛋白屬于鉀離子通道蛋白家族的AKTl亞族。(鉀離子通道SeAKTl的氨基酸序列采用ClustalX程序預(yù)測，并采用MEGA5軟件構(gòu)建進化樹。AKT1/2/5, KATI/2, AtKCl 和 G0RK/SK0R-擬南芥；SPIK, PeKCl/2-楊樹；NKTl-煙草；RCAKTl/2/3/6-蓖麻；Mktpl-冰葉日中花；DKT1-胡蘿卜；LKT1-西紅柿；TaAKTl-小麥；ΗνΑΚΤ1-大麥；PutAKTl_ 星星草；0sAKTl，0sKT2-水稻。)·
圖5為不同處理下，SeAKTl半定量RT-PCR電泳圖。其中A為不同處理下幼苗中SeAKTl表達情況；B為不同處理下成苗中SeAKTl表達情況。其中A圖中1:未處理；2:缺鉀處理；3:100mM NaCl處理；4:缺鉀+IOOmM NaCl處理。B圖中1:未處理；2:缺鉀處理；3:700mM NaCl處理；4:缺鉀+700mM NaCl處理。結(jié)果表明，在缺鉀情況下幼苗和成苗中表達量均有所上調(diào)，尤其是幼苗中上調(diào)幅度尤為明顯；在缺鉀+鹽脅迫處理的情況下，幼苗(缺鉀+IOOmM Na+)和成苗(缺鉀+700mM Na+)中表達量都有所增加；在幼苗中IOOmMNa+處理下表達量上升而成苗中700mMNa+處理下表達量略有下調(diào)。據(jù)報道，AKTl類的鉀離子通道(如:MKTl、OsAKTl、AKTl)在外部濃度為400mM，150mM或者50mM的時候表達量劇烈下調(diào)，而SeAKTl在IOOmMNa+處理下的鹽角草幼苗中表達量上升，在700mMNa+處理下成苗中表達量只略微下降，相比之下具有明顯優(yōu)勢。圖6為重組植物表達載體pBI121_SeAKTl的結(jié)構(gòu)圖譜。表明該基因可在35S啟動子的調(diào)控下組成型表達，重組載體具有卡那霉素抗性。圖7為轉(zhuǎn)SeAKTl基因擬南芥植株的卡那霉素篩選圖。a:野生型擬南芥未加卡那霉素篩選；b:轉(zhuǎn)基因擬南芥加卡那霉素篩選；c:野生型擬南芥加卡那霉素篩選；圖示的結(jié)果證明轉(zhuǎn)SeAKTl基因陽性苗具有卡那霉素抗性，可在卡那霉素下正常生長；而野生型擬南芥則只長出兩片子葉，無法繼續(xù)長出真葉，并逐漸枯萎變黃，直至死亡。圖8為本發(fā)明SeAKTl基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同處理條件下的K+、Na+含量及K+/Na+情況。WT:野生型擬南芥；SeAKTl:轉(zhuǎn)SeAKTl基因擬南芥；Control:正常MS培養(yǎng)基；_K:缺K+MS培養(yǎng)基；+Na:75mM Na+MS培養(yǎng)基；_K/+Na:缺K++75mM Na+MS培養(yǎng)基。結(jié)果顯示:與對照組相比，處理條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥根和冠(地上部分)中鉀含量均有所下降，但轉(zhuǎn)SeAKTl基因擬南芥中鉀含量下降幅度更小一些；在Na+脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥中的Na+含量均有較大幅度的升高，但相對而言，轉(zhuǎn)基因擬南芥根和冠中的Na+含量均低于野生型擬南芥；與對照組相比，在不同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因和對照擬南芥根部和冠中的K+/Na+均有明顯降低，但轉(zhuǎn)基因擬南芥的K+/Na+要明顯高于野生型擬南芥。表明SeAKTl基因可以使脅迫條件下的轉(zhuǎn)基因擬南芥吸收更多的K+，并且減少對Na+的攝入，從而使細胞內(nèi)維持相對較高的K+/Na+，保證植株正常生長代謝，提高了植物的耐低鉀和耐鹽性。圖9為本發(fā)明SeAKTl基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在3mmol濃度K+環(huán)境下的K+耗竭實驗。圖中結(jié)果顯示在3mmol濃度K+環(huán)境下，轉(zhuǎn)SeAKTl基因擬南芥耗竭液中K+濃度下降的更快，并且終濃度更低。表明轉(zhuǎn)基因擬南芥在毫摩爾濃度K+環(huán)境下K+吸收效率有所提高。圖10為本發(fā)明SeAKTl基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在100 μ mol濃度K+環(huán)境下的K+耗竭實驗。圖中結(jié)果顯示在100 μ mol濃度K+環(huán)境下，轉(zhuǎn)SeAKTl基因擬南芥耗竭液中K+濃度下降的更快，并且終 濃度更低。表明轉(zhuǎn)基因擬南芥在微摩爾濃度K+環(huán)境下K+吸收效率有所提聞。
具體實施方式
:下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。下面實施例中未注明具體實驗條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件或分子克隆中所述條件，或按照產(chǎn)品說明書上所提供的條件。下面是實例中所用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例一 SeAKTl基因cDNA的克隆與分析一鹽角草總RNA提取稱取50mg新鮮鹽角草組織，于液氮中研磨成粉末，將研磨好的材料迅速轉(zhuǎn)移至含有Iml trizol試劑的離心管中，震蕩混勻；加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置5min ；4° C12000r/min, 10_15min，取上清；將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫IOmin ；4° C, 12000r/min,離心IOmin ;棄上清,加入Iml冰預(yù)冷的70%乙醇(新鮮配制)，洗漆沉淀；4° C, 7500r/min, 5min ;棄上清,室溫晾干(勿太干),加入20 μ I RNase-freeddH20,充分溶解RNA，-70 ° C保存?zhèn)溆谩?%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取的質(zhì)量。結(jié)果呈現(xiàn)了 28S、18S、5S三種典型的RNA帶型，各條帶清晰，無明顯的拖尾現(xiàn)象，表明提取的RNA無明顯降解，可進一步用于RT-PCR實驗。二單鏈cDNA的獲得以提取的鹽角草總RNA為模板(500ng),按照寶生物Reverse TranscriptaseM-MLV反轉(zhuǎn)錄說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到的單鏈cDNA可直接用于2nd_Strand cDNA的合成或者PCR擴增等。三鹽角草SeAKTl基因部分編碼區(qū)的獲得①簡并引物設(shè)計。根據(jù)NCBI上提供的冰葉日中花、煙草、擬南芥、水稻和大麥等植物的AKTl家族基因序列進行同源性比對，在其高度保守區(qū)設(shè)計一對簡并引物AKF (SEQ IDN0.1) /AKR (SEQ ID N0.2)。此簡并引物中 Y=C/T，D=A/G，W=A/T，R=A/G。②PCR擴增。以反轉(zhuǎn)錄獲得的單鏈cDNA為模板，AKF (SEQ ID N0.1)和AKR (SEQID N0.2)為引物，PCR擴增SeAKTl通道基因部分編碼區(qū)。反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.一種鉀離子通道蛋白基因，其特征在于，該基因具有下列核苷酸序列之一: ①該基因具有序列表中SEQID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列； ②該基因與序列表中SEQID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性，且編碼相同蛋白質(zhì)的堿基序列。
2.—種鉀離子通道蛋白，其特征在于，該蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基序列組成。
3.—種鐘尚子通道蛋白衍生蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而產(chǎn)生的具有相同的生物學(xué)功能的衍生蛋白質(zhì)的氨 基酸序列。
4.一種含有權(quán)利要求1所述的鉀離子通道蛋白基因的重組表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，其表達載體為PBI121。
6.一種含有權(quán)利要求4或5所述重組表達載體的宿主細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞為根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株。
8.如權(quán)利要求1所述的基因在提高轉(zhuǎn)基因植物在不同鉀濃度環(huán)境下K+的利用率方面的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1所述的基因在提高轉(zhuǎn)基因植物在低鉀和鹽脅迫環(huán)境下K+的利用率和耐鹽性方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼蛋白及該基因在植物鉀吸收及耐鹽性方面的應(yīng)用。本發(fā)明的基因來源于鹽角草，命名為SeAKT1，該基因具有K+吸收功能，能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在3mM和100μM K+環(huán)境中K+利用率，是一種雙親和性鉀通道蛋白。這預(yù)示著它在農(nóng)作物鉀高效利用方面的應(yīng)用價值，可減少鉀肥的施用，從而降低生產(chǎn)成本。該基因也能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在缺鉀及鹽脅迫條件的K+吸收能力，同時減少對Na+的攝入，提高了K+/Na+，從而提高了植物的耐鹽性。這種提高轉(zhuǎn)基因植物的耐土壤低鉀和耐鹽的特性，可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物上，從而應(yīng)對日益嚴重的土壤低鉀和鹽漬化問題。
文檔編號A01H5/00GK103215279SQ20131015047
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者蘇喬, 商玲 申請人:大連理工大學(xué)