專利名稱：人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制性蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(Calcium/Calmodulin-DependentProtein Kinase II Inhibitor，簡稱為CaM-KIIN”)多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發(fā)明還涉及CaM-KIIN對細胞生長的抑制活性。本發(fā)明的CaM-KIIN是一種新的與細胞增殖、生長以及細胞周期信號有關(guān)的細胞內(nèi)可溶性蛋白。
背景技術(shù)：
鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMK II)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的一個重要組成部分，是Ca2+/CaM調(diào)節(jié)蛋白家族中的一個主要成員。CaMK II是CaM的重要靶酶之一，許多酶或蛋白質(zhì)都可以作為它的底物。CaMK II由α，β，γ，δ四種亞單位組成，編碼十多種同功酶。幾乎所有的亞單位都包含有催化區(qū)、調(diào)節(jié)區(qū)和結(jié)合區(qū)，調(diào)節(jié)區(qū)又是由自身抑制區(qū)(281-309)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)(296-311)和自身磷酸化位點(蘇氨酸286，305，306；絲氨酸314)組成。
CaMK II主要存在于神經(jīng)組織，在某些區(qū)域可占總蛋白量的2％(如鼠的海馬回)。除此以外，在哺乳動物的骨骼肌、心臟、肺、肝臟、胰腺、視網(wǎng)膜、腎、甲狀旁腺、乳腺、子宮、睪丸、小腸的刷狀緣等組織中都可檢測到。CaMK II的亞單位分布因組織而異，α和β亞單位只存在于神經(jīng)組織，而γ和δ亞單位可存在于除腦以外的其它組織中。隨著對CaMK II的結(jié)構(gòu)、組織分布和生物學功能研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)CaMK II在多種生物學事件中均發(fā)揮重要功能。它在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動，肌肉的收縮，細胞周期的控制，細胞的分泌，DNA損傷的修補，碳水化合物的代謝，基因的表達等方面有著重要的生物學作用。
CaMK II的抑制劑是研究CaMK II生理功能的有效途徑之一。CaMK II的抑制劑有多種，主要有化學合成的抑制劑KN-62、KN-93、KN-92以及生物合成的抑制性多肽AIP。目前報道的天然的內(nèi)源性抑制性蛋白僅有大鼠腦細胞來源的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN β和CaM-KIIN α。人源的內(nèi)源性抑制性蛋白及其生物學功能和應(yīng)用則未見國內(nèi)外報道。
已知的大鼠來源的內(nèi)源性CaMK II抑制性蛋白CaM-KIIN β和CaM-KIIN α具有特異性抑制CaMK II活性的能力?；瘜W合成的CaMK II抑制劑KN-62、KN-93的作用是通過與CaM結(jié)合位點的相互作用，阻止CaM與CaMK II的結(jié)合，使得CaMK II不能自身磷酸化而不被激活。對于細胞的生理功能，二者可以以劑量依賴性方式阻止細胞的生長，引起細胞周期G1或S相的阻滯，從而導致細胞發(fā)生凋亡。KN-62還可以克服人卵巢癌細胞對于一種抗腫瘤藥(阿霉素)的抵抗，在腫瘤治療方面有著重要的作用。CaMK II抑制性劑的這種特異性抑制CaMK II活性的能力提示這些物質(zhì)可能參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用，由此成為抗腫瘤治療的效應(yīng)物。
研究已表明，鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白與多種生命活動相關(guān)。因此，為診斷和治療目的研究和開發(fā)新的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白有重要意義。然而，目前為止卻仍然沒有發(fā)現(xiàn)人的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(CaM-KIIN蛋白)以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了新型的人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN，它與已知大鼠來源的同源蛋白有極高的同源性。與化學性抑制劑對細胞的作用相似，人源CaM-KIIN可以阻遏細胞增殖，具有細胞生長抑制活性。因此，可以人源CaM-KIIN與其他抑制劑一樣可以通過特異性結(jié)合CaMKII，阻止CaMK II的磷酸化激活，調(diào)控多種生理和病理活動，發(fā)揮重要作用，并可能在抗感染、抗炎癥反應(yīng)、抗腫瘤以及神經(jīng)生長修復、免疫功能調(diào)節(jié)等多個領(lǐng)域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發(fā)和應(yīng)用價值。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的CaM-KIIN多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少80％相同性(a)編碼上述人CaM-KIIN的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中179-415位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-591位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人CaM-KIIN蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人CaM-KIIN蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人CaM-KIIN蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人CaM-KIIN多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-591個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人CaM-KIIN多肽活性的化合物，以及抑制人CaM-KIIN多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人CaM-KIIN多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaM-KIIN蛋白的方法，它包括將樣品與CaM-KIIN蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在CaM-KIIN蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人CaM-KIIN多肽異常表達相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人CaM-KIIN多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人CaM-KIIN多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人CaM-KIIN蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人CaM-KIIN多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明的人CaM-KIIN的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫常規(guī)字母表示。
圖2是本發(fā)明的人CaM-KIIN蛋白的全長氨基酸序列。
圖3是本發(fā)明的人CaM-KIIN蛋白與大鼠來源其他鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人CaM-KIIN，下方序列是大鼠來源的CaM-KIIN蛋白。相同的氨基酸在多個序列之間用黑體標出，相似的氨基酸用灰體標出。
圖4是本發(fā)明的人CaM-KIIN RT-PCR表達分析圖譜。提示CaM-KIIN表達于某些腫瘤細胞中；在人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞成熟并受KLH刺激的活化過程中具有一定的表達模式。
圖5是本發(fā)明的人CaM-KIIN Northern印跡雜交所顯示的分布圖。提示CaM-KIIN是一種在特定組織分布的分子。
圖6是本發(fā)明的人CaM-KIIN轉(zhuǎn)染細胞的光鏡觀察照片。提示其具有細胞生長抑制活性。
圖7是本發(fā)明的人CaM-KIIN轉(zhuǎn)染細胞的細胞增殖分析實驗。提示其具有細胞生長抑制活性。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，術(shù)語“CaM-KIIN蛋白”、“CaM-KIIN多肽”或“鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白”可互換使用，都指具有人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的CaM-KIIN蛋白或多肽”是指CaM-KIIN多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化CaM-KIIN蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人CaM-KIIN蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人CaM-KIIN蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人CaM-KIIN多肽”指具有人CaM-KIIN蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人CaM-KIIN蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-20個，更佳地1-10個，最佳地1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人CaM-KIIN蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人CaM-KIIN DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人CaM-KIIN多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人CaM-KIIN多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人CaM-KIIN多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人CaM-KIIN多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約70個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人CaM-KIIN蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CaM-KIIN多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人CaM-KIIN蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人CaM-KIIN核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或CaM-KIIN蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的CaM-KIIN多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人CaM-KIIN多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人CaM-KIIN多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人CaM-KIIN編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人CaM-KIIN蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療CaM-KIIN蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或?qū)笴aM-KIIN蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人CaM-KIIN蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人CaM-KIIN蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人CaM-KIIN DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CaM-KIIN基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CaM-KIIN基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CaM-KIIN蛋白的分子，也包括那些并不影響人CaM-KIIN蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人CaM-KIIN基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人CaM-KIIN基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人CaM-KIIN蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CaM-KIIN蛋白功能的抗體以及不影響人CaM-KIIN蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CaM-KIIN基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CaM-KIIN基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人CaM-KIIN蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的人CaM-KIIN蛋白。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人CaM-KIIN蛋白相關(guān)的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人CaM-KIIN蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人CaM-KIIN蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人CaM-KIIN蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人CaM-KIIN蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CaM-KIIN蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如配體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤等方面的治療。在使用本發(fā)明CaM-KIIN蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明CaM-KIIN多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的CaM-KIIN蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CaM-KIIN蛋白的無表達或異常/無活性的CaM-KIIN蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達變異的CaM-KIIN蛋白，以抑制內(nèi)源性的CaM-KIIN蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將CaM-KIIN基因轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶CaM-KIIN基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人CaM-KIIN基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
抑制人CaM-KIIN mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
能與人CaM-KIIN蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人CaM-KIIN蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人CaM-KIIN蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人CaM-KIIN蛋白水平，可以用作解釋人CaM-KIIN蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷CaM-KIIN蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在CaM-KIIN蛋白的方法是利用CaM-KIIN蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與CaM-KIIN蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在CaM-KIIN蛋白。
CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸可用于CaM-KIIN蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸可用于檢測CaM-KIIN蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下CaM-KIIN蛋白的異常表達。如CaM-KIINDNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷CaM-KIIN蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CaM-KIIN蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測CaM-KIIN蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測CaM-KIIN基因的突變也可用于診斷CaM-KIIN蛋白相關(guān)的疾病。CaM-KIIN蛋白突變的形式包括與正常野生型CaM-KIIN DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明CaM-KIIN蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為591個堿基，其開放讀框位于179-415位，編碼全長為79個氨基酸的人CaM-KIIN蛋白(SEQ IDNO2)。該CaM-KIIN蛋白屬于鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白家族分子，與大鼠來源的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白alpha(CaM-KIIN alpha)和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白beta(CaM-KIIN beta)氨基酸序列高度同源，其中與CaM-KIIN beta一致性和相似性可高達98％，與CaM-KIIN alpha一致性為65％，相似性則為78％。人CaM-KIIN蛋白質(zhì)分子量為8.6kDa，等電點5.16。RT-PCR分析表明，CaM-KIIN在某些腫瘤細胞中有表達，同時在非成熟、成熟以及經(jīng)抗原KLH刺激的外周血單核細胞來源的樹突狀細胞中存在不同程度的表達。Northern印跡分析表明在腎臟、肝臟、心臟、骨骼肌和胎盤等組織中，以及HeLa細胞S3、MOLT-4、Raji和K-562細胞系中具有特定表達。細胞生長實驗證實CaM-KIIN能夠阻遏細胞增殖，具有細胞生長抑制活性。已進行的研究提示，CaM-KIIN可能與其他抑制劑一樣可以通過特異性結(jié)合CaMK II，阻止CaMK II的磷酸化激活，調(diào)控多種生理和病理活動，發(fā)揮重要作用，并可能在抗感染、抗炎癥反應(yīng)、抗腫瘤以及神經(jīng)生長修復、免疫功能調(diào)節(jié)等多個領(lǐng)域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發(fā)和應(yīng)用價值。因此，CaM-KIIN蛋白或其相關(guān)的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人CaM-KIIN cDNA的克隆用Trizol試劑(Life Technologies公司)提取人樹突狀細胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptII克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α細菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II Inhibitor，CaM-KIIN)，其編碼基因命名為人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白基因，即CaM-KIIN基因。
CaM-KIIN的序列SEQ ID NO1全長為591bp(圖1)，包括178bp的5′端非編碼區(qū)和173bp的3′端非編碼區(qū)，編碼區(qū)為179-415位，編碼含79個氨基酸的多肽(圖2)。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為8.6kD。
BLAST分析表明其與大鼠來源的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN beta高度同源，一致性和相似性可高達98％(圖3)；與大鼠來源的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN alpha一致性為65％，相似性則為78％(圖3)。這編碼人CaM-KIIN屬于鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白家族分子。
實施例2用RT-PCR方法獲得人CaM-KIIN編碼序列及對細胞表達的分析(1)用RT-PCR方法獲得人CaM-KIIN編碼序列用Trizol試劑提取處于對數(shù)生長期相應(yīng)細胞系、人外周血單核細胞及經(jīng)LPS刺激不同時間的人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞總RNA，取5μg細胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合，進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增CaM-KIIN所用的引物如下有義引物5′ATGTCCGAGATCCTGCCCTA(SEQ ID NO3)，反義引物5′TGGTGCTGAAGCGGACAGCT(SEQID NO4)，同時以β-肌動蛋白作為陽性對照。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，擴增參數(shù)為95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，28個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。對擴增產(chǎn)物的DNA序列進行測序，結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的179-591完全相同。
(2)用RT-PCR方法對CaM-KIIN細胞表達的分析取不同組織和細胞，按上述相同反應(yīng)條件進行RT-PCR，獲得人CaM-KIINRT-PCR表達分析圖譜(圖4)。結(jié)果提示。CaM-KIIN表達于某些腫瘤細胞中，如MCF-7、A172、HeLa、SMMC7721、PC-3、A549、THP-1、U937、Jurkat、Raji、Daudi細胞系；在人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞成熟并受KLH刺激的活化過程中具有一定的表達模式；在人外周血來源的T、B細胞中未見表達。
實施例3人CaM-KIIN的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預雜交30分鐘；將標記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結(jié)果顯示在腎臟、肝臟、心臟、骨骼肌和胎盤(5.2kb)中，以及腦(1.65kb)等許多正常組織中有不同程度表達；在HeLa細胞S3、淋巴母細胞白血病MOLT-4、Burkitt淋巴瘤Raji和慢性髓系白血病K-562細胞系(5.2kb)中，以及HeLa cell S3和Burkitt淋巴瘤Raji(1.65kb)等腫瘤細胞系中有不同程度的表達(圖5)。這表明CaM-KIIN蛋白是一種特定表達的蛋白。
實施例4CaM-KIIN的細胞生長抑制活性將含全長CaM-KIIN的質(zhì)粒DNA以LipofectAMINE試劑(Life Technologies公司)轉(zhuǎn)染LoVo細胞，以未轉(zhuǎn)染組做為空白對照組(control)，以pcDNA3.1質(zhì)粒載體作為模擬對照組(mock)。轉(zhuǎn)染后24、48和72小時進行鏡下觀察在鏡下觀察細胞生長狀態(tài)并拍照。
結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)染24小時后LoVo細胞表現(xiàn)為伸展較差，細胞發(fā)生皺縮，胞漿內(nèi)的顆粒增多；轉(zhuǎn)染48小時后，細胞貼壁不牢，大量的細胞懸浮且有很多死細胞出現(xiàn)；轉(zhuǎn)染72小時后，可見有大量的LoVo細胞死亡，存活的LoVo細胞極少且形態(tài)非常不規(guī)則?？瞻讓φ战M和模擬對照組細胞轉(zhuǎn)染前后在形態(tài)上沒有顯著差異。這表明，CaM-KIIN對細胞生長有抑制活性。
實施例5CaM-KIIN的細胞生長抑制活性檢測如實施例4，將含全長CaM-KIIN的質(zhì)粒DNA以LipofectAMINE試劑(LifeTechnologies公司)轉(zhuǎn)染HeLa細胞和LoVo細胞，以未轉(zhuǎn)染組做為空白對照組(control)，以pcDNA3.1質(zhì)粒載體作為模擬對照組(mock)。轉(zhuǎn)染后0、24、48和72小時進行細胞增殖的MTT檢測(噻唑南比色法檢測)，結(jié)果表示為OD值對時間的曲線。
結(jié)果如圖7A和7B所示，轉(zhuǎn)染人全長CaM-KIIN cDNA后，LoVo細胞的增殖曲線比空白對照組和模擬對照組顯著降低。LoVo細胞在轉(zhuǎn)染24小時后增殖曲線即呈明顯下降趨勢，48小時后實驗組的細胞數(shù)大約是空白對照組和模擬對照組的一半，72小時后又僅為1/3。LoVo細胞空白對照組和模擬對照組的增殖曲線沒有顯著差異。HeLa細胞在轉(zhuǎn)染人全長CaM-KIIN cDNA前、后沒有明顯變化。
實施例6CaM-KIIN的重組表達在該實施例中，以實施例2中獲得的RT-PCR擴增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人CaM-KIIN DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-ACGAATTCCCATGTCCGAGATCCTGC-3’(SEQ ID NO5)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是人CaM-KIIN的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-ACGAATTCGCACTCCGGACGGCGGCT-3’(SEQ ID NO6)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點和人CaM-KIIN的部分編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRI酶切再與質(zhì)粒pGEM-3ZF按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人CaM-KIIN cDNAEcoR I酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成形成載體pGEX-2T-人CaM-KIIN，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。陽性克隆用EcoRI酶切鑒定，正向克隆用BamH I酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測序證實，已插入了所設(shè)計的CaM-KIIN編碼序列。
挑表達CaM-KIIN的陽性BL21克隆接種于100ml 2×YTA培養(yǎng)基中，37℃ 300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復洗脫2-3次，得到人CaM-KIIN蛋白。
用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端10個氨基酸與SEQ IDNO2所示的N-端10個氨基酸殘基完全相同。
實施例7抗CaM-KIIN抗體的制備將實施例6中獲得的重組蛋白人CaM-KIIN用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人CaM-KIIN基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>第二軍醫(yī)大學免疫學研究所<120>人鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白及用途<130>013728<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>591<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(179)..(415)<400>1cggcccggga ggcggaggcg cgggggagga ggccccgctt ggctcctcag ccccggatgc 60tgcatgactt catccttccg ccggctcccc tgctgaggta gggccggtcc ggcagcaagc120ccgccgcccg cgccccgccg cagtcccgct cccgccccgc gcccaccccg cgcccgcc 178atg tcc gag atc ctg ccc tac agc gaa gac aag atg ggc cgc ttc ggc 226Met Ser Glu Ile Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Lys Met Gly Arg Phe Gly1 5 10 15gca gac ccc gag ggc tcc gac ctc tcc ttc agc tgc cgc ctg cag gac 274Ala Asp Pro Glu Gly Ser Asp Leu Ser Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp20 25 30acc aac tcc ttc ttc gcg ggc aac cag gcc aag cga ccc ccc aag ctg 322Thr Asn Ser Phe Phe Ala Gly Asn Gln Ala Lys Arg Pro Pro Lys Leu35 40 45ggc cag atc ggc cga gcc aag cga gtg gtg atc gag gat gac cgg ata 370Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile50 55 60gac gac gtg ctg aag ggg atg ggg gag aag ccg ccg tcc gga gtg 415Asp Asp Val Leu Lys Gly Met Gly Glu Lys Pro Pro Ser Gly Val65 70 75tagacgcgcc ggctcgggcg gcgggctccg ggcccagcct cgcagcggcc aggagcgcgg475gccggcgatg cggctgccgg cgcccccccg ccccggccca ggcgcccgcg ggcgggggct535gcagggccgt gccgccgccg ccgccaggca ctccggagct gtccgcttca gcacca591<210>2<211>79<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Glu Ile Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Lys Met Gly Arg Phe Gly1 5 10 15Ala Asp Pro Glu Gly Ser Asp Leu Ser Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp20 25 30Thr Asn Ser Phe Phe Ala Gly Asn Gln Ala Lys Arg Pro Pro Lys Leu35 40 45Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile50 55 60Asp Asp Val Leu Lys Gly Met Gly Glu Lys Pro Pro Ser Gly Val65 70 75<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>3atgtccgaga tcctgcccta20<210>4<211>20<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>4tggtgctgaa gcggacagct 20<210>5<211>26<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>5acgaattccc atgtccgaga tcctgc 26<210>6<211>26<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>6acgaattcgc actccggacg gcggct 2權(quán)利要求
1.一種分離的人CaM～KIIN多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少80％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中179-415位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-591位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有人CaM-KIIN多肽活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達人CaM-KIIN多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人CaM-KIIN多肽活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人CaM-KIIN多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(Calcium/Calmodulin－DependentProtein Kinase II Inhibitor，CaM－KIIN)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了這種新型鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白及其編碼序列的用途。本發(fā)明還證實了CaM－KIIN能夠抑制細胞生長。本發(fā)明還公開了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略，特別是可用于癌癥治療。
文檔編號C12N15/10GK1394873SQ0111335
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月11日
發(fā)明者李楠, 章衛(wèi)平, 張君, 曹雪濤 申請人:第二軍醫(yī)大學免疫學研究所