專利名稱：一種土壤dna樣品制備試劑盒及其制備方法
一種土壤DNA樣品制備試劑盒及其制備方法技術(shù)領(lǐng)蜮本發(fā)明涉及一種土壤DM樣品制備試劑盒及其制備方法，用于變 性梯度凝膠電泳分析土壤細(xì)菌多樣性的DM樣品的制備，屬于DNA分 析技術(shù)領(lǐng)域.背景技術(shù)目前，變性梯度凝膠電泳是使用最為廣泛的土壤細(xì)菌多樣性分析 方法，用于變性梯度凝膠電泳的DM樣品制備過程包括土壤總DNA的 提取、純化以及目標(biāo)DNA的擴(kuò)增。然而土壤DM提取和純化工藝復(fù)雜， 途徑多樣，擴(kuò)增難度大，制備過程費(fèi)時費(fèi)力，結(jié)果可比性差。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)訴的發(fā)明目的是為了提供一種土壤DNA樣品制備試劑盒及其 制備方法，以克服現(xiàn)有DNA樣品制備工藝復(fù)雜、難度大、費(fèi)時費(fèi)力的本發(fā)明的發(fā)明目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。 一種土攘DM樣品制備試劑盒，包括盒體和隔板；盛有溶液I的試劑瓶A，盛有溶液n的試劑瓶B,盛有溶液in的試劑瓶c,盛有溶液IV的試劑瓶D,盛有懸液V的試劑瓶E,內(nèi)含酸洗玻璃珠的離心管F， 微型過濾器G， PCR (鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng))管H。其中，溶液I為120mmo1/1的磷酸鹽緩沖液；溶液II的配比組成 為Tris HC1 (三羥甲基氨基甲烷 鹽酸)1Ommo1/1, EDTA (乙二 胺四乙酸)lramo1/1， CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)0. 2%， pH8. 0; 溶液III為5扱o1/1的醋酸銨；溶液IV為異丙醇(純品)；懸液V的配比 組成是Sephadex G75 2% (質(zhì)量體積比)；酸洗玻璃珠0. 5g,直徑約 0. 2mm; PCR管H的體積為200 ju 1 ，內(nèi)盛有DNA引物各0. 25/a mol ， Taq酶2U， 4種dNTP (脫氧核糖核酸)各200 ia mol ， lxPCR反應(yīng)緩 沖液100ul，冷凍干燥所得。離心管F為2ml的離心管。所有試劑與耗材均經(jīng)無菌處理。所述的異丙醇保存在棕色試劑瓶中。土壤關(guān)A樣品制備步驟如下a) 選擇用于實(shí)驗(yàn)的環(huán)境土壤樣品；b) 將用于步驟a)中的農(nóng)田土壤經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后，獲得土壤中的 所有傲生物的基因組DNA;c) 將步驟b)獲得的基因組DNA純化后作為PCR擴(kuò)增的模板；d) 選擇一般用于原核生物16SrRNA ( 16S核糖體核糖核酸)基因擴(kuò) 增的通用引物對；e) 在步驟d錄擇的通用引物對的正向引物的一端加上GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)；f) 按照設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增g)將步驟f)所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為樣品保存?zhèn)溆?。通過本發(fā)明技術(shù)方案設(shè)計(jì)而成的試劑盒，具有使用簡便、結(jié)果穩(wěn) 定，可有效地節(jié)省使用者時間和成本的優(yōu)點(diǎn)。附圍說明圖i為試劉盒組成示意圖； 圖2為試刺盒操作步驟示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖
與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。1. 稱取待處理的干燥分散(如含水量高，10000g離心2分鐘，取 沉淀物備用)土壤樣品0.5g的至離心管F中，加入lml溶液I (A), 輕微旋渦震蕩混勻，2000g離心l 2min，去除上清液，重復(fù)操作一次；2. 取800ul溶液I1 (B)(注如果溶液II凝固，請置于60。C水浴 中加熱溶解)至離心管F中，劇烈旋渦震蕩2 5分鐘，10000g離心l 2 分鐘；3. 移取上清液400ul至潔凈無菌的1.5ml離心管(自備)中，加入 400ul溶液m (C) , 4'C保溫20分鐘，10000g離心5 10分鐘；4. 盡量吸取上清液至2ml離心管中(自備)，加入800ul溶液IV(D), 顛倒混合均勻，-20匸保溫20分鐘，10000g離心5 10分鐘；5. 棄上清液，加入200ulTE (Tris-EDTA)溶液(或無菌水)懸 浮沉淀物，得溶液②；6. 移取潘液②至凝膠過濾柱①中，1000g離心l分鐘，得到濾液③；7. 加入98ul無菌超純水至PCR管(H)中，加入2ul溶液③，蓋緊 蓋子(注如果所用PCR儀沒有熱蓋，再添加10ul無菌液體石蠟)；8. 將PCR管(H)放入PCR儀中，反應(yīng)溫度循環(huán)設(shè)置如下(1) 94匸變性10分鐘；(2)以下是10個循環(huán)，94。C變性l分鐘，65°C~55 'C復(fù)性1分鐘，復(fù)性溫度每個循環(huán)降低rC, 72。C延長l分鐘；(3)以 下是20個循環(huán)，94。C l分鐘，55°C l分鐘，72°C l分鐘；(4)72 'C延長8分鐘，4'C保溫。9. 得到DNA樣品④備用，-20C保存。
權(quán)利要求
1. 一種土壤DNA樣品制備試劑盒，包括盒體和隔板，其特征在于盛有溶液I的試劑瓶A，盛有溶液II的試劑瓶B，盛有溶液III的試劑瓶C，盛有溶液IV的試劑瓶D，盛有懸液V的試劑瓶E，內(nèi)含酸洗玻璃珠的離心管F，微型過濾器G，PCR(鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng))管H。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤DM樣品制備試劑盒，其特 征在于溶液I為120mmo1/1的磷酸鹽緩沖液；溶液II的配比組成為 Tris . HC1 1Ommo1/1， EDTA lmmo1/1， CTAB 0.2%, pH8. 0;溶液 III為5mo1/1的醋酸銨；溶液IV為異丙醇；懸液V的配比組成是質(zhì)量 體積比為2%的SephadexG75;酸洗玻璃珠0. 5g,直徑約0. 2mm; PCR 管H的體積為200 Ml，內(nèi)盛有DM引物各O. 25jamo1, Taq酶2U， 4 種dNTP各200jamo1， 1 x PCR反應(yīng)緩沖液100ul，冷凍干燥所得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤DNA樣品制備試劑盒，其特 征在于離心管F為2ml的離心管。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤DM樣品制備試劑盒，其特 征在于所有試劑與耗材均經(jīng)無菌處理。
5、 根裙權(quán)利要求1所述的一種土壤DNA樣品制備試劑盒，其特征在于所述的異丙醇保存在棕色試劑瓶中。
6、 土壤DM樣品制備步驟如下A) 選擇用于實(shí)驗(yàn)的環(huán)境土壤樣品；B) 將用于步驟A)中的農(nóng)田土壤經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后，獲得土壤 中的所有微生物的基因組DNA;C) 將步驟B)獲得的基因組DNA純化后作為PCR擴(kuò)增的模板；D) 選擇一般用于原核生物16SrRNA (16S核糖體核糖核酸)基 因擴(kuò)增的通用引物對；E) 在步驟D)選擇的通用引物對的正向引物的一端加上GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)；F) 按照設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；G) 將步驟F)所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為樣品保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種土壤DNA樣品制備試劑盒及其制備方法，包括盒體和隔板；盛有溶液I的試劑瓶A，盛有溶液II的試劑瓶B，盛有溶液III的試劑瓶C，盛有溶液IV的試劑瓶D，盛有懸液V的試劑瓶E，內(nèi)含酸洗玻璃珠的離心管F，微型過濾器G，PCR(鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng))管H。通過本發(fā)明技術(shù)方案設(shè)計(jì)而成的試劑盒，具有使用簡便、結(jié)果穩(wěn)定，可有效地節(jié)省使用者時間和成本的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12M1/34GK101235350SQ200710037850
公開日2008年8月6日 申請日期2007年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日
發(fā)明者周?；? 梁丹濤, 沈根祥, 胡雙慶, 趙慶節(jié), 郭春霞, 錢曉雍, 顧海蓉, 黃麗華 申請人:上海市環(huán)境科學(xué)研究院