專利名稱：流感病毒聚合酶亞基pa氨基端多肽的表達純化及pa氨基端多肽的晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流感病毒聚合酶亞基PA氨基端前256位氨基端多肽在細菌中的表達、 純化、結(jié)晶方法以及PA氨基端前256位氨基端多肽的三維晶體結(jié)構(gòu)(PA_N)及其在藥物篩 選及藥物設(shè)計方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，由H5N1亞型禽流感病毒引起的疫情廣泛傳播，對人類的健康造成全球性 的重大威脅。由于病毒的不斷變異，開發(fā)新型抗流感藥物成為各國極為迫切的重大任務(wù)。其 中，揭示與流感病毒密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)不僅對揭示流感病毒復(fù)制機制具有重要 的科學意義，而且對開發(fā)抗流感病毒藥物具有重要價值。 流感病毒基因組含有8個RNA片段，已知可以編碼11種病毒蛋白質(zhì)。其中，由PA、 PB1和PB2等3個亞基組成的聚合酶復(fù)合體是負責病毒基因組RNA復(fù)制以及病毒mRNA轉(zhuǎn) 錄的主要組分和維持病毒生命周期的至關(guān)重要的分子機器，同時由于它的高度保守性、低 突變率，使之成為抗流感病毒藥物設(shè)計潛在的重要靶點。多年來的研究結(jié)果認為，PB1是病 毒RNA聚合酶的催化亞基，負責病毒RNA的復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄；PB2是負責以一種稱為"Snatch" 的方式奪取宿主mRNA的CAP帽子結(jié)構(gòu)，用于病毒mRNA轉(zhuǎn)錄。而相對于其它兩種亞基來說， PA是了解得最不清楚的蛋白。根據(jù)已有的大量報導(dǎo)，PA亞基被發(fā)現(xiàn)不但參與病毒復(fù)制過 程，而且還參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄、內(nèi)切核酸酶活性、具有蛋白酶活性以及參與病毒粒子組裝等 多種病毒活動過程，但是其參與這些活性的分子機制卻并不清楚，因而在整個聚合酶復(fù)合 體的研究中對于PA亞基的結(jié)構(gòu)研究顯得格外重要和突出。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析對揭示蛋白 質(zhì)功能具有重大作用。這一復(fù)合體結(jié)構(gòu)的揭示也將對該復(fù)合體功能研究具有重大意義。但 是，長期以來，由于存在的種種困難，該蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)一直沒有得到解析。
本申請人在分別于2008年2月22日和2008年5月2日提交的中國專利申請CN 200810100840. X和CN 200810083994. 2中公開了本發(fā)明人解析的來源于禽流感病毒聚合 酶復(fù)合體中的PA羧基端含有460個氨基酸殘基的多肽與PB1氨基端含1-25個氨基酸殘基 的短肽的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并在2008年8月報道了本發(fā)明人解析的來源于禽流感病毒聚合酶復(fù) 合體中的PA羧基端含有460氨基酸殘基的多肽與PB1氨基端含1-25個氨基酸殘基的短肽 的復(fù)合體結(jié)構(gòu)(He X et al. Nature, Aug 2008,454(7208) :1123-6)。 為了獲得更完整的由PA、 PB1和PB2等3個亞基組成的聚合酶復(fù)合體的三維晶體 結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人又進行了以下研究。

發(fā)明內(nèi)容
在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人又通過X射線衍射晶體學方法解析了 PA亞基剩余 的氨基端部分的三維晶體結(jié)構(gòu)(PA_N)。 本發(fā)明的一個方面提供了一種流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N為所述流感病毒聚合酶亞基PA的從約 1 約50位氨基酸至在約150至300位范圍內(nèi)的氨基酸，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子 具有表1中所列的至少40%的原子坐標，或者流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端的晶體三維 結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于 或等于1.7埃。 優(yōu)選地，其中所述流感病毒選自A、B、C型流感病毒，其中所述流感病毒優(yōu)先選自A
型流感病毒株A/goose/Guangdong/l/96、A/Brevig Mission/1/1918 ;B型流感病毒株B/
Ann Arbor/1/1966或C型流感病毒株C/JJ/1950。 優(yōu)選地，其中所述的母體晶體具有Pl空間群，晶胞參數(shù)為約 a = 51. l埃，b = 59. 8埃，c = 67. 2埃，a = 96. 6° ， P = 96. 8° ， Y = 109.5° ， 重金屬硒代甲硫氨酸的晶體具有P6(4)22的空間群，晶胞參數(shù)為約 a = b = 73. 8埃，c = 123. 4埃，a = 0 = 90° ， Y = 120° 。 優(yōu)選地，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA_N由所述流感病毒
聚合酶PA的氨基端PA N中的a螺旋l，即含2-9位的氨基酸區(qū)段，a螺旋2，即含11-22
位的氨基酸區(qū)段，a螺旋3，即含32-48位的氨基酸區(qū)段，a螺旋4，即含84_92的氨基酸區(qū)
段，a螺旋5，即含127-138位的氨基酸區(qū)段，a螺旋6，即含165-184位的氨基酸區(qū)段，a
螺旋7，即含187-191位的氨基酸區(qū)段，以及五個主要的13折疊片，包括13片1，即含76-78
位的氨基酸區(qū)段，P片2，即含109-111位的氨基酸區(qū)段，13片3，即含116-123位的氨基酸
區(qū)段，|3片4，即含144-149位的氨基酸區(qū)段，13片5，即含154-157位的氨基酸區(qū)段，共同
構(gòu)成所述PA的氨基端PA N的主要部分，其中，由所述的平行的13片l-5組成一個扭曲的
平面，其它所述的a螺旋圍繞在這一平面周圍，其中所述B型或C型流感病毒中與A型流
感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。 優(yōu)選地，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA_N中結(jié)合有一個選 自鎂、錳、鋅、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，該金屬離子主要由三個水分子以及氨基酸 殘基Glu80以及Aspl08至少之一提供配位，其中參與這一結(jié)合的氨基酸還有選自His41、 Glull9、Leu106以及Pro107中的至少之一，其中所述B型或C型流感病毒中的與A型流感 病毒相應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，更優(yōu)選地，其中所述金屬離子為鎂離子。
優(yōu)選地，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA—N含有一個與其它 內(nèi)切核酸酶相似的(P)DX,(D/E)XK序列區(qū)域，其中在所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的 氨基端PA N中各氨基酸可以代表如下A。A。8X(ll)En9X(15)K，其中所述B型或C型流感 病毒中與A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。
優(yōu)選地，其中T157、 E153、 E154、 K158、 D160、 E165、 E166、 R168、 R170和Lysl72位 于P片層P4以及a7之間的序列中，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病 毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。 優(yōu)選地，其中至少二個，優(yōu)選至少三個選自由流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端 PA_N中的Argl79、Aspl89、Argl92、Gln193和Glul26等構(gòu)成的組中的氨基酸位于一個臨近 的區(qū)域，參與與蛋白質(zhì)或核苷酸的相互作用，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流 感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。 優(yōu)選地，其中所述A型流感病毒聚合酶亞基PA位于PA氨基端PA N的所述a螺旋l以及a螺旋2形成一個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，其中一些氨基酸殘基共同組成一個鄰近的帶電荷 的表面，包括氨基酸殘基Glu2、 Asp3、 Arg6、 GlnlO、 Glul5、 Glul8、 Lysl9、 Lys22、 Asp27和 Lys29，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如 在圖1中所示。 本發(fā)明的第二方面提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N中的至 少二個，優(yōu)選至少三個選自Glu80、 Aspl08、 His41、 Glul19、 Leul06以及Prol07等構(gòu)成的 氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述 流感病毒選自A、 B、 C型流感病毒，其中所述流感病毒優(yōu)先選自A型流感病毒株A/goose/ Guangdong/1/96、 A/Brevig Mission/1/1918 ;B型流感病毒株B/A皿Arbor/1/1966或C 型流感病毒株C/JJ/1950，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的 區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Glu80、 Aspl08、His41、Glull9、Leu106以及Pro107中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體 三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7 埃。 本發(fā)明的第三方面提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA—N中由 Glu2、Asp3、Arg6、GlnlO、Glu 15、Glu 18、Lys 19、Lys22、Asp27和Lys29構(gòu)成的組中的至少 二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其 中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中 所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Glu2、Asp3、Arg6、GlnlO、Glul5、Glu18、 Lysl9、 Lys22、 Asp27和Lys29構(gòu)成的組中的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基 的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或 等于1.7埃。 本發(fā)明的第四方面提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA N中由 Argl79、Aspl89、Argl92、Gln193和Glul26構(gòu)成的組中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié) 合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述B型或C型流感病毒中 與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、 抗體或免疫結(jié)合物與Argl79、 Asp 189、 Argl92、 Glnl93和Glul26構(gòu)成的組中的氨基酸中 至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與 表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7埃。 本發(fā)明的第五方面提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA N中由 T157、E153、E154、K158、D 160、E165、E166、R168、R170和Lysl72構(gòu)成的組中的至少二個，優(yōu) 選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述B 型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其 中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與T157、E153、E154、K158、D160、E165、E166、R168、 R170和Lysl72構(gòu)成的組中的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié) 構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7埃。
本發(fā)明的第六方面提供了一種包含上述與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_ N中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫 結(jié)合物的組合物，可選地包括載體或賦形劑。
本發(fā)明的第七方面提供了上述組合物在制備治療由流感病毒引起的疾病的藥物 中的應(yīng)用。 本發(fā)明的第八方面提供了上述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三維 結(jié)構(gòu)在設(shè)計和篩選用于治療流感病毒感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化 合物、抗體或免疫結(jié)合物中的應(yīng)用，包括 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來設(shè)計結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、 無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子； 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽、蛋 白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子； 將根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯?、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗 體或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述的PA_N序列含有至少50%相同序列的任一亞型的 流感病毒聚合酶蛋白中，進而分析結(jié)合情況； 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯摹⒌鞍踪|(zhì)或無機或有機化合物、抗體 或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述PA—N序列含有至少50X相同序列的任一亞型的流感 病毒聚合酶蛋白中并結(jié)晶，從而通過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子 與蛋白的結(jié)合情況； 其中與所述PA_N序列含有至少50%相同序列的任一亞型的流感病毒聚合酶蛋白
結(jié)合的所述多肽、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子即為候選化合物。
本發(fā)明的第九方面提供了任一亞型的流感病毒聚合酶的三個亞基PA、PB1、PB2或 者PA、PB1和PB2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段，與所述PA—N蛋白 質(zhì)具有至少40 %的相同序列。 本發(fā)明的第十方面提供了任一亞型的流感病毒聚合酶亞基PA、 PB1、 PB2或者PA、 PB1和PB2復(fù)合體的三維立體結(jié)構(gòu)，其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段的主鏈三維結(jié) 構(gòu)坐標，與所述的PA_N蛋白質(zhì)具有與所述PA_N蛋白質(zhì)序列至少40%的主鏈碳骨架的原子 三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃。 本發(fā)明的第十一方面提供了一種多肽或者小分子，其特征在于與所述流感病毒PA 亞基上的任一氨基酸有相互作用。 本發(fā)明的第十二方面提供了上述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三 維結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計方面的應(yīng)用。 本發(fā)明的第十三方面提供了基于流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N蛋白質(zhì)三維 結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物的方法，包 括通過蛋白結(jié)晶方法獲得含有PA_N的晶體，或者獲得含有PA_N蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu)坐 標；其中所述三維結(jié)構(gòu)包括任何與該坐標中至少含有40%氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子 三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃的結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明的第十四方面提供了基于流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N蛋白質(zhì)三維 結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物的方法，包 括使用的三維分子組合具有上述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三維結(jié) 構(gòu)或與上述的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物結(jié)合的所述氨基酸殘基 的組中的至少3個具有主鏈碳骨架原子三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃的結(jié)構(gòu)在篩選多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物上的應(yīng)用。


圖1為基于來自三種不同類型的流感病毒的PA蛋白氨基N末端的序列對比。其 中，A_1996為來自禽流感A型病毒病毒株為A/goose/Guangdong/1/96的PA蛋白氨基N末 端的序列；A_1918為1918年歐洲爆發(fā)的大范圍流感并造成重大人類死亡事件的A型流感 病毒株A/Brevig Mission/l/1918A型流感病毒PA蛋白氨基N末端的序列；Bj966為來自 1966Ann abor的流感B型病毒B/AnnArbor/1/1966的PA蛋白氨基N末端的序列；C_1950 為來自1950的一種流感C型病毒C/JJ/1950的PA蛋白氨基N末端的序列；這一結(jié)果表 明流感病毒聚合酶亞基PA蛋白含有高度保守的氨基酸殘基。圖中用....表示在相應(yīng)的 區(qū)段的氨基酸缺失，在說明書以及權(quán)利要求書中具體的氨基酸位置均是以Aj996為例說 明的，其中A_1996與圖4中的A_0URS是相同的來自禽流感A型病毒病毒株為A/goose/ Guangdong/1/96的PA蛋白氨基N末端的序列，而圖4中的A_0URS為來自禽流感A型病毒 病毒株為A/goose/Guangdong/1/96的PA蛋白氨基C末端的序列。 圖2為A_1996表示的禽流感A型病毒病毒株為A/goose/Guangdong/1/96的PA 蛋白氨基N末端的序列PA—N的三維結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)為PA—N的結(jié)構(gòu)飄帶圖。該結(jié)構(gòu)因二 級結(jié)構(gòu)特征不同而使用不同色彩，其中a螺旋使用粉色，P片層使用紫色，loop環(huán)使用綠 色。每個二級結(jié)構(gòu)單元都標記排序。鎂離子以銀白色的球代表，三個結(jié)合鎂離子的水分子 以黑點代表。(B)PA—N結(jié)構(gòu)的拓撲圖，色彩對應(yīng)于(A)中的二級結(jié)構(gòu)色彩，其中粉色圓柱狀 表示a螺旋，紫色箭頭表示13片層，黑色線條表示loop環(huán)，②表示羧基端，⑩表示羧基端， 空心圓圈表示某位置的氨基酸殘基，圓圈表示鎂離子Mg"。 (C)在(A)圖中的PA N蛋白分 子表面電荷圖。色彩區(qū)間為從紅(-10kbT/ec)到藍(+10kbT/ec)，其中中間的紅色區(qū)域為一 空穴，在空穴中銀白色的球代表鎂離子，三個結(jié)合鎂離子的水分子以黑點代表。藍色為正電 荷表面，紅色為負電荷表面，白色為不帶電荷表面相關(guān)部分氨基酸。(D)由2F。-F。電子密度 圖(等高線在1.5。處)覆蓋的Mg"結(jié)合部位的封網(wǎng)圖。PA—N蛋白分子的方向和顏色與A 對應(yīng)，其對應(yīng)于A中Mg2+離子周圍的局部放大圖。其中與Mg2+離子作用的氨基酸殘基以棒 狀表示，并被標記。Mg"離子以銀白色的球表示，水分子以紅球W表示。
圖3 :為A_1996表示的禽流感A型病毒病毒株為A/goose/Guangdong/1/96的PA 蛋白氨基N末端的序列PA_N的三維結(jié)構(gòu)的局部放大的結(jié)構(gòu)飄帶圖。其中Mg2+離子以大的 銀白色的球表示，水分子以小的實心黑點表示，特定的氨基酸殘基以棒狀表示，并被標記為 紅色或藍色。 圖4 :為基于來自三種不同類型的流感病毒的PA蛋白羧基C末端的序列以及PB_1N 的蛋白序列。A.為基于來自三種不同類型的流感病毒的PA蛋白序列對比，其中AJ)URS為 來自禽流感A型病毒病毒株為A/goose/Guangdong/1/96的PA蛋白羧基C末端的序列，對 應(yīng)于圖1中的Aj996 ;Aj918為1918年歐洲爆發(fā)的大范圍流感并造成重大人類死亡事 件的A型流感病毒株A/BrevigMission/l/1918A型流感病毒PA蛋白序列；B_1966為來自 1966Annabor的流感B型病毒B/Ann Arbor/1/1966的PA蛋白序歹lj ;C 1950為來自1950的 一種流感C型病毒C/JJ/1950的PA蛋白序列；這一結(jié)果表明流感病毒聚合酶亞基PA蛋白 含有高度保守的氨基酸殘基。B.為基于來自四種不同類型的流感病毒的PBl,的蛋白序列對比，其中A_0URS、A_1918、B_1966、C_1950如上所述，圖中用....表示在相應(yīng)的區(qū)段的氨 基酸缺失，在說明書以及權(quán)利要求書中具體的氨基酸位置均是以AJ)URS為例說明的。黃色 框中標記有Roundloop的為結(jié)構(gòu)中大環(huán)區(qū)，另一黃色框(未標注)為可能的核酸結(jié)合區(qū)。綠 色箭頭為PA羧基端參與與PB1短肽結(jié)合的氨基酸殘基。在說明書中具體的氨基酸位置均 是以A_1996即A_0URS為例說明的。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過X射線衍射晶體學方法解析了 PA亞基剩余的氨基端部分的分辨率 達2. 2埃的三維晶體結(jié)構(gòu)(PA_N)。 在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，提供了一種流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_ N的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA—N為所述流感病毒聚合酶 亞基PA的從約1 約50位氨基酸至在約150至300位范圍內(nèi)的氨基酸，其中所述晶體三 維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少40X的原子坐標，或者流感病毒聚合酶亞基PA的氨 基端的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的 平均根方差小于或等于1.7埃。 在一優(yōu)選實施方式中，其中所述流感病毒選自A、 B、 C型流感病毒，其中所述流感 病毒優(yōu)先選自A型流感病毒株A/goose/Guangdong/l/96、A/Brevig Mission/1/1918 ;B型 流感病毒株B/Ann Arbor/1/1966或C型流感病毒株C/JJ/1950。 在另一優(yōu)選實施方式中，其中所述的母體晶體具有P1空間群，晶胞參數(shù)為約a = 51. 1埃，b = 59. 8埃，c = 67. 2埃，a = 96. 6° ， P = 96. 8° ， y = 109. 5° ，重金屬硒 代甲硫氨酸的晶體具有P6(4)22的空間群，晶胞 參數(shù)為約a = b = 73. 8埃，c = 123. 4埃，a = p = 90° ， Y = 120° 。
在一優(yōu)選實施方式中，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA_N由 所述流感病毒聚合酶PA的氨基端PA—N中的a螺旋l，即含2-9位的氨基酸區(qū)段，a螺旋2， 即含11-22位的氨基酸區(qū)段，a螺旋3，即含32-48位的氨基酸區(qū)段，a螺旋4，即含84_92 的氨基酸區(qū)段，a螺旋5，即含127-138位的氨基酸區(qū)段，a螺旋6，即含165-184位的氨基 酸區(qū)段，a螺旋7，即含187-191位的氨基酸區(qū)段，以及五個主要的13折疊片，包括13片l， 即含76-78位的氨基酸區(qū)段，13片2，即含109-111位的氨基酸區(qū)段，13片3，即含116-123 位的氨基酸區(qū)段，P片4，即含144-149位的氨基酸區(qū)段，13片5，即含154-157位的氨基酸 區(qū)段，共同構(gòu)成所述PA的氨基端PA—N的主要部分，其中，由所述的平行的13片l-5組成一 個扭曲的平面，其它所述的a螺旋圍繞在這一平面周圍，其中所述B型或C型流感病毒中 與A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。 在另一優(yōu)選實施方式中，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA—N
中結(jié)合有一個選自鎂、錳、鋅、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，該金屬離子主要由三個水 分子以及氨基酸殘基Glu80以及Aspl08至少之一提供配位，其中參與這一結(jié)合的氨基酸還 有選自His41、Glull9、Leu106以及Pro_107中的至少之一，其中所述B型或C型流感病毒 中的與A型流感病毒相應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，更優(yōu)選地，其中所述金屬離 子為鎂離子。 在一優(yōu)選實施方式中，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA_N含有一個與其它內(nèi)切核酸酶相似的(P)DX,(D/E)XK序列區(qū)域，其中在所述A型流感病毒的聚 合酶亞基PA的氨基端PA—N中各氨基酸可以代表如下P皿D，X(ll)En9X(15)K^，其中所述 B型或C型流感病毒中與A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。
在另一優(yōu)選實施方式中，其中T157、E153、E154、K158、D160、E165、E166、R168、R170 和Lysl72位于13片層134以及a 7之間的序列中，其中所述B型或C型流感病毒中與所 述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。 在一優(yōu)選實施方式中，其中至少二個，優(yōu)選至少三個選自由流感病毒聚合酶亞基 PA的氨基端PA_N中的Argl79、 Aspl89、 Argl92、Gln193和Glul26等構(gòu)成的組中的氨基酸 位于一個臨近的區(qū)域，參與與蛋白質(zhì)或核苷酸的相互作用，其中所述B型或C型流感病毒中 與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。 在另一優(yōu)選實施方式中，其中所述A型流感病毒聚合酶亞基PA位于PA氨基端PA_ N的所述a螺旋l以及a螺旋2形成一個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，其中一些氨基酸殘基共同組成一 個鄰近的帶電荷的表面，包括氨基酸殘基Glu2、 Asp3、 Arg6、 GlnlO、 Glul5、 Glul8、 Lys 19、 Lys22、Asp27和Lys29，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段 的氨基酸分別如在圖1中所示。 在本發(fā)明的第二實施方式中，提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_ N中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Glu80、Aspl08、His41、Glull9、Leu106以及Pro107等 構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其 中所述流感病毒選自A、 B、 C型流感病毒，其中所述流感病毒優(yōu)先選自A型流感病毒株A/ goose/Guangdong/1/96、 A/BrevigMission/1/1918 ;B型流感病毒株B/A皿Arbor/1/1966 或C型流感病毒株C/JJ/1950，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相 對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與 Glu80、Aspl08、His41、Glull9、Leu106以及Pro107中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基 的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或 等于1.7埃。 在本發(fā)明的第三實施方式中，提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_ N中由Glu2、Asp3、Arg6、GlnlO、Glu 15、Glul8、Lysl9、Lys22、Asp27和Lys29構(gòu)成的組中的 至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合 物，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在 圖1中所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Glu2、Asp3、Arg6、GlnlO、Glu15、 Glul8、 Lysl9、 Lys22、 Asp27和Lys29構(gòu)成的組中的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基 酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差 小于或等于1.7埃。 在本發(fā)明的第四實施方式中，提供了 一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA N中由Argl79、Aspl89、Argl92、Gln193和Glul26構(gòu)成的組中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨 基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述B型或C型流感 病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或 蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Argl79、 Aspl89、 Argl92、 Glnl93和Glul26構(gòu)成的組中的氨 基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7埃。 在本發(fā)明的第五實施方式中，提供了一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_ N中由T157、E153、E154、K158、D160、E165、E166、R168、R170和Lysl72構(gòu)成的組中的至少 二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其 中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中 所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與T157、 E153、 E154、 K158、 D160、 E165、 E166、 R168、 R170和Lysl72構(gòu)成的組中的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的 晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等 于1.7埃。 在本發(fā)明的第六實施方式中，提供了一種包含上述與流感病毒聚合酶亞基PA的 氨基端PA_N中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、 抗體或免疫結(jié)合物的組合物，可選地包括載體或賦形劑。 在本發(fā)明的第七實施方式中，提供了上述組合物在制備治療由流感病毒引起的疾 病的藥物中的應(yīng)用。 在本發(fā)明的第八實施方式中，提供了上述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA—N 的晶體三維結(jié)構(gòu)在設(shè)計和篩選用于治療流感病毒感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)、無 機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物中的應(yīng)用，包括 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來設(shè)計結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、 無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子； 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽、蛋 白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子； 將根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯?、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗 體或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述的PA—N序列含有至少50%相同序列的任一亞型的 流感病毒聚合酶蛋白中，進而分析結(jié)合情況； 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯?、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗體 或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述PA—N序列含有至少50X相同序列的任一亞型的流感 病毒聚合酶蛋白中并結(jié)晶，從而通過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子 與蛋白的結(jié)合情況； 其中與所述PA_N序列含有至少50%相同序列的任一亞型的流感病毒聚合酶蛋白
結(jié)合的所述多肽、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子即為候選化合物。
在本發(fā)明的第九實施方式中，提供了任一亞型的流感病毒聚合酶的三個亞基PA、 PB1、 PB2或者PA、 PB1和PB2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段，與所 述PA_N蛋白質(zhì)具有至少40 %的相同序列。 在本發(fā)明的第十實施方式中，提供了任一亞型的流感病毒聚合酶亞基PA、PB1、PB2 或者PA、PB1和PB2復(fù)合體的三維立體結(jié)構(gòu)，其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段的主鏈 三維結(jié)構(gòu)坐標，與所述的PA_N蛋白質(zhì)具有與所述PA_N蛋白質(zhì)序列至少40%的主鏈碳骨架 的原子三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃。 在本發(fā)明的第十一實施方式中，提供了一種多肽或者小分子，其特征在于與所述 流感病毒PA亞基上的任一氨基酸有相互作用。
在本發(fā)明的第十二實施方式中，提供了上述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_ N的晶體三維結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計方面的應(yīng)用。 在本發(fā)明的第十三實施方式中，提供了基于流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA—N 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物 的方法，包括通過蛋白結(jié)晶方法獲得含有PA_N的晶體，或者獲得含有PA_N蛋白質(zhì)晶體的 三維結(jié)構(gòu)坐標；其中所述三維結(jié)構(gòu)包括任何與該坐標中至少含有40%氨基酸殘基的主鏈 碳骨架原子三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃的結(jié)構(gòu)。 在本發(fā)明的第十四實施方式中，提供了基于流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N
蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物
的方法，包括使用的三維分子組合具有上述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶
體三維結(jié)構(gòu)或與上述的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物結(jié)合的所述氨
基酸殘基的組中的至少3個具有主鏈碳骨架原子三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃的
結(jié)構(gòu)在篩選多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物上的應(yīng)用。 流感病毒PA N段蛋白的表汰和純化方法: 來源于禽流感的病毒基因A/goose/Guangdong/l/96，其編碼的蛋白質(zhì)序列分別 為 (l)PA蛋白質(zhì)序列
LYEAIEECLINDPWVLLNASWFNSFLTHALK ;艮卩 Met Glu Asp Phe Val Arg Gin Cys Phe Asn Pro Met lie Val Glu Leu Ala Glu Lys AlaMet Lys Glu Tyr Gly Glu Asp Pro Lys lie Glu Thr Asn Lys Phe Ala Ala lie Cys Thr His Leu GluVal Cys Phe Met Tyr Ser Asp Phe His Phe lie Asp Glu Arg Gly Glu Ser Thr lie lie Glu Ser GlyAsp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu lie lie Glu Gly Arg Asp Arg Thr Met Ala TrpThr Val Val Asn Ser lie Cys Asn Thr Thr Gly Val Glu Lys Pro Lys Phe Leu Pro Asp Leu Tyr AspTyr Lys Glu Asn Arg Phe lie Glu lie Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His Thr Tyr Tyr Leu Glu LysAla Asn Lys lie Lys Ser Glu Lys Thr His lie His lie Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala ThrLys Ala Asp Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg lie Lys Thr Arg Leu Phe Thr lie Arg GlnGlu Met Ala Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Arg Gin Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr lie GluGlu Arg Phe Glu lie Thr Gly Thr Met Cys Arg Leu Ala Asp Gin Ser Leu Pro Pro Asn Phe SerSer Leu Glu Lys Phe Arg Ala Tyr Val Asp Gly Phe GluPro Asn Gly Cys lie Glu Gly Lys LeuSer Gin Met Ser Lys Glu Val Asn Ala Arg lie Glu Pro Phe Leu Lys Thr Thr Pro Arg Pro LeuArg Leu Pro Asp Gly Pro Pro Cys Ser Gin Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu Lys LeuSer lie Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly lie Pro Leu Tyr Asp Ala lie Lys Cys Met Lys ThrPhe Phe Gly Trp Lys Glu Pro Asn lie Val Lys Pro His Glu Lys Gly lie Asn Pro Aai Tyr Leu LeuAla Trp Lys Gin Val Leu Ala Glu Leu Gin Asp lie Glu Asn Glu Glu Lys lie Pro Lys Thr Lys AsnMet Arg Lys Thr Ser Gin Leu Lys Trp Ala Leu Gly Glu Asn Met Ala Pro Glu Lys Val Asp PheGlu Asp Cys Lys Asp Val Ser Asp Leu Arg Gin Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Lys Pro Arg Ser LeuAla Ser Trp lie Gin Ser Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu Leu Thr Asp Ser Ser Trp lie Glu Leu AspGlu lie Gly Glu Asp Val Ala Pro lie Glu His lie Ala Ser Met Arg Arg Asn Tyr Phe Thr Ala GluVal Ser His Cys Arg Ala Thr Glu Tyr lie Met Lys Gly Val Tyr lie Asn Thr Ala Leu Leu Asn AlaSer Cys Ala Ala Met Asp Asp Phe Gin Leu lie Pro Met lie Ser Lys Cys Arg Thr Lys Glu GlyArg Arg Lys Thr Asn Leu Tyr Gly Phe lie lie Lys Gly Arg Ser His Leu Arg Asn Asp Thr AspVal Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Asp Pro Arg Leu Glu Pro His Lys Trp GluLys Tyr Cys Val Leu Glu lie Gly Asp Met Leu Leu Arg Thr Ala lie Gly Gin Val Ser Arg Pro MetPhe Leu Tyr Val Arg Thr Asn Gly Thr Ser Lys lie Lys Met Lys Trp Gly Met Glu Met Arg ArgCys Leu Leu Gin Ser Leu Gin Gin lie Glu Ser Met lie Glu Ala Glu Ser Ser Val Lys Glu Lys AspMet Thr Lys Glu Phe Phe Glu Asn Lys Ser Glu Thr Trp Pro lie Gly Glu Ser Pro Lys Gly MetGlu Glu Gly Ser lie Gly Lys Val Cys Arg Thr Leu Leu Ala Lys Ser Val Phe Asn Ser Leu Tyr AlaSer Pro Gin Leu Glu Gly Phe Ser Ala Glu Ser Arg Lys Leu Leu Leu lie Val Gin Ala Leu ArgAsp Asn Leu Glu Pro Gly Thr Phe Asp Leu Gly Gly Leu Tyr Glu Ala lie Glu Glu Cys Leu IleAsn Asp Pro Trp Val Leu Leu Asn Ala Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys(SEQIDNO :1)。
(2)PB1蛋白質(zhì)序列
IEVFRSNGLTANESGRLIDFLKDVMESMDKGEMEIITHFQRKRRVRD醒TKKMVTQRTIGKKKQRLNKRSYLIRALT
(匪TNSQDTELSF
LKYFNESTRKKIEKIRPLLIDGTASLSPGM匪GMFNMLSTVLGVSILNLGQKRYTKTTY麗DGLQSSDDFALIVNAP NHEGIQAGVDRFYRTCKLVGI醒SKKKSYINRTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINESADMSIGVTVIK 匪] Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gin Asn Ala lie Ser Thr ThrPhe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr ValAsn Arg Thr His Gin Tyr Ser Glu Lys Gly Lys Trp Thr Thr AsnThr Glu Thr Gly Ala Pro GlnLeu Asn Pro lie Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Gin Thr Asp CysVal Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu Lys Ser His Pro Gly lie Phe Glu Asn Ser Cys Leu GluThr Met Glu lie Val Gin Gin Thr Arg Val Asp Lys Leu Thr Gin Gly Arg Gin Thr Tyr Asp TrpThr Leu Asn Arg Asn Gin Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala Asn Thr lie Glu Val Phe Arg Ser AsnGly Leu Thr Ala Asn Glu Ser Gly Arg Leu lie Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met AspLys Gly Glu Met Glu lie lie Thr His Phe Gin Arg Lys Arg Arg Val Arg Asp Asn Met Thr LysLys Met Val Thr Gin Arg Thr lie Gly Lys Lys Lys Gin Arg Leu Asn Lys Arg Ser Tyr Leu lie ArgAla Leu Thr Leu Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala lie AlaThr Pro Gly Met Gin lie Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr Leu Ala Arg Ser lie Cys Glu LysLeu Glu Gin Ser Gly Leu Pro Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val ArgLys Met Met Thr Asn Ser Gin Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr lie Thr Gly Asp Asn Thr Lys TrpAsn Glu Asn Gin Asn Pro Arg Met Phe Leu Ala Met lie Thr Tyr lie Thr Arg Asn Gin Pro GluTrp Phe Arg Asn Val Leu Ser lie Ala Pro lie Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys GlyTyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gin lie Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser lie AspLeu Lys Tyr Phe Asn Glu Ser Thr Arg Lys Lys lie Glu Lys lie Arg Pro Leu Leu lie Asp Gly ThrAla Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val Serlle Leu Asn Leu Gly Gin Lys Arg Tyr Thr Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gin Ser SerAsp Asp Phe Ala Leu lie Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly lie Gin Ala Gly Val Asp Arg Phe TyrArg Thr Cys Lys Leu Val Gly lie Asn Met Ser Lys Lys Lys Ser Tyr lie Asn Arg Thr Gly Thr PheGlu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser PheGly Val Ser Gly lie Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser lie Gly Val Thr Val lie Lys Asn Asn Met IleAsn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala Gin Met Ala Leu Gin Leu Phe lie Lys Asp Tyr Arg TyrThr Tyr Arg Cys His Arg Gly Asp Thr Gin lie Gin Thr Arg Arg Ser Phe Glu Leu Lys Lys LeuTrp Glu Gin Thr Arg Ser Lys Ala Gly Leu Leu Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn IleArg Asn Leu His lie Pro Glu Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Glu Asp Tyr Gin Gly ArgLeu Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu lie Glu Ser Val Asn Asn Ala Val Val MetPro Ala His Gly Pro Ala Lys Ser Met Glu Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp lie Pro LysArg Asn Arg Ser lie Leu Asn Thr Ser Gin Arg Gly lie Leu Glu Asp Glu Gin Met Tyr Gin LysCys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Pro Val Gly lie Ser Ser MetVal Glu Ala Met Val Ser Arg Ala Arg lie Asp Ala Arg lie Asp Phe Glu Ser Gly Arg lie Lys LysGlu Glu Phe Ala Glu lie Met Lys lie Cys Ser Thr lie Glu Glu Leu Arg Arg Gin Lys(SEQ IDNO :2)。 通過分子克隆技術(shù)將流感病毒聚合酶亞基PA基因分成蛋白質(zhì)的氨基端和羧基端 兩部分進行克隆，氨基端包括前256位氨基酸，羧基端包括第257至第716氨基酸，兩部分 基因分別克隆到pGEX-6p載體上(來自Amersham Pharmacia Inc.)，以便表達氨基末端融
16合GST的融和蛋白(GST-PA-N以及GST_PAC)，將克隆的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中， 在BL21中使用終濃度為0. 1-lmM的IPTG (異丙基-P _D_硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)大腸桿菌分 別表達兩種蛋白，獲得該兩種蛋白的各自表達菌，具體參見實施例1 。 將PB 1N端48個氨基酸以內(nèi)的基因(包括前25肽)同樣克隆到pGEX_6p載體上， 表達融合的GST-PB1N端肽的融合蛋白。 同樣，分別表達了 GST融合的PBl,端25個氨基酸的短肽或48個氨基酸以內(nèi)的短 肽，同樣將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，在BL21中使用終濃度為0. 1-lmM的IPTG誘導(dǎo) 大腸桿菌表達蛋白，獲得該蛋白的表達菌。 將表達GST-PA-N的細菌使用緩沖液懸浮后裂解，離心獲得上清后使用親和層析 柱，從中純化出GST-PA-N融合蛋白。 將表達GST-PAC的表達菌與表達GST-PB1短肽的表達菌分別使用含有約 20mMTris-HCl(pH8. 0)及250mM NaCl的緩沖液懸浮，然后按比例混合兩種表達菌，使 GST-PAc和GST-PBl的蛋白總含量的摩爾比為O. 1 : 1 1 : 0. l，優(yōu)選使GST-PAc和GST-PB 1 的蛋白總含量的摩爾比為O. 5 : 1 1 : 0. 5，優(yōu)選使GST-PAc和GST-PBl的蛋白總含量接
近摩爾比為i : i。 然后使用Glutathione-S印harose親禾口柱(來自AmershamPharmacia Inc.)純化 這一混合的GST融合蛋白。使用PreScission蛋白酶(來自Amersham Pharmacia Inc.)酶 解后，用凝膠過濾Superdex-200以及離子交換層析(Q s印harose)等方法分離純化出PAC/ PB1短肽復(fù)合體(層析柱均來源于Amersham Pharmacia Inc.)，通過SDS-PAGE凝膠電泳確 定蛋白質(zhì)純度后，用于進一步的結(jié)晶實驗。 同樣t也，il!用Glutathione—S印harose親禾口柱(來自AmershamPharmacia Inc.) 純化這GST-PA-N的GST融合蛋白。使用PreScission蛋白酶(來自Amersham Pharmacia Inc.)酶解后，用凝膠過濾S卯erdex-200以及離子交換層析(Q s印harose)等方法分離純 化出GST-PA-N肽(層析柱均來源于Amersham Pharmacia Inc.)，通過SDS-PAGE凝膠電泳 確定蛋白質(zhì)純度后，用于進一步的結(jié)晶實驗。 進一步通過X射線衍射晶體學方法解析PA亞基剩余的氨基端部分的三維晶體結(jié) 構(gòu)(PA—N)，顯示PA—N是a/|3結(jié)構(gòu)域，其形狀類似于一個張開的貝殼，含有5個P片層 P 1-5和7個a螺旋(a 1-7)。其中5個平行的P片層1-5 (即P -strands P 1-5)組成 一個扭曲的平面，被周圍7個a螺旋(a 1-7)包圍(參見圖2A)。該貝殼形狀主要由a 2、 a 4、 a 5、 a 7等組成張開的口部，其它部分構(gòu)成貝殼底尖處以及貝面。a 2_a 5以及P 3圍 繞形成一個負電荷小穴，其中結(jié)合一個金屬離子，該金屬原子選自鎂、錳、鋅、銅、鈷、鐵該金 屬離子主要由三個水分子以及氨基酸殘基Glu80以及Aspl08至少之一提供配位，其中參與 這一結(jié)合的氨基酸還有選自His41、Glull9、Leu106以及Pro107中的至少之一。
優(yōu)選地，這一金屬離子是鎂離子。這一鎂離子主要與周圍5個配體形成5個配位 鍵，包括酸性氨基酸E80以及D108、和3個水分子。這三個水分子與氨基酸H41、E119殘基、 以及殘基L106和P107的羰基氧所結(jié)合。參與結(jié)合鎂離子的這六個氨基酸殘基在A、B以及 C型流感病毒的PA亞基中都非常保守，只有脯氨酸107在B型以及C型流感病毒中被丙氨 酸殘基或者絲氨酸取代(參見圖1)。通過Dali(http:〃麗w. ebi.ac.uk/dali)進行相似結(jié) 構(gòu)的搜尋比對，我們發(fā)現(xiàn)PA_N結(jié)構(gòu)與嗜熱菌Thermus thermophilusHb8中的一個推測的核
17酸酶蛋白Ttl808(PDB ID :lWDJ，Z-score 4. 8，r. m. s. d. 3. 4 A，比對其中的87個氨基酸)， 以及一個已知的限制性內(nèi)切酶SdaI(PDBID :2IXS，Z-score 3. 9，r.m. s. d. 4. 0 A,比對95氨 基酸)，Hollidayjunction resolvase Hjc(PDB ID :IGEF， Z—score 3. 8， r. m. s. d. 3. 0 A比
對76氨基酸)具有結(jié)構(gòu)相似性。這些蛋白都具有一個保守的(P)DXw(D/E)XK活性區(qū)。因而 我們猜測PA N可能具有核酸酶的活性。核酸內(nèi)切酶活性是流感病毒聚合酶復(fù)合體所必須 的，當流感病毒RNA聚合酶奪取了宿主mRNA后，需要首先將宿主mRNA切斷，產(chǎn)生帶有帽子 結(jié)構(gòu)的短5'核苷酸序列用于自身mRNA轉(zhuǎn)錄的引物。其中，為了證明PA—N是核酸內(nèi)切酶， 我們做了一系列的生物化學以及細胞生物學分析，包括1)引物延伸實驗將人腎癌293細 胞轉(zhuǎn)入表達PA， PB1， PB2的質(zhì)粒，并同時轉(zhuǎn)入帶有流感病毒啟動子的另一質(zhì)粒，這樣在細胞 中表達的聚合酶可以識別并合成病毒的一段RNA。通過體外引物延伸實驗檢測細胞內(nèi)病毒 RNA片段的種類來看聚合酶活性。2)體外內(nèi)切核酸酶活性檢測等實驗。比如我們證明了重 組純化的流感病毒聚合酶復(fù)合體(包含PA，PB1和PB2三個亞基)，當在PA—N預(yù)測的內(nèi)切核 酸酶活性位點，諸如H41， E80， L106， P107， D108和E119等位點突變后，不同程度的喪失了 切割mRNA的活性，進而喪失使用宿主mRNA合成RNA的能力。E80A， D108A， E119A和K134A 點突變造成聚合酶復(fù)合體的mRNA合成活性基本喪失，但保留有cRNA以及vRNA合成能力。 H41A突變造成三種RNA的合成都被阻斷。但是，以往報導(dǎo)的PB1亞基上參與E508，E519以 及D522的點突變則對聚合酶的RNA合成能力沒有影響。這些結(jié)果充分說明了 PA_N端含有 負責流感病毒聚合酶核酸內(nèi)切酶活性的結(jié)構(gòu)域。但是，該內(nèi)切核酸酶活性作用的底物結(jié)合 位點有可能更多的依賴于PB1和PB2亞基。但是，PA—N端多肽上位于13 3- a 5之間的環(huán)肽 上的兩個精氨酸(R124和R125)，以及在a螺旋7上的兩個精氨酸(R192和R196)可能參 與與底物RNA的結(jié)合。 根據(jù)以往的報導(dǎo)，流感病毒聚合酶PA亞基具有蛋白酶活性，其中蘇氨酸T157和絲 氨酸S624都曾被認為是該蛋白酶活性中心。但本發(fā)明人沒有發(fā)現(xiàn)PA—N單獨具有蛋白酶活 性，可能這一活性需要聚合酶其它部分的參與。但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，圍繞在T157殘基周圍 的一些氨基酸殘基，包括E154、K158、D160、E165、E166、R168和R170非常保守，因此這些氨 基酸很可能參與流感病毒聚合酶的重要功能。 應(yīng)當注意到，其中B型或C型流感病毒中與A型流感病毒的a螺旋及|3片相對應(yīng) 的區(qū)段分別如在圖l以及圖4的A和B中所示，在此不再一一贅述?？刹捎玫牡鞍踪|(zhì)或多肽 序列比對的方法例如:CLUSTALW(http:〃www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html)。
在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種表達和純化流感病毒聚合酶亞基PA氨基 端PA—N的方法，包括(a)構(gòu)建融合了或不融合標簽蛋白基因的編碼流感病毒聚合酶亞基 PA氨基端多肽PA_N第約1 約50位氨基酸至約150 約300位氨基酸的基因序列的載 體，用該載體轉(zhuǎn)化原核或真核細胞，從而表達帶有標簽蛋白的PAe ; (b)通過特異性地與所述 特異標簽識別的方法分離出所述氨基端多肽，酶解去掉帶有標簽的多肽中的標簽蛋白，分 離出氨基端多肽PA—N，確定蛋白質(zhì)的濃度； 其中所述病毒聚合酶亞基PA氨基端多肽PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1 中所列的至少40%的原子坐標，或者流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端多肽PA_N的晶體三 維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小 于或等于1.7埃。
在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種表達和純化流感病毒聚合酶亞基PA的氨 基端多肽PA_N的方法，其中所述標簽蛋白選自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、特異性抗 體；所述載體含有選擇性標記基因，優(yōu)選的標簽蛋白為GST，所述與特異標簽識別的方法是 通過親和柱進行，所述去掉標簽的方法通過用蛋白酶酶解，所述分離PA氨基端多肽PA—N的 方法是通過凝膠過濾或離子交換層析進行，所述確定蛋白質(zhì)的濃度通過凝膠電泳的方法進 行。 在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種表達和純化流感病毒聚合酶亞基PA氨基 端多肽PA_N的方法，其中所述載體為pGEX-6p質(zhì)粒載體，其中所述的選擇性標記基因為青 霉素抗性基因，其中步驟(b)所使用的蛋白酶為ProScission蛋白酶；載體所使用的引物酶 切位點為選自SalI、Notl構(gòu)成的組中的酶切位點；插入基因片段時所用的酶切位點為選自 Sall、 Notl構(gòu)成的組中的酶切位點；所述流感病毒聚合酶亞基PA氨基端多肽PA_N的基因 片段是通過利用聚合酶鏈式反應(yīng)PCR方法從A型流感病毒株A/goose/Guangdong/1/96基 因組中擴增獲得；將所述載體及所述插入基因片段分別使用相應(yīng)的DNA內(nèi)切酶，如選自由 BamHI、Xho1組成的組中的內(nèi)切酶處理后，通過T4DNA連接酶將所述插入基因與所述載體連 接，從而轉(zhuǎn)化例如大腸桿菌這樣的原核細胞獲得克隆質(zhì)粒；將克隆好的如上所述的克隆質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化細菌，通過使用IPTG誘導(dǎo)，IPTG優(yōu)選的濃度 為0. lmM至lmM，將培養(yǎng)得到的所述細菌通過離心方法得到表達所述融合蛋白的菌群。
在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種共結(jié)晶流感病毒聚合酶亞基PA氨基端多 肽PA_N的方法，包括將所述純化的氨基端多肽PA_N的蛋白質(zhì)濃度濃縮至5-30mg/ml ;用 氣相懸滴法或坐滴法篩選晶體生長條件；獲得流感病毒聚合酶亞基PA氨基端多肽PA_N的 晶體。 在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種表達PA氨基端多肽PA_N的野生型或者突 變型蛋白的方法，氨基端多肽PA_N為從1 約50位氨基酸至約200 約300位氨基酸，包 括構(gòu)建融合了標簽蛋白基因的編碼流感病毒聚合酶亞基PA氨基端多肽PA—N從1 約50 位氨基酸至約200 約300位氨基酸的基因序列的表達載體，用該載體轉(zhuǎn)化細胞，從而表達 帶有標簽蛋白的氨基端多肽PA—N，其中所述PA氨基端多肽PA_N中的氨基酸序列具有與圖 1中所列的至少40%的氨基酸比對相同。 在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種表達PA氨基端多肽PA—N的野生型 或者突變型蛋白的方法，其中將所述聚合酶亞基PA氨基端多肽PA—N的基因序列通 過PCR方法以及分子克隆技術(shù)分別克隆到例如pGEX-6p 、 pGEX-4T等pGEX系列載體 (AmershamPharmacia) 、 pET系列載體(Novagen) 、 pMAL-c2 (Invitrogen)系列載體等質(zhì)粒 載體上，以表達氨基端多肽PA—N氨基末端融合GST的融和蛋白GST-PA—N;所述質(zhì)粒載體 含有青霉素抗性基因，所述PA氨基端PA_N多肽基因克隆時載體所用的酶切位點為選自由 pGEX-6p多克隆位點的BamHI、 Xhol構(gòu)成的組中的酶切位點；使用的氨基端PA—N基因克隆 片段酶切位點分別為BamHI及XhoI ;氨基端多肽PA—N的基因片段是通過使用PCR方法從病 毒株A/goose/Guangdong/1/96基因組中擴增獲得；將載體及插入片段分別使用相應(yīng)的DNA 內(nèi)切酶如選自由BamHI、Xho1構(gòu)成的組中的內(nèi)切酶處理后，通過T4DNA連接酶將插入基因與 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得克隆質(zhì)粒；將克隆好的如上所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 中，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細菌，通過使用0. lmM至lmM的IPTG誘導(dǎo)，將培養(yǎng)細菌通過離心得到表達所述融合蛋白的菌群。 在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種篩選與選自由鎂、錳、鋅、銅、鈷、鐵構(gòu)成的 組中的金屬離子，優(yōu)選鎂離子競爭結(jié)合氨基端多肽PA_N的候選化合物的方法，所述方法包 括(a)將氨基端多肽PA—N結(jié)合在固定載體的表面上；(b)將待測的候選化合物溶液與(a) 中所述經(jīng)固定的氨基端多肽PA—N接觸；(c)用洗脫液充分洗脫，除去未結(jié)合的候選化合物； (d)用洗脫液充分洗脫，得到待測試溶液；(e)測試所述待測試溶液中游離的金屬離子濃 度；(f)根據(jù)所述溶液中游離的金屬離子的濃度來推算待測候選化合物與氨基端多肽PA—N 的結(jié)合能力。 在一優(yōu)選具體實施方式
中，其中所述步驟(a)將氨基端多肽PA—N結(jié)合在固定的表 面上是通過共價交聯(lián)或通過將PA—N與親和介質(zhì)結(jié)合而實現(xiàn)的，所述親和介質(zhì)在固定的表 面上具有親和介質(zhì)的結(jié)合基團。 在一優(yōu)選具體實施方式
中，其中所述親和介質(zhì)可以是GST、 Flag-tag、 Myc-tag、 MBP-tag、 His-tag、特異性抗體等其它多肽，而固定表面上則是相應(yīng)的親和介質(zhì)的結(jié)合基團。 在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種篩選與選自由鎂、錳、鋅、銅、鈷、鐵構(gòu)成的 組中的金屬離子，優(yōu)選鎂離子競爭結(jié)合氨基端多肽PA_N的候選化合物的方法，其中候選化 合物選自同位素或其他化學分子標記蛋白，優(yōu)選地，其他化學分子標記選自綠色熒光蛋白、 各種其它融合多肽，例如結(jié)合過氧化物酶、磷酸水解酶、蛋白激酶、各種基團轉(zhuǎn)移酶等。
在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種篩選與選自由鎂、錳、鋅、銅、鈷、鐵構(gòu)成的 組中的金屬離子，優(yōu)選鎂離子競爭結(jié)合氨基端多肽PA_N的候選化合物的方法，其中所述的 固定的表面可以是親和層析柱。
蛋白質(zhì)的結(jié)晶及優(yōu)化 將用以上方法表達純化好的氨基端多肽PA_N濃縮至濃度約為5-30mg/ml，用氣相 懸滴法，使用結(jié)晶試劑(來自Hampton Research)篩選晶體生長條件，在多種結(jié)晶試劑條件 下獲得了初始晶體。 通過進一步優(yōu)化，其中，在使用不同pH緩沖液的條件下(pH4-9)含有約25% PEG8000 (母體晶體)或20% PEG3350硒代甲硫氨酸晶體溶液中都獲得了外觀良好的晶體。 在pH 6. 5的緩沖液中得到了較大的晶體，分辨率約為2. 2埃左右的母體晶體，硒代晶體可 衍射至3埃左右，并進而收集相應(yīng)的X射線衍射數(shù)據(jù)。
晶體數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析 使用FR-E X-射線衍射儀(來自Rigaku)在1. 5418埃的波長下首先收集到氨基 端多肽PA_N晶體的一套分辨率為2. 2埃的母體數(shù)據(jù)。然后使用位于美國芝加哥APS的同 步輻射儀(線站號碼SBC19ID ;檢測屏ADSC Q315)，在波長0. 9798和0. 9800埃波長下收 集到這個蛋白晶體分辨率達到2.9埃左右的吸收峰(Peak)和吸收邊(Edge)兩套硒原子衍 生物晶體數(shù)據(jù)。利用HKL2000(0twinowski1997)處理所收得的三套數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)母體晶體的 空間群是Pl空間群，晶胞參數(shù)為約a二51. l埃，b二59.8埃，c二67. 2埃，a =96.6° ， |3 =96.8° ，Y =109.5° ;而重金屬硒代甲硫氨酸的晶體具有P6(4)22的空間群，晶胞參 數(shù)為約a = b = 73. 8埃，c = 123. 4埃，a = |3 = 90° ， Y = 120° 。利用多波長反常 散射法(Hendrickson 1991)來進行計算相位，將處理得到的sca文件用SHELXD (Sheldrick1998)來查找硒原子，共找到6個硒代甲硫氨酸，將硒原子坐標，以及處理得到的Peak和 Edge兩套數(shù)據(jù)輸入程序MLPHARE，用它來計算相位，并進而使用匿程序做電子密度圖的修 飾，從計算得到的電子密度圖上能非常清楚地看到數(shù)個二級結(jié)構(gòu)(包括一些a螺旋和|3 折疊)，這樣可以搭出大約80個殘基，隨后經(jīng)過反復(fù)模型搭建以及使用CNS軟件包程序修 正，從而搭出初始模型。利用搭建的初始模型依據(jù)高分辨率的母體數(shù)據(jù)，使用Phaser程序 做分子置換，從而獲得母體數(shù)據(jù)的清晰解，進一步進行結(jié)構(gòu)模型的搭建，并交替使用CNS進 行修正。最終獲得結(jié)構(gòu)的R因子為23. 1%，自由1 因子為25.2%。最后將三個水分子以 及一個金屬鎂離子亦加入模型中。修正的結(jié)構(gòu)最終R因子和R-free因子分別為23. 1%和 25. 2% 。氨基端多肽PA_N的單體晶體結(jié)構(gòu)原子坐標參見表1。
實施例
實施例1 用于表汰流感病毒PA M某端多肽PA N的方法: 本發(fā)明的一種實施方式是將PA分成兩段進行表達，從而分別表達出PA的氨基端 前256氨基酸殘基片段以及257-716個氨基酸殘基片段，并將編碼這兩個蛋白多肽的兩個 基因片段分別克隆到大腸桿菌表達載體上，用于在細菌中進行蛋白質(zhì)的表達。單獨從表達 PA的N末端(1-256氨基酸)細菌中純化出PA的N端多肽，并將PA的N端肽用于蛋白質(zhì)結(jié) 晶。PA的羧基末端表達菌離心收集后備用，以便用于與PBIN端多肽的共純化。
將含有PB1氨基端前25位或者48位氨基酸以內(nèi)的多肽(不含第一位甲硫氨基 酸)以GST融合蛋白形式在細菌中進行表達。將流感病毒聚合酶蛋白亞基PA分段在細菌 中或者其它真核生物細胞中進行表達至少50%區(qū)段為257-716氨基酸區(qū)段中一部分的PA 蛋白片段的方法。流感病毒PA氨基端在大腸桿菌中的表達純化 通過分子克隆技術(shù)將流感病毒PA的氨基端(第l至256位氨基酸)克隆到 pGEX-Sp載體(來自Amersham Pharmacia Inc.)上，其克隆位點可以是BamHI以及XhoI。 將克隆得到的含有PA氨基端基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，進行蛋白質(zhì)的表 達，從而使細菌可以表達PA蛋白N端(氨基端)連接有GST融合蛋白并且含有可以被 ProScission蛋白酶(Amersham Biosciences)切割的酶切位點，從而可以進一步將GST蛋 白標簽與目的蛋白PA多肽分離。在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21細胞中使用終濃度為0. l-lmM左 右的IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌，獲得該蛋白的表達菌。所用載體含有氨芐青霉素抗性基因。克隆 構(gòu)建的融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌如BL21 (Novagen)后，在37度使用LB等細菌培 養(yǎng)基過夜培養(yǎng)細菌，大約12小時后按1 : 100左右轉(zhuǎn)接到大量培養(yǎng)基中，37度溫度下在搖 瓶中培養(yǎng)至OD為l.O左右，然后加入O. l-lmM的IPTG進行誘導(dǎo)表達，大約3至6小時后通 過離心收集細菌，收集的沉淀細菌可放于-20度至-80度冰箱中保存?zhèn)溆?，也可直接用于PA 氨基端多肽的純化。流感病毒PA羧基端和PB1多肽復(fù)合體的表達純化: 通過分子克隆技術(shù)將流感病毒PA的羧基端(第257至第716氨基酸)克隆到 pGEX-6p載體(來自Amersham Pharmacia Inc.)上，其克隆位點是BamHI及Notl 。將克隆 的含有PA羧基端基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，進行蛋白質(zhì)的表達，從而使細菌 可以表達蛋白N端(氨基端)連接有GST融合蛋白并且含有可以被ProScission蛋白酶
21(Amersham Biosciences)切割的酶切位點，從而可以進一步將GST蛋白標簽與目的蛋白PA 多肽分離。在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21細胞中使用終濃度為0. l-lmM左右的IPTG誘導(dǎo)大腸桿 菌，獲得該蛋白的表達菌。所用載體含有氨芐青霉素抗性基因?？寺?gòu)建的融合蛋白表達質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌如BL21(Novagen)后，先在37度使用LB等細菌培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)細菌，大 約12小時后按1 : 100左右轉(zhuǎn)接到大量培養(yǎng)基中，37度溫度下在搖瓶中培養(yǎng)至0D為1. 0 左右，隨后降低培養(yǎng)溫度至16度，然后加入0. l-lmM的IPTG進行誘導(dǎo)表達，大約12至24 小時后通過離心收集細菌，收集的沉淀細菌可放于-20度至-80度冰箱中保存?zhèn)溆?，也可?接用于純化。 將PBjN端48個氨基酸以內(nèi)的基因(發(fā)明人表達了PB1的氨基端前48個氨基 酸多肽以及前25個氨基酸多肽)同樣克隆到pGEX-6p載體的多克隆位點上，所用酶切位 點為BamHI以及Xhol，從而使細菌可以表達含GST融合蛋白，并且該融合蛋白含有可以被 ProScission蛋白酶(Amersham Biosciences)切割的蛋白酶位點，從而可以進一步分離 GST標簽以及目的蛋白PB1多肽。按如上PA融合蛋白表達方式在大腸桿菌BL21中表達融 合的GST-PB1,端肽的融合蛋白，抗性基因為氨芐青霉素抗性基因，蛋白質(zhì)表達是在37度， 使用誘導(dǎo)劑為IPTG。最后通過離心收集表達細菌，該細菌可以直接用于蛋白純化，也可暫時 儲存于-20度至-80度冰箱中備用。 將離心收集的表達GST-PA氨基端多肽的表達菌用含有約20mMTris-HCl(pH8. 0) 及250mM NaCl的緩沖液或者1XPBS(pH7. 4)磷酸緩沖液懸浮，使用超聲破菌儀破碎細胞，離 心分離除去不溶性沉淀，收集可溶性上清，使用Glutathione親和層析柱純化出GST-PA-N 端多肽，進而使用ProScission蛋白酶酶解融合蛋白，將融合蛋白酶解成GST(谷胱苷肽 S-轉(zhuǎn)移酶)和PA-N兩段，進而使用離子交換層析以及凝膠排阻層析純化出PA-N蛋白多肽。 將該蛋白濃縮至5-30mg/mL，用于晶體生長。 將表達的GST_PAe羧基端多肽的表達菌與表達GST-PB 1N短肽的表達菌分別使用 含有約20mMTris-HCl (pH8. 0)及250mM NaCl的緩沖液或者lxPBS(pH7. 4)磷酸緩沖液懸 浮，然后按比例混合兩種表達菌，使GST-PA和GST-PBl的蛋白總含量的摩爾比為O. 1 : 1 1 : 0. l，優(yōu)選使GST-PA和GST-PB 1的蛋白總含量的摩爾比為0. 5 : 1 1 : 0. 5，更優(yōu)選 使GST-PA和GST-PB 1的蛋白總含量接近摩爾比為1 : 1。 混合的細菌懸浮液通過超聲波或者其它細胞裂解方法裂解后，通過離心分離細 菌裂解物的不可溶部分以及可溶部分，將高速離心(約20，000g)后獲得的上清通過使用 Glutathione-S印harose親禾P柱(來自Amersham Pharmacia Inc.)來初步分離純化出這一 混合蛋白，含GST標簽的蛋白可以結(jié)合到Glutathione-S印harose親和柱上，而其它蛋白不 能結(jié)合到該親和柱上。蛋白結(jié)合到親和柱上以后使用如上所述的細菌懸浮緩沖液將雜蛋白 洗盡。使用適量的ProScission蛋白酶(來自Amersham Pharmacia Inc.)酶解在親和柱 上的混合的GST融合蛋白，此過程通常需大約24小時。然后將酶解切割下來的PAe與PB1N 融合蛋白用凝膠過濾Superdex-200(來自AmershamPharmacia Inc.)以及Q s印harose離 子交換層析(來自AmershamPharmacia Inc.)等方法進一步分離純化出PAC/PB1N短肽復(fù)合 體(層析柱均來源于Amersham Pharmacia Inc.)，通過SDS-PAGE凝膠電泳確定蛋白質(zhì)純度 后，純度一般可達90%以上。將通過以上步驟純化的蛋白使用濃縮管(來源于Millipore 公司)濃縮至大約5-30mg/mL左右用于進一步的結(jié)晶實驗。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知，流感病毒的PA的氨基端以及PA的羧基端PAC與PB1的 氨基端PBl,不僅可以在本文中所述的原核細胞如大腸桿菌細胞中表達，也可以在真核細胞 如昆蟲細胞中表達；同時可使用任何其它內(nèi)切酶、酶切位點、連接酶；也可以將待純化的目 標多肽與如GST的其它標簽融合，然后選用相對應(yīng)的分離純化的方法進行純化，最后再去 掉融合到目標多肽中的標簽，如上所述對本發(fā)明進行的各種更改和修飾均在本發(fā)明的保護 范圍內(nèi)。 應(yīng)當注意到，其中B型或C型流感病毒中與A型流感病毒的a螺旋及|3片相對 應(yīng)的區(qū)段分別如在圖IA及IB以及圖1C以及IOA和B中所示，在此不再一一贅述。
實施例2
M某端多肽PA N的結(jié)晶: 將如上方法表達純化好的氨基端多肽PA N濃縮至濃度約為5-30mg/mL，用氣相懸 滴法使用結(jié)晶試劑(來自Hampton Research等公司的Screen Kit 1/11、Index等試劑盒) 篩選晶體生長條件。經(jīng)過初步篩選，本發(fā)明人在多種不同的結(jié)晶試劑條件下獲得了初始晶 體。 通過進一步優(yōu)化，其中，在使用不同pH緩沖液的條件下(pH4-9)含有約25% PEG8000 (母體晶體)或20% PEG3350硒代甲硫氨酸晶體溶液中都獲得了外觀良好的晶體。 在pH 6. 5的緩沖液中得到了較大的晶體，分辨率約為2. 2埃左右的母體晶體，硒代晶體可 衍射至3埃左右，并進而收集相應(yīng)的X射線衍射數(shù)據(jù)。 應(yīng)當注意到，其中B型或C型流感病毒中與A型流感病毒的a螺旋及|3片相對 應(yīng)的區(qū)段分別如在圖IA及IB以及圖1C以及IOA和B中所示，在此不再一一贅述。
實施例3 氨某端多肽PA N的晶體結(jié)構(gòu): 使用FR-E X-射線衍射儀(來自Rigaku)在1. 5418埃的波長下首先收集到氨基 端多肽PA—N的一套分辨率為2. 9埃的母體數(shù)據(jù)。然后使用位于美國芝加哥APS的同步輻 射儀(線站號碼SBC 19ID ;檢測屏ADSC Q315)，在波長0. 9783和0. 9785埃波長下收集 到這個蛋白晶體分辨率達到3. 3埃左右的peak和edge兩套硒原子衍生物晶體數(shù)據(jù)。利用 HKL2000 (Otwinowski 1997)處理所收得的三套數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)母體晶體的空間群是PI空間群， 晶胞參數(shù)為約a = 51. 1 ±矣，b = 59. 8 ±矣，c = 67. 2埃，a = 96. 6° ， P = 96. 8° ， y = 109. 5° ;而重金屬硒代甲硫氨酸的晶體具有P6(4)22的空間群，晶胞參數(shù)為約a = b = 73. 8埃，c = 123. 4埃，a = p = 90° ， y = 120° 。利用多波長反常散射法(Hendrickson 1991)來進行計算相位，將處理得到的sca文件用SHELXD(Sheldrick 1998)來查找硒原子， 共找到6個硒代甲硫氨酸，將硒原子坐標，以及處理得到的Peak和Edge兩套數(shù)據(jù)輸入程序 MLPHARE，用它來計算相位，并進而使用匿程序做電子密度圖的修飾，從計算得到的電子密 度圖上能非常清楚的看到數(shù)個二級結(jié)構(gòu)(包括一些a螺旋和|3折疊)，這樣可以搭出大約 80個殘基，隨后經(jīng)過反復(fù)模型搭建以及使用CNS軟件包程序修正，從而搭出初始模型。利 用搭建的初始模型依據(jù)高分辨率的母體數(shù)據(jù)，使用Phaser程序做分子置換，從而獲得母體 數(shù)據(jù)的清晰解，進一步進行結(jié)構(gòu)模型的搭建，并交替使用CNS進行修正。最終獲得結(jié)構(gòu)的R 因子為23. 1%，自由R因子為25. 2%。最后將三個水分子以及一個金屬鎂離子亦加入模型 中。修正的結(jié)構(gòu)最終R因子和R-free因子分別為23. 1%和25. 2%。。
23
最終計算得到母體晶體的空間群是PI空間群，晶胞參數(shù)為約 a = 51. l埃，b = 59. 8埃，c = 67. 2埃，a = 96. 6° ， P = 96. 8° ， Y = 109.5° ， 重金屬硒代甲硫氨酸的晶體具有P6(4)22的空間群，晶胞參數(shù)為約 a = b = 73. 8埃，c = 123. 4埃，a = 0 = 90° ， Y = 120° 。 實施例4 PA氡某端多肽PA N結(jié)晶 將如上方法表達純化好的PA氨基端多肽PA_N的復(fù)合物濃縮至濃度約為5-30mg/ mL，用氣相懸滴法使用結(jié)晶試劑(來自Hampton Research等公司的Screen Kit 1/11、 Index等試劑盒)篩選晶體生長條件。經(jīng)過初步篩選，本發(fā)明人在多種不同的結(jié)晶試劑條件 下獲得了初始晶體。 通過進一步優(yōu)化，其中，在使用不同pH緩沖液的條件下(pH4-9)含有約25% PEG8000 (獲得母體晶體)或20% PEG3350 (獲得硒代甲硫氨酸晶體)溶液中都獲得了外觀 良好的晶體。在PH 6.5的緩沖液中得到了較大的晶體，獲得分辨率約為2.2埃左右的母體 晶體，而獲得的硒代晶體可衍射至3埃左右，獲得了 X射線衍射良好的晶體(參見圖2A及 圖3的A-D晶體圖片)。
實施例5 篩詵競爭結(jié)合M某端多肽PA N的小分子的方法 在篩選一種可以使氨基端多肽PA—N的小分子藥物過程中，將其中氨基端多肽PA— N的基因與表達GFP (綠色熒光蛋白)的基因融合，表達GFP融合的氨基端多肽PA_N，作為小 分子化合物解聚蛋白質(zhì)復(fù)合體的指示分子。通過分子克隆方法將氨基端多肽PA—N基因片 段連接到GFP基因片斷上，以便表達一個氨基端連接有GFP的氨基端多肽PA_N融合蛋白。
方法1 :以如上所述表達純化氨基端多肽PA_N的方法，表達純化氨基端有GST的 氨基端多肽PA_N融合蛋白即GST-PA_N融合蛋白。將GST-PA_N融合蛋白流經(jīng)并結(jié)合到 Glutathione親和柱上。由于該氨基端多肽PA_N含有GFP蛋白，因此GST_PA_N結(jié)合該親 和柱后，與GST-PA_N結(jié)合的融合蛋白使該親和柱呈綠色。結(jié)合GST-PA_N蛋白后的親和柱 用緩沖液充分洗滌，以徹底洗脫除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后，將供篩選的小分子化合物的混 合物流經(jīng)該親和柱(該混合物中不應(yīng)含有Glutathione或者其它可以使GST脫離親和柱而 被洗脫下來的成分)。進一步從混合物中逐級分離純化小分子，再通過如上的綠色GFP蛋白 示蹤方法，追蹤可以結(jié)合PA—N多肽的成分，進而最終確定候選的小分子化合物。如上方法 中，除了可以使用GST作為親和介質(zhì)外，還可以使用諸如Flag-tag、 Myc-tag、 MBP(Maltose binding protein麥芽糖結(jié)合蛋白)4恥、特異性抗體等其它多肽作為親和介質(zhì)結(jié)合基團， 相應(yīng)地，親和層析柱也要用相應(yīng)的親和介質(zhì)，如當使用Flag-tag時，可使用抗Flag-tag的 抗體(例如Sigma Inc.公司的anti-flag單克隆抗體)，將其固定于親和層析柱上作為結(jié) 合Flag的凝膠介質(zhì)。結(jié)合PA_N的化合物分子可以通過諸如質(zhì)譜等方法來確定其化學結(jié)構(gòu)。
方法2 :將PA—N單獨純化出來(融和蛋白或者非融和蛋白)，將其通過化學交聯(lián)方 法，共價交聯(lián)到凝膠介質(zhì)上，但保持蛋白質(zhì)不變性。將同位素標記的小分子化合物或小肽流 經(jīng)共價結(jié)合了的凝膠柱，使同位素標記的小分子化合物或小肽與PA—N蛋白結(jié)合，如果有可 以結(jié)合PA—N的化合物，就使得溶液中的小分子化合物或小肽濃度降低。使用緩沖液，洗脫 凝膠柱以去除雜質(zhì)，再使用尿素等使PA_N變性，使結(jié)合其上的小分子或小肽洗脫下來，通過質(zhì)譜分析等方法，分析結(jié)合于PA—N上的小分子或小肽，進而獲得該小分子或小肽的結(jié)構(gòu) 信息。該化合物可成為使PA_N失活的小分子藥物。
實施例6: 糊PA N縫隨本H會隹斜緣i十禾口餘隨臺e謹驢M弓l走己,翩 《禾中縫、舶誠f和,赫和U白勺誠 利用流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)設(shè)計和篩選用于治 療流感病毒感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物，具體的步驟如下根 據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來設(shè)計結(jié)合特定部位的多肽及化合物分子；根據(jù) 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽及化合物分子；根 據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯募盎衔锓肿咏Y(jié)合到含有與所述的氨基端PA—N 序列含有至少50%相同序列的任一亞型的流感病毒聚合酶蛋白中，進而分析結(jié)合情況的方 法；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯募盎衔锓肿咏Y(jié)合到含有與所述的氨基 端PA—N序列含有至少50X相同序列的任一亞型的流感病毒聚合酶蛋白中并結(jié)晶，從而通
過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子與蛋白的結(jié)合情況。
實施例7: 糊氡孺PA N白，本H會隹斜緣i十纖細刊統(tǒng)謹驢M弓麵赫 白勺疆 所選用的多肽序列至少有3位氨基酸序列比對與如上多肽相同的多肽有可能成 為潛在的干擾流感病毒聚合酶活性的多肽藥物。 任一亞型的流感病毒聚合酶亞基PA、PB1、PB2或者PA、PB1和PB2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)， 其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段，與所述的氨基端PA_N多肽具有至少40%的相同 序列。 任一亞型的流感病毒聚合酶亞基PA、PB1、PB2或者PA、PB1和PB2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，
其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段的主鏈三維結(jié)構(gòu)坐標，與所述的氨基端PA_N多肽
序列至少40%的主鏈碳骨架三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃。任一亞型的流感病毒聚合酶亞基PA、PB1、PB2或者PA、PB1和PB2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，
其中所包含的一個蛋白質(zhì)區(qū)段與所述的PB1N多肽的氨基酸2-12區(qū)段具有40%的序列同源性。 任何多肽或者小分子，與所述的流感病毒PA亞基上的關(guān)鍵氨基酸有相互作用。
所述的結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計方面的應(yīng)用。 基于氨基端PA—N多肽三維結(jié)構(gòu)進行與蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物或多肽篩選的方法， 包括通過蛋白結(jié)晶方法獲得氨基端PA—N多肽晶體，該蛋白晶體具有P1空間群，晶胞參數(shù) 為約a = 51. 1埃，b = 59. 8埃，c = 67. 2埃，a = 96. 6° ， P = 96. 8° ， y = 109. 5° ， 重金屬硒代甲硫氨酸的晶體具有P6(4)22的空間群，晶胞參數(shù)為約a 二b二73.8埃，c =123.4埃，a = |3 =90° ， y = 120° ;通過X射線衍射晶體學技術(shù)，獲得氨基端PA_ N多肽的三維結(jié)構(gòu)坐標；其中包括任何與該坐標中至少含有40%氨基酸殘基的主鏈碳骨架 三維坐標的平均根方差小于等于1. 7埃的結(jié)構(gòu)。 流感病毒亞型PA亞基蛋白的表達純化方法通過將PA分段在細菌或者真核表達 系統(tǒng)進行表達，所述采用此方法表達純化含有任何蛋白質(zhì)中某一區(qū)段與所述的序列相應(yīng)區(qū)段具有40%相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。 在一個優(yōu)選的實施例中，氨基端PA—N多肽在設(shè)計和篩選用于治療由流感病毒感 染引起的疾病的多肽、蛋白質(zhì)、化合物或藥物中的應(yīng)用。 在一個優(yōu)選的實施例中，用于治療由流感病毒感染引起的疾病的多肽，包括與如 上所述的氨基端PA—N多肽、至少一種所述的a螺旋或|3片層、至少一個氨基酸位點相互 作用的多肽。 在一個優(yōu)選的實施例中，用于治療由流感病毒感染引起的疾病的蛋白質(zhì)，包括與 如上所述的氨基端PA—N多肽、至少一種所述的a螺旋或|3片層、至少一個氨基酸位點相 互作用的蛋白質(zhì)。 在一個優(yōu)選的實施例中，用于治療由流感病毒感染引起的疾病的化合物，包括與 如上所述的氨基端PA—N多肽、至少一種所述的a螺旋或|3片層、至少一個氨基酸位點相 互作用的化合物。 在一個優(yōu)選的實施例中，藥物組合物，包括如上所述的多肽、蛋白質(zhì)或化合物。
本發(fā)明的藥物組合物通常包括一種載體或賦形劑，抗體和/或免疫結(jié)合物溶解于 一種藥學可接受的載體，水性載體為優(yōu)選。許多種水性載體可被應(yīng)用，如，緩沖鹽水等。這 些溶液是無菌的并且通常無不良物質(zhì)。這些組分可通過常規(guī)的、眾所周知的消毒技術(shù)進行 消毒。這些組分可包括藥學可接受的近似生理條件所需要的輔助物質(zhì)，比如調(diào)節(jié)pH的緩沖 劑、毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些組分中融合蛋白 的濃度變化很大，主要根據(jù)與所選的特定給藥方式和病人需要相一致的液體量、粘度、體重 等等進行選擇。 因此，本發(fā)明中的一個典型的向腦部給藥的藥學免疫毒素組分應(yīng)該每天施入大約 1. 2至1200ug。 一個典型的通過靜脈給藥治療乳腺、卵巢以及肺腫瘤的組分，每個病人每 天給入大約0. 1至10mg。每人每天0. 1至100mg的給藥量可以使用，尤其當藥物要施入一 個隱蔽的位置，并且沒有進入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)時，例如施入一個體腔或一個器官的腔 隙。制備可施藥組分的實際操作方法為專業(yè)人員了解或掌握，在一些出版物中有詳盡描述， 例如Remington' sPHA薩CEUTICAL SCIENCE, 19thed. ， Mack Publishing Company, Easton， Pennsylvania(1995)。 本發(fā)明中的組分可用于治療處理。在治療應(yīng)用中，組分被施入一名患有某種疾病 (比如一個膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌以及肺癌)的病人，其劑量要足以至少能夠減緩 或部分控制該種疾病及其并發(fā)癥。足以完成這些任務(wù)的劑量被稱為"治療有效劑量"。應(yīng) 用的有效劑量依賴于疾病的嚴重程度和病人的一般健康狀況。該組分的有效劑量能夠提供
某種癥狀的主觀可確認的緩解，抑或是被臨床醫(yī)師或其他有資格的觀察者所記錄的客觀改善。 患者需要和耐受的劑量及頻率決定是否單次或多次給藥。無論如何，應(yīng)當提供足 夠量該免疫毒素，以有效地治療患者。優(yōu)選地，藥物劑量一次性給入，但也可能周期性地給 入，直至達到某種治療效果或不良反應(yīng)阻止了治療的繼續(xù)。通常，這些劑量足以治療或改善 疾病的癥狀而不引起病人不能耐受的毒性。 本發(fā)明的免疫結(jié)合物可制備成胃腸外緩釋劑型(如植入物、油注射液、或微粒 子系統(tǒng))。對蛋白遞送系統(tǒng)的全面了解可參見Banga， A.J. ， THERAPEUTIC PEPTIDES ANDPROTEINS :FO誦LAT扁，PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Tech薩ic Publishing Company, Inc. ， Lancaster, PA， (1995)。微粒子系統(tǒng)包括微球體、微粒、微膠囊、納米微 膠囊、納米微球體、以及納米微粒。微膠囊以療效蛋白作為一個核心。在小球體中，治療 性物質(zhì)分散于粒子中。小于大約lPm的粒子、微球體、以及微膠囊通常分別被稱為納米 微粒、納米球體、和納米微膠囊。毛細血管的直徑大約為5ym，所以只有納米微?？山?jīng)靜 脈給藥。微粒子的直徑大約為100iim，通過皮下或肌肉注射給藥。例見，Kreuter， J.， COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter， ed. ， Marcel Dekker， Inc. ， New York, NY， pp. 219-342(1994);以及Tice&Tabibi， TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus， ed. ， Marcel Dekker， Inc. New York, NY， pp. 315-339， (1992) ， 二者在此均被 引用。 多聚體可被用于本發(fā)明中的免疫結(jié)合物組分的離子控制釋放。多種可用以藥物控 制釋放的可降解和不可降解的多聚體系在專業(yè)領(lǐng)域眾所周知(Langer，R. ，Accounts Chem. Res. 26 :537-542(1993))。例如，阻滯多聚體polaxamer 407在低溫下是粘性但可流動的， 但在體溫下形成半固體凝膠。它被證明是重組白細胞介素_2和尿素酶的形成和持續(xù)輸送 的一個有效載體(Johnston等，Pharm. Res. 9 :425-434(1992);及Pec等，J. Parent. Sci-Tech. 44(2) :58-65(1990))。同樣地，羥基磷灰石也已被用作蛋白控制釋放的一個微載體 (Ijntema等，Int. J. Pharm. 112 :215-224 (1994))。然而另一方面，脂質(zhì)體被用于脂類包 被的藥物的控制釋放和靶向運輸過程(Betageri等，LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co. ， Inc. ， Lancaster, PA(1993))。許多其它的治療蛋白控制釋 放系統(tǒng)已被了解。例見，美國專利，編號5，055，303，5， 188， 837， 4， 235， 871， 4， 501， 728， 4， 837， 028，4， 957， 735和5， 019， 369，5， 055， 303 ;5， 514， 670 ;5， 413， 797 ;5， 268， 164 ; 5， 004， 697 ;4， 902， 505 ;5， 506， 206， 5， 271， 961 ;5， 254， 342以及5， 534， 496，其中任何一個 都在此被引用。 0166] 實驗結(jié)果
0167] 表1單分子的PA_N原子坐標群如下
0168] 注釋坐標創(chuàng)建日期2008年05月08日，編輯日期2009年2月1日。
0169] 注釋3高分辨率范圍(埃)2. 2
OWO] 注釋3低分辨率范圍(埃)30
0171] X坐標Y坐標Z坐標占有率溫度因子原子
子 子 子 子 子 子 子 子 子
1
2
3
4
5
6
7
8
9
子10
CB LEUA CG LEUA CD1LEUA CD2 LEUA C LEUA 0 LEUA N LEUA CA LEUA N GLYA CA GLYA
-2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1
3. 950 3. 113 1. 703 3. 090 5. 682
5. 934
3. 258
4. 330
6. 533
7. 882
4. 473 3. 369 3. 867 2. 207
5. 991
6. 563 6. 395 5. 390
5. 854
6. 349
-17. 980 -17. 352 -17. 027 -18. 307 -17. 097 -18. 159 -16. 620 -16. 837 -16. 087 -16. 164
1. 0042. 68 A 1. 0046. 79 A 1. 0039. 32 A 1. 0045. 13 1. 0041. 97 1. 0042. 15 1. 0047. 49 1. 0044. 02 1. 0042. 00 1. 0040. 64
A A A A A A A
原子11CGLYA-18.6805.318-16.9251.0041.01A原子120GLYA-18.1144.427-17.5441.0044.33A原子13NSERA09.9955.453-16.9121.0040.13A原子14CASERA010.8814.524-17.6101.0041.09A原子15CBSERA0ll-9185.355-18.3601.0041.31A原子160GSERA0lZ.9294.549-18.9221.0047.46A原子17CSERA0ll-5563.640-16.5501.0039.90A原子180SERA0lZ.1024.178-15.5781.0040.03A原子19NMETA1ll-5382.309-16.6801.0037.39A原子20CAMETA1lZ.1801.527-15.6161.0035.12A原子21CBMETA1ll-8910.025-15.6811.0032.68A原子22CGMETA1lZ.678_0.726-14.5731.0031.16A原子23SDMETA111.985_0.567-12.8811.0035.48A原子24CEMETA110.653_1.712-13.1271.0035.22A原子25CMETA113.6731.674-15.5901.0035.84A原子260META114.2811.637-14.5341.0036.20A原子27NGLUA214.2571.813-16.7661.0037.08A原子28CAGLUA215.6941.949-16.9051.0042.95A原子29CBGLUA216.0011.955-18.3911.0043.58A原子30CGGLUA217.2531.267-18.7861.0049.09A原子31CDGLUA218.0722.155-19.6611.0050.99A原子320E1GLUA217.5722.546-20.7321.0048.73A原子330E2GLUA219.2032.■-19.2591.0057.22A原子34CGLUA216.1883.232-16.1871.0043.64A原子350GLUA217.3123.281-15.6691.0042.26A原子36Naspa3is-3144.248-16.1551.0045.03a原子37caaspa3is.5445.547-15.4921.0046.05a原子38CBASPA314.4486.586-15.8101.0049.57A原子39CGASPA314.5767.257-17.1681.0050.47A原子400D1ASPA313.7348.159-17.4111.0055.29A原子410D2aspa3is-4536.908-17.9791.0049.01a原子42caspa3is.4125.330-13.9931.0046.74a原子430ASPA316.2315.797-13.1991.0050.29A原子44NPHEA414.3324.653-13.6151.0044.42A原子45CAPHEA414.0724.403-12.2071.0042.70A原子46CBPHEA412.7873.579-12.0501.0039.48A原子47CGPHEA412.6872.841-10.7511.0037.51A原子48CD1PHEA412.1303.437_9.6111.0036.82A原子49CD2PHEA413.1881.546-10.6541.0031.62A
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40
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47/66頁
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與1918年歐洲爆發(fā)的大范圍流感的A型流感病毒株A/Brevig Mission/1/1918、以及兩種
64分別屬于B型流感病毒株B/Ann Arbor/1/1966和C型流感病毒株C/JJ/1950的PA蛋白序 列進行了比較，結(jié)果如圖l和圖4。 本發(fā)明人將PA分成兩部分，分別克隆了多個不同長度的PA基因兩部分的片段，并 在大腸桿菌中進行表達。其中PA分成的N端1-256殘基(參見圖1及圖2)和257-716殘 基(參見圖4A)通過與GST (谷胱甘肽硫?；D(zhuǎn)移酶Glutathione S-Transferase)的融合 都獲得了良好的表達純化。其中純化的PA氨基端(PA_N)獲得了良好衍射的母體晶體。 [1625] 體外結(jié)合實驗表明，按比例混合PA及PB1相應(yīng)多肽的表達菌，然后經(jīng)過 Glutathione親和柱及凝膠排阻層析等共純化這兩個蛋白，可以看到兩者可以獲得共純化， 表明純化的PA羧基端460氨基酸可以與GST-PB1多肽形成穩(wěn)定復(fù)合體。 [1626] 同時，體外結(jié)合實驗表明，獲得了 PA氨基端PA—N多肽的表達菌，并純化獲得了 PA 氨基端PA_N多肽。并用于結(jié)晶實驗，結(jié)果在多個條件下獲得了良好衍射的結(jié)晶。 [1627] 參考文獻 Adams， P. D. ， R. W. Grosse-Kunstleve， et al.(2002). 〃 PHENIX : building newsoftware for automated crysta11ographic structure determination. 〃 ActaCrystallogr D Biol Crystallogr58(Pt 11) :1948-54. [1629] B進ger， A. T. ， P. D. Adams， et al. (1998). 〃 Crystal lography醒R system: Anewsoftware suite for macromolecular structure determination. 〃 Acta CrystallogrD Biol Crystallogr 54(Pt5) :905_21. Deng， T. ， J. Sharps, et al. (2005). 〃 In vitro assembly of PB2with a PB1—PA dimersupports a new model of assembly of influenza A virus polymerase sub皿itsinto a functional trimeric complex. 〃 J Virol 79(13) :8669-74. [1631] Deng， T. ， J丄Sharps, et al. (2006). 〃 Role of the influenza virus heterotrimericRNA polymerase complex in the initiation of replication. 〃 .T Gen Virol 87(Ptll) :3373-7. Emsley， P. and K. Cowtan (2004). 〃 Coot :model-building tools for moleculargraphics. 〃 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60(Pt 12Pt 1): 2126-32. Fodor，E. ，M. Crow，et al. (2002). 〃 A single amino acid mutation in the PA sub皿itof the influenza vir us RNA polymerase inhibits endo皿cleolytic cleavage ofc即ped RNAs. 〃 T Virol 76(18) :8989-9001. Fodor，E. ，D. C. Pritlove，et al. (1994). 〃 The influenza virus panhandle is involvedin the initiation of transcription. 〃 J Virol 68(6) :4092-6. [1635] Hara， K. ， F. I. Schmidt, et al. (2006). 〃 Amino acid residues in the N_terminal regionof the PA sub皿it of influenza A virus RNA polymerase play a critical role inprotein stability, endo皿clease activity, c即binding, and virion RNApromoterbinding. 〃 J Virol 80(16) :7789-98. Hara， K. ， M. Shiota， et al. (2001). 〃 Influenza virus RNA polymerase PA sub皿it is anovel serine protease with Ser624 at the active site. 〃 Genes Cells 6(2) :87-97.[1637] He X. ， et al. (2008). 〃 Crystal structure of the polymerase PA_C :PB1_N complexfrom an avian influenza H5Nlvirus. 〃 Nature,454(7208) :1123-6. [1638] Hendrickson， W. A. (1991). 〃 Determination of macromolecular structures fromanomalous diffraction of synchrotron radiation. 〃 Science 254(5028) :51-8. [1639] Honda， A. ， K. Mizumoto， et al. (2002). 〃 Minimum molecular architectures fortranscription and replication of the influenza virus. 〃 Proc Natl Acad Sci U M 99(20) :13166-71. Hulse-Post， D. J. ， J. Franks, et al. (2007). 〃 Molecular changes in the polymerasegenes(PA and PB1)associated with high pathogenicity of H5N linfluenzavirus in mallard ducks. 〃 .T Virol 81 (16) :8515-24. Kawaguchi， A. ， T. Naito， et al. (2005). 〃 Involvement of influenza virus PA subunitin assembly of functional RNA polymerase complexes. 〃 .T Virol 79(2): 732-44. M墜ter， V. J. ， E. de Wit， et al. (2007). 〃 The molecular basis of the pathogenicity ofthe Dutch highly pathogenic human inflnuenza A H7N7 viruses. 〃 J Infect Disl96(2) :258-65. Murshudov， G. N. ， A. A. Vagin， et al. (1997) . 〃 Refinement of macromolecularstructures by the maximum-likelihood method. 〃 Ac to Crystallogr D BiolCrystallogr 53(Pt3) :240-55. 0twinowski， Z. M. ， Wladek(1997). 〃 Processing of x-ray diffraction data collectedin oscillation mode 〃 Methods in Enzymology 276 (MacromolecularCrysta llography，Part A) :307-326 Perez， D. R. and R. 0. Donis (2001). 〃 Functional analysis of PA binding byinfluenza a virus PB1 -effects on polymerase activity and viral infectivity. 〃 JVirol 75(17) :8127-36. Perrakis， A. ， R. Morris, et al. (1999). 〃 Automated protein model building combinedwith iterative structure refinement. 〃 Nat Struct Biol 6(5) :458-63. [1647] Sanz-Ezquerro， J.J. ， T. Zurcher， et al. (1996).〃 The amino-terminal one—third of theinfluenza virus PA protein is responsible for the induction of proteolysis. 〃 JVirol 70(3) :1905-11. Sheldrick， G.M. ， Ed. (1998). Direct Methods for Solving MacromolecularStructures. Dordrecht,The Netherlands,Kluwer Academic Publishers. [1649] Sugiura，A. ，M. Ueda，et al.(1975). 〃 Further isolation and characterization oftemperature—sensitive mutants of influenza virus. 〃 Virology65 (2) :363-73. Taubenberger, J. K. and D. M. Morens (2007). 〃 The Pathology of Influenza Viruslnfections. 〃 A皿u Rev Pathol. Vonrhein， C. ， E. Blanc， et al. (2007). 〃 Automated structure solution withautoSHARP. " Methods Mol Biol 364 :215-30.
66[1652] [1653] [1654]
構(gòu) [1656] [1657] [1658] [1659] [1660] [1661] [1662] [1663] [1664] [1665] [1666] [1667] [1668] [1669] [1670] [1671] [1672] [1673] [1674] [1675] [1676] [1677] [1678] [1679] [1680] [1681] [1682] [1683] [1684] [1685] [1686] [1687] [1688] [1689]
序列表
〈110〉中國科學院生物物理研究所
〈120〉流感病毒聚合酶亞基PA氨基端多肽的表達純化及PA氨基端多肽的晶體結(jié)
〈130〉P24383IBP
〈210>1
〈211>716
〈212>PRT
MetGluAspPheValArgGinCysPheAsnProMetlieValGluLeu
151015
AlaGluLysAlaMetLysGluTyrGlyGluAspProLyslieGluThr
AsnLysPhe 35AlaAlalieCysThr 40HisLeuGluValCys 45PheMetTyr
SerAspPheHisPhelieAspGluArgGlyGluSerThrlielieGlu
SerGlyAspProAsnAlaLeuLeuLysHisArgPheGlulielieGlu
GlyArgAspArgThrMetAlaTrpThrValValAsnSerlieCysAsn
ThrThrGlyValGluLysProLysPheLeuProAspLeuTyrAspTyr
LysGluAsnArgPhelieGlulieGlyValThrArgArgGluValHis
ThrTyr 130TyrLeuGluLysAla 135AsnLyslieLysSer 140GluLysThrHis
lieHisliePheSerPheThrGlyGluGluMetAlaThrLysAlaAsp
TyrThrLeuAspGluGluSerArgAlaArglieLysThrArgLeuPhe
ThrlieArgGinGluMetAlaSerArgGlyLeuTrpAspSerPheArg
GinSerGluArgGlyGluGluThrlieGluGluArgPheGlulieThr
GlyThrMetCysArgLeuAlaAspGinSerLeuProProAsnPheSer
SerLeuGluLysPheArgAlaTyrValAspGlyPheGluProAsnGly
225230235240
CyslieGluGlyLysLeuSerGinMetSerLysGluValAsnAlaArg
lieGluProPhe 260LeuLysThrThrPro 265ArgProLeuArgLeu 270ProAsp
GlyProProCysSerGinArgSerLysPheLeuLeuMetAspAlaLeu
LysLeuSerlieGluAspProSerHisGluGlyGluGlylieProLeu
TyrAspAlalieLysCysMetLysThrPhePheGlyTrpLysGluPro
305310315320
AsnlieValLysProHisGluLysGlylieAsnProAsnTyrLeuLeu
AlaTrpLysGin 340ValLeuAlaGluLeu 345GinAsplieGluAsn 350GluGlu1690]LyslieProLysThrLysAsn
1691]355
1692]AlaLeuGlyGluAsnMetAla
1693]LysAspValSerAspLeuArg
1694]ArgSerLeuAlaSerTrplie
1695]LeuThrAspSerSerTrplie
1696]420
1697]AlaProlieGluHislieAla
1698]GluValSerHisCysArgAla
1699]lieAsnThrAlaLeuLeuAsn
1700]465470
1701]GinLeulieProMetlieSer
1702]LysThrAsnLeuTyrGlyPhe
1703]AsnAspThrAspValValAsn
1704]AspProArgLeuGluProHis
1705]lieGlyAspMetLeuLeuArg
1706]MetPheLeuTyrValArgThr
1707]TrpGlyMetGluMetArgArg
1708]GluSerMetlieGluAlaGlu
1709]595
1710] 1711]LysGlu 610PhePheGluAsnLys 615
1712]ProLysGlyMetGluGluGly
1713]625630
1714]LeuAlaLysSerValPheAsn
1715]645
1716]GlyPheSerAlaGluSerArg
1717]660
1718]ArgAspAsnLeuGluProGly
1719]675
1720]AlalieGluGluCysLeulie
1721]690695
1722]SerTrpPheAsnSerPheLeu
1723]
1724]〈210>2
1725]〈211>757
1726]〈212>PRT
1727]〈213〉流感病毒聚合酶亞基PBl1728]〈400>2
MetArgLysThrSerGinLeuLysTrp
360365
ProGluLysValAspPheGluAspCys
GinTyrAspSerAspGluProLysPro
GinSerGluPheAsnLysAlaCysGlu
GluLeuAspGlulieGlyGluAspVal
425430
SerMetArgArgAsnTyrPheThrAla
ThrGluTyrlieMetLysGlyValTyr
AlaSerCysAlaAlaMetAspAspPhe
475■
LysCysArgThrLysGluGlyArgArg
lielieLysGlyArgSerHisLeuArg
PheValSerMetGluPheSerLeuThr
LysTrpGluLysTyrCysValLeuGlu
ThrAlalieGlyGinValSerArgPro
AsnGlyThrSerLyslieLysMetLys
CysLeuLeuGinSerLeuGinGinlie
SerSerValLysGluLysAspMetThr
600605
SerGluThrTrpProlieGlyGluSer
620
SerlieGlyLysValCysArgThrLeu
635640
SerLeuTyrAlaSerProGinLeuGlu
650655
LysLeuLeuLeulieValGinAlaLeu
665670
ThrPheAspLeuGlyGlyLeuTyrGlu
680685
AsnAspProTrpValLeuLeuAsnAla
700
ThrHisAlaLeuLys1729]MetAspValAsnProThrLeuLeuPheLeuLysValProAlaGinAsn
1730]AlalieSerThrThrPheProTyrThrGlyAspProProTyrSerHis
1731]GlyThrGlyThrGlyTyrThrMetAspThrValAsnArgThrHisGin
1732]TyrSerGluLysGlyLysTrpThrThrAsnThrGluThrGlyAlaPro
1733]GinLeuAsnProlieAspGlyProLeuProGluAspAsnGluProSer
1734]GlyTyrAlaGinThrAspCysValLeuGluAlaMetAlaPheLeuGlu
1735]859095
1736]LysSerHisProGlyliePheGluAsnSerCysLeuGluThrMetGlu
1737]100105110
1738]lieValGinGinThrArgValAspLysLeuThrGinGlyArgGinThr
1739]115120125
1740]TyrAspTrpThrLeuAsnArgAsnGinProAlaAlaThrAlaLeuAla
1741]130135140
1742]AsnThrlieGluValPheArgSerAsnGlyLeuThrAlaAsnGluSer
1743]145150155160
1744]GlyArgLeulieAspPheLeuLysAspValMetGluSerMetAspLys
1745]165170175
1746]GlyGluMetGlulielieThrHisPheGinArgLysArgArgValArg
1747]180185190
1748]AspAsnMetThrLysLysMetValThrGinArgThrlieGlyLysLys
1749]195200205
1750]LysGinArgLeuAsnLysArgSerTyrLeulieArgAlaLeuThrLeu
1751]210215220
1752]AsnThrMetThrLysAspAlaGluArgGlyLysLeuLysArgArgAla
1753]225230235240
1754]lieAlaThrProGlyMetGinlieArgGlyPheValTyrPheValGlu
1755]245250255
1756]ThrLeuAlaArgSerlieCysGluLysLeuGluGinSerGlyLeuPro
1757]260265270
1758]ValGlyGlyAsnGluLysLysAlaLysLeuAlaAsnValValArgLys
1759]275280285
1760]MetMetThrAsnSerGinAspThrGluLeuSerPheThrlieThrGly
1761]290295300
1762]AspAsnThrLysTrpAsnGluAsnGinAsnProArgMetPheLeuAla
1763]305310315320
1764]MetlieThrTyrlieThrArgAsnGinProGluTrpPheArgAsnVal
1765]LeuSerlieAlaProlieMetPheSerAsnLysMetAlaArgLeuGly
1766]340345350
1767]LysGlyTyrMetPheGluSerLysSerMetLysLeuArgThrGinlie[1768]ProAlaGluMetLeuAlaSerlieAspLeuLysTyrPheAsnGluSer370375380ThrArgLysLyslieGluLyslieArgProLeuLeulieAspGlyThr385390395400AlaSerLeuSerProGlyMetMetMetGlyMetPheAsnMetLeuSer405410415ThrValLeuGlyValSerlieLeuAsnLeuGlyGinLysArgTyrThr420425430LysThrThrTyrTrpTrpAspGlyLeuGinSerSerAspAspPheAla435440445LeulieValAsnAlaProAsnHisGluGlylieGinAlaGlyValAsp450455460ArgPheTyrArgThrCysLysLeuValGlylieAsnMetSerLysLys465470475■LysSerTyrlieAsnArgThrGlyThrPheGluPheThrSerPhePhe485490495TyrArgTyrGlyPheValAlaAsnPheSerMetGluLeuProSerPhe500505510GlyValSerGlylieAsnGluSerAlaAspMetSerlieGlyValThr515520525VallieLysAsnAsnMetlieAsnAsnAspLeuGlyProAlaThrAla530535540GinMetAlaLeuGinLeuPhelieLysAspTyrArgTyrThrTyrArg545550555560CysHisArgGlyAspThrGinlieGinThrArgArgSerPheGluLeu565570575LysLysLeuTrpGluGinThrArgSerLysAlaGlyLeuLeuValSer580585590AspGlyGlyProAsnLeuTyrAsnlieArgAsnLeuHislieProGlu595600605ValCysLeuLysTrpGluLeuMetAspGluAspTyrGinGlyArgLeu610615620CysAsnProLeuAsnProPheValSerHisLysGlulieGluSerVal625630635640AsnAsnAlaValValMetProAlaHisGlyProAlaLysSerMetGlu645650655TyrAspAlaValAlaThrThrHisSerTrplieProLysArgAsnArg660665670SerlieLeuAsnThrSerGinArgGlylieLeuGluAspGluGinMet:1807]675680685
:1808]TyrGinLysCysCysAsnLeuPheGluLysPhePheProSerSerSer
:1809]690695700
:1810]TyrArgArgProValGlylieSerSerMetValGluAlaMetValSer
:1811]705710715720
:1812]ArgAlaArglieAspAlaArglieAspPheGluSerGlyArglieLys
:1813]725730735
:1814]LysGluGluPheAlaGlulieMetLyslieCysSerThrlieGluGlu
:1815]LeuArgArgGinLys
:1816]75權(quán)利要求
一種流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N為所述流感病毒聚合酶亞基PA的從約1～約50位氨基酸至在約150至300位范圍內(nèi)的氨基酸，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐標，或者流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40％氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差(R.M.S.D，Root Mean Square Deviation)小于或等于1.7埃。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)，其 中所述流感病毒選自A、 B、 C型流感病毒，其中所述流感病毒優(yōu)先選自A型流感病毒株A/ goose/G麗gdong/l/96、A/Brevig Mission/1/1918 ;B型流感病毒株B/A皿Arbor/1/1966 或C型流感病毒株C/JJ/1950。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA—N的晶體三維結(jié)構(gòu)， 其中所述的母體晶體具有PI空間群，晶胞參數(shù)為約a = 51. 1埃，b = 59. 8埃，c = 67. 2 埃，a =96.6° ，13 =96.8° ，y =109.5° ，重金屬硒代甲硫氨酸的晶體具有P6 (4) 22的 空間群，晶胞參數(shù)為約a = b = 73. 8埃，c = 123. 4埃，a = p = 90° ， y = 120° 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三 維結(jié)構(gòu)，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA_N由所述流感病毒聚合酶PA 的氨基端PA—N中的a螺旋l，即含2-9位的氨基酸區(qū)段，a螺旋2，即含11_22位的氨基 酸區(qū)段，a螺旋3，即含32-48位的氨基酸區(qū)段，a螺旋4，即含84_92的氨基酸區(qū)段，a螺 旋5，即含127-138位的氨基酸區(qū)段，a螺旋6，即含165-184位的氨基酸區(qū)段，a螺旋7， 即含187-191位的氨基酸區(qū)段，以及五個主要的13折疊片，包括P片l，即含76-78位的氨 基酸區(qū)段，P片2，即含109-111位的氨基酸區(qū)段，13片3，即含116-123位的氨基酸區(qū)段， 13片4，即含144-149位的氨基酸區(qū)段，13片5，即含154-157位的氨基酸區(qū)段，共同構(gòu)成所 述PA的氨基端PA—N的主要部分，其中，由所述的平行的13片l-5組成一個扭曲的平面，其 它所述的a螺旋圍繞在這一平面周圍，其中所述B型或C型流感病毒中與A型流感病毒相 對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三 維結(jié)構(gòu)，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA—N中結(jié)合有一個選自鎂、錳、 鋅、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，該金屬離子主要由三個水分子以及氨基酸殘基Glu80 以及Aspl08至少之一提供配位，其中參與這一結(jié)合的氨基酸還有選自His41、 Glul19、 Leul06以及Pro107中的至少之一，其中所述B型或C型流感病毒中的與A型流感病毒相應(yīng) 的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，優(yōu)選地，其中所述金屬離子為鎂離子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體 三維結(jié)構(gòu)，其中所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端PA_N含有一個與其它內(nèi)切核 酸酶相似的(P)DX,(D/E)XK序列區(qū)域，其中在所述A型流感病毒的聚合酶亞基PA的氨基端 PA_N中各氨基酸可以代表如下P皿D，X (11) E119X (15) K134，其中所述B型或C型流感病毒中 與A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體 三維結(jié)構(gòu)，其中T157、E153、E154、K158、D160、E165、E166、R168、R170和Lysl72位于P片 層134以及a7之間的序列中，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體 三維結(jié)構(gòu)，其中至少二個，優(yōu)選至少三個選自由流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N中的 Argl79、Aspl89、Argl92、Glnl93和Glu126等構(gòu)成的組中的氨基酸位于一個臨近的區(qū)域，參 與與蛋白質(zhì)或核苷酸的相互作用，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相 對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1 8任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三 維結(jié)構(gòu)，其中所述A型流感病毒聚合酶亞基PA位于PA氨基端PA—N的所述a螺旋1以及 a螺旋2形成一個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，其中一些氨基酸殘基共同組成一個鄰近的帶電荷的表面， 包括氨基酸殘基Glu2、 Asp3、 Arg6、 GlnlO、 Glul5、 Glul8、 Lysl9、 Lys22、 Asp27和Lys29，其 中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中 所示。
10. —種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA—N中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自 Glu80、 Aspl08、 His41、 Glul19、 Leul06以及Pro107等構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多 肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述流感病毒選自A、 B、 C型流感 病毒，其中所述流感病毒優(yōu)先選自A型流感病毒株A/goose/Guangdong/1/96、 A/Brevig Mission/1/1918 ;B型流感病毒株B/Ann Arbor/1/1966或C型流感病毒株C/JJ/1950，其 中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中 所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Glu80、Aspl08、His 41、Glull9、Leu106 以及Pro107中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的 原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7埃。
11. 一種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N中由Glu2、 Asp3、 Arg6、 GlnlO、 Glul5、 Glul8、 Lysl9、 Lys22、 Asp27和Lys29構(gòu)成的組中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸 結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述B型或C型流感病毒 中與所述A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或蛋白 質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Glu2、 Asp3、 Arg6、 GlnlO、 Glul5、 Glul8、 Lysl9、 Lys22、 Asp27和 Lys29構(gòu)成的組中的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的 主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7埃。
12. —種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N中由Argl79、 Aspl89、 Argl92、 Glnl93和Glul26構(gòu)成的組中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機 或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述B型或C型流感病毒中與所述A型流感病毒相 對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與 Argl79、Aspl89、Argl92、Gln193和Glul26構(gòu)成的組中的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個 氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根 方差小于或等于1.7埃。
13. —種與流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA—N中由T157、E153、E154、K158、D160、 E165、 E166、 R168、 R170和Lysl72構(gòu)成的組中的至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸結(jié)合的多 肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述B型或C型流感病毒中與所述 A型流感病毒相對應(yīng)的區(qū)段的氨基酸分別如在圖1中所示，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與T157、E153、E154、K158、D160、E165、E166、R168、R170和Lysl72構(gòu)成的組中 的氨基酸中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標的主鏈碳骨架的原子 結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1. 7埃。
14. 一種包含權(quán)利要求10 13任一項所述的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或 免疫結(jié)合物的組合物，可選地包括載體或賦形劑。
15. 權(quán)利要求14所述的組合物在制備治療由流感病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
16. 權(quán)利要求1 10任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三維 結(jié)構(gòu)在設(shè)計和篩選用于治療流感病毒感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化 合物、抗體或免疫結(jié)合物中的應(yīng)用，包括根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來設(shè)計結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、無機 或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，通過計算機模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、 無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子；將根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯摹⒌鞍踪|(zhì)或無機或有機化合物、抗體或 免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述的PA—N序列含有至少50%相同序列的任一亞型的流感 病毒聚合酶蛋白中，進而分析結(jié)合情況；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標，設(shè)計或?qū)ふ业亩嚯?、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗體或免 疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述PA_N序列含有至少50%相同序列的任一亞型的流感病毒 聚合酶蛋白中并結(jié)晶，從而通過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子與蛋 白的結(jié)合情況；其中與所述PA_N序列含有至少50 %相同序列的任一亞型的流感病毒聚合酶蛋白結(jié)合 的所述多肽、蛋白質(zhì)或無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子即為候選化合物。
17. 任一亞型的流感病毒聚合酶的三個亞基PA、PB1、PB2或者PA、PB1和PB2復(fù)合體的 結(jié)構(gòu)，其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段，與所述PA—N蛋白質(zhì)具有至少40X的相同序 列。
18. 任一亞型的流感病毒聚合酶亞基PA、PB1、PB2或者PA、PB1和PB2復(fù)合體的三維立 體結(jié)構(gòu)，其中所包含的一個蛋白質(zhì)或其某一區(qū)段的主鏈三維結(jié)構(gòu)坐標，與所述的PA—N蛋白 質(zhì)具有與所述PA_N蛋白質(zhì)序列至少40%的主鏈碳骨架的原子三維坐標的平均根方差小于 等于1.7埃。
19. 一種多肽或者小分子，其特征在于與所述流感病毒PA亞基上的任一氨基酸有相互 作用。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1 IO任一項所述的結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計方面的應(yīng)用。
21. 基于流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多 肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物的方法，包括通過蛋白結(jié)晶方法獲得含 有PA—N的晶體，或者獲得含有PA—N蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu)坐標；其中所述三維結(jié)構(gòu)包括任 何與該坐標中至少含有40%氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標的平均根方差小于等 于1.7埃的結(jié)構(gòu)。
22. 基于流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多 肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物的方法，包括使用的三維分子組合具有權(quán)利要求7 9任一項所述的流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)或權(quán) 利要求10 13任一項所述的多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物中的所 述氨基酸殘基的組中的至少3個具有主鏈碳骨架原子三維坐標的平均根方差小于等于1. 7 埃的結(jié)構(gòu)在篩選多肽、蛋白質(zhì)、無機或有機化合物、抗體或免疫結(jié)合物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端PA_N為所述流感病毒聚合酶亞基PA的從約1～約50位氨基酸至在約150至300位范圍內(nèi)的氨基酸，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐標，或者流感病毒聚合酶亞基PA的氨基端的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40％氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1.7埃。本發(fā)明還提供對流感病毒聚合酶亞基PA氨基端PA_N的表達、純化和結(jié)晶的方法；以及PA氨基端PA_N的晶體結(jié)構(gòu)及晶體結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計方面的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/68GK101792745SQ20091007793
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者劉迎芳, 饒子和 申請人:中國科學院生物物理研究所