專利名稱：：對(duì)有價(jià)值化合物進(jìn)行微生物生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)微生物培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)有價(jià)值化合物的領(lǐng)域，所述有價(jià)值化合物優(yōu)選為蛋白質(zhì)，或次級(jí)代謝產(chǎn)物或原樣的生物質(zhì)。
背景技術(shù)：
：為了生產(chǎn)有價(jià)值化合物的目的對(duì)微生物的培養(yǎng)可在下述條件下完成，其中，向培養(yǎng)物中補(bǔ)充能導(dǎo)致生長(zhǎng)限制的量的至少一種營(yíng)養(yǎng)物，特別是在培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期。典型地，營(yíng)養(yǎng)物限制導(dǎo)致對(duì)所培養(yǎng)的微生物而言氮、碳或二者的限制。一方面由于生產(chǎn)蛋白質(zhì)和其它有價(jià)值化合物逐漸增長(zhǎng)的工業(yè)重要性，另一方面由于消耗的每克糖或每摩爾氧形成的生物質(zhì)的低產(chǎn)率，仍然需要獲得經(jīng)在微生物中生產(chǎn)蛋白質(zhì)和其它有價(jià)值化合物的改進(jìn)方法。本發(fā)明提供了經(jīng)改進(jìn)的方法，用于高效制造蛋白質(zhì)和其它有價(jià)值化合物。附圖概述圖l:基于消耗的氧的生物質(zhì)產(chǎn)率(YXO)，與比生長(zhǎng)速率相對(duì)圖2:基于消耗的糖的生物質(zhì)產(chǎn)率(YXS)，與比生長(zhǎng)速率相對(duì)圖3:基于消耗的氧的植酸酶產(chǎn)率(Ypo)，任意單位，與比生長(zhǎng)速率相對(duì)圖4:基于消耗的糖的植酸酶產(chǎn)率(Yps)，任意單位，與比生長(zhǎng)速率相對(duì)
發(fā)明內(nèi)容在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)培養(yǎng)微生物生產(chǎn)有價(jià)值化合物的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，其中在整個(gè)培養(yǎng)周期中過(guò)量提供所有營(yíng)養(yǎng)物，并且向培養(yǎng)物中補(bǔ)充合適數(shù)量的氧，以保持所述培養(yǎng)物處于氧限制的條件下。用于培養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵的，只要在整個(gè)培養(yǎng)周期中過(guò)量提供所有營(yíng)養(yǎng)物即可。特征"過(guò)量提供"是指所有的營(yíng)養(yǎng)物以足夠的量提供，以避免在微生物生長(zhǎng)中造成限制。在本文上下文中，營(yíng)養(yǎng)物可以僅以批次提供(即僅供應(yīng)進(jìn)初始培養(yǎng)基)，或可在培養(yǎng)過(guò)程中額外給料進(jìn)培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，提供給初始培養(yǎng)基后緊接著將一種或多種營(yíng)養(yǎng)物給料進(jìn)培養(yǎng)物中。更優(yōu)選地，給料的營(yíng)養(yǎng)物至少為碳源和/或氮源。顯然，營(yíng)養(yǎng)物不能以引起抑制效應(yīng)或毒性效應(yīng)的量提供。根據(jù)本發(fā)明，向培養(yǎng)物中給料合適量的氧，以維持培養(yǎng)物處于氧限制的條件下。"合適量的氧"在本文中被定義為能夠在培養(yǎng)期間實(shí)現(xiàn)氧限制條件的、給料至培養(yǎng)物中的氧的量。在本發(fā)明上下文中，OTR(氧轉(zhuǎn)移速率)是氧從氣相轉(zhuǎn)移至液相(培養(yǎng)基)的速率。OTR被表示為每單位時(shí)間的氧量(例如摩爾/小時(shí))。可從進(jìn)入發(fā)酵罐的氧的量和輸出氣體中測(cè)量到的氧的量之間的差異方便地確定OTR。通常，氧作為空氣給料。然而也可以向培養(yǎng)基中給料純氧和/或富含氧的空氣和/或空氣和氧分別給料。在本發(fā)明上下文中，OUR(氧吸收速率)為微生物消耗給料至培養(yǎng)基中的氧的速率。為了將培養(yǎng)基維持在根據(jù)本發(fā)明的氧限制下，給料至培養(yǎng)基中的氧的量不應(yīng)超過(guò)被微生物消耗的氧數(shù)量。換言之，OTR應(yīng)該與OUR基本相同。"基本相同"是指OTR與OUR相同，誤差優(yōu)選正或負(fù)10%，更優(yōu)選地，5%。優(yōu)選地，向培養(yǎng)物中給料合適量的氧以進(jìn)一步確保OTR盡可能地高，即，如例如發(fā)酵罐構(gòu)型和/或氣體進(jìn)料中氧濃度所允許地高，只要微生物能夠立刻消耗氧。然而。技術(shù)人員知道也可以在低于可達(dá)到的最大OTR的OTR的氧限制下實(shí)施培養(yǎng)方法，例如為最大OTR值的80%或90%。當(dāng)OTR與OUR基本相同時(shí)，典型地，培養(yǎng)基中的溶解氧濃度將是恒定的，并且如果氧限制控制培養(yǎng)，則溶解氧會(huì)是零或者接近零。確定根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法中是否存在氧限制的優(yōu)選方法是測(cè)定增加營(yíng)養(yǎng)物給料對(duì)OTR的影響。如果營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)料的增加不伴隨OTR的增加，則存在氧限制。確定根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法中是否存在氧限制的最優(yōu)選方法是檢測(cè)例如攪拌器速度的輕微降低(例如5%)對(duì)OTR的影響。如果OTR也降低，則存在氧限制。如果OTR不降低和/或僅溶解的氧濃度降低，則不存在氧限制。用來(lái)調(diào)節(jié)OTR的措施為技術(shù)人員公知。優(yōu)選地，經(jīng)調(diào)節(jié)的氧轉(zhuǎn)移速率(OTR)條件可通過(guò)調(diào)節(jié)至少一種下述參數(shù)來(lái)完成，所述參數(shù)選自提高攪動(dòng)、提高充氣、提高超壓、提高輸入氣流中的氧百分比(富集氧)、減少培養(yǎng)基重量、降低整體培養(yǎng)基粘度。為了調(diào)節(jié)整體培養(yǎng)基粘度，可采取涉及培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基稀釋度、溫度改變、營(yíng)養(yǎng)物(例如根據(jù)WO03/029439的碳水化合物)的周期性脈沖間歇(cyclicpulse-pause)補(bǔ)料的措施。優(yōu)選地，通過(guò)將培養(yǎng)基溫度改變?yōu)楸茸罴焉L(zhǎng)發(fā)生的水平高或低2'C到6。C之間的水平來(lái)調(diào)節(jié)整體培養(yǎng)基粘度。更優(yōu)選地，通過(guò)將培養(yǎng)基溫度提高為比最佳生長(zhǎng)發(fā)生的水平高2'C到6t:之間的水平來(lái)降低整體培養(yǎng)基粘度，特別是對(duì)于絲狀真菌，如A^e一仏"m'^^。當(dāng)然，需要時(shí)可進(jìn)行相反措施以降低氧轉(zhuǎn)移。在這種情況下，通過(guò)將培養(yǎng)基的溫度降低為比最佳生長(zhǎng)發(fā)生的水平低2'C到6'C之間的水平來(lái)提高整體培養(yǎng)基粘度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)有規(guī)律地測(cè)量OTR(如每1小時(shí)或每2小時(shí))，以及根據(jù)測(cè)量的OTR與OUR設(shè)定點(diǎn)的對(duì)比來(lái)調(diào)節(jié)OTR(例如通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌器速度)，將微生物培養(yǎng)基維持在氧限制下。OUR設(shè)定點(diǎn)將取決于被培養(yǎng)的微生物和培養(yǎng)情況，典型地，包括例如培養(yǎng)管類型、攪拌器配置、培養(yǎng)基類型和營(yíng)養(yǎng)物給料條件。因此，用于具體培養(yǎng)方法的OUR設(shè)定點(diǎn)是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)通過(guò)確定OUR值來(lái)確立的，所述OUR值伴隨盡可能高的OTR，只要被轉(zhuǎn)移的氧立刻被微生物消耗?？稍谡麄€(gè)培養(yǎng)周期中將培養(yǎng)物維持在氧限制條件下。優(yōu)選地，培養(yǎng)物在生產(chǎn)期期間被維持在氧限制的條件下。在這種情況下，在微生物足夠生長(zhǎng)后確立并維持氧限制的條件。技術(shù)人員明白生物質(zhì)最小密度是氧限制發(fā)生的必要條件，即氧限制在足夠的生長(zhǎng)后確立。換言之，優(yōu)選地，在培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期，即生產(chǎn)有價(jià)值化合物的時(shí)期確立并維持氧限制的條件。典型地，微生物培養(yǎng)方法可分為涉及生物質(zhì)形成的生長(zhǎng)期和涉及有價(jià)值化合物產(chǎn)生的生產(chǎn)期。技術(shù)人員會(huì)了解培養(yǎng)的兩個(gè)時(shí)期可以不嚴(yán)格地分開(kāi)，而是在一定程度上重疊。另外，技術(shù)人員會(huì)了解在微生物培養(yǎng)的任何時(shí)期，都將在一定程度上產(chǎn)生有價(jià)值化合物。進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法所必需的培養(yǎng)基對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)并非關(guān)鍵的。根據(jù)所述生物的需要將營(yíng)養(yǎng)物添加進(jìn)方法中，只要營(yíng)養(yǎng)物過(guò)量提供即可。在本發(fā)明上下文中，營(yíng)養(yǎng)物不是氧。培養(yǎng)基方便地含有碳源、氮源以及微生物生長(zhǎng)和/或有價(jià)值化合物形成所需要的額外化合物。例如，額外的化合物可能對(duì)于誘導(dǎo)有價(jià)值化合物的產(chǎn)生來(lái)說(shuō)是必需的。本領(lǐng)域已知合適碳源的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、蔗糖、水解淀粉、淀粉、糖蜜、油。本領(lǐng)域已知氮源的實(shí)例包括大豆粉、玉米漿、酵母提取物、氨、銨鹽、硝酸鹽、尿素。額外化合物的實(shí)例包括磷酸鹽、硫酸鹽、微量元素和/或維生素。要添加進(jìn)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法中的碳源和氮源總量可根據(jù)例如微生物的需要和/或培養(yǎng)過(guò)程的長(zhǎng)度變化。培養(yǎng)方法中的碳源和氮源比例可顯著變化，由此碳源和氮源間最佳比例的決定因素是要形成的產(chǎn)物的元素組成。微生物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)物形成所需的額外化合物(如磷酸鹽、硫酸鹽或微量元素)可以以在不同微生物種類間(即真菌、酵母和細(xì)菌間)變化的數(shù)量添加。另外，要添加的額外化合物的數(shù)量可通過(guò)形成的有價(jià)值化合物的類型來(lái)確定。典型地，微生物生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基成分的數(shù)量可根據(jù)培養(yǎng)中使用的碳源數(shù)量確定，因?yàn)樗纬傻纳镔|(zhì)數(shù)量將基本上由所使用的碳源數(shù)量確定。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法優(yōu)選以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行。工業(yè)規(guī)模方法應(yīng)被理解為包括下述發(fā)酵體積規(guī)模的培養(yǎng)方法，所述體積規(guī)模>0.01m3，優(yōu)選>0.1m3，優(yōu)選〉0.5m3，優(yōu)選>5m3，優(yōu)選>10m3，更優(yōu)選〉25m3，更優(yōu)選〉50m3，更優(yōu)選〉100m3，最優(yōu)選〉200m3。生產(chǎn)有價(jià)值化合物或要作為生物質(zhì)原樣使用的任何微生物可用于根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，例如細(xì)菌、酵母和真菌生物。例如，適用于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的微生物菌株包括真菌菌株如Jc""wm'wm、^印erg/〃w、血ra96咖'(i^m、0，tococcMS、i^加(XWwm、FiwanY/m、//w附/co/a、Mag"opor^e、Mwcor、A(yce/—、7Veoca〃/mfl幼'x、7Vewrc^/wra、尸aecz'/ow少ces、尸/romycas、/Sc/n'zo//^〃ww、Jia/arc>m_yces、J^erwooscMS、7Tn'e/awa、7b/j^oc/a(i/w附禾口Jh'c/joderma菌株，酵母菌株如SaccAara附j(luò)cas、尸z'c/n'a、PA"j^2或A7t^yvera附少ces菌株禾口細(xì)菌菌株如5a"'〃M、^&cAenW^或v4c"wom少c"e菌株。特別地，絲狀生物對(duì)氧限制在根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)方法的應(yīng)用是有益的。絲狀生物可以是絲狀細(xì)菌如jcri朋mycetes，優(yōu)選6Vr印tom少ces，或可以是絲狀真菌。絲狀真菌菌株包括但不僅限于Jcr繼owZt/"7、J5perg〖〃t^、血reoZ)肌'c/ZMm、CV7/toc0ccMS、F/船(XS7Wwm、T^an'w/w、//wm/co/a、MagwopoWAe、Mwcor、Sc/n'zo//^〃w附、ra/araw少ces、J7zemjooscws、77'e/a"w'a、7b/_y/cc/afi^m禾口7Wc/iOife削a菌株。優(yōu)選的絲狀真菌細(xì)胞屬于A^wp7/w或7Wc/w&rwfl屬，更優(yōu)選是o^^ae或7WcAoJew^禾中。最優(yōu)選的y^/e^g〃/im'ger禾中為Js;9erg/〃1"m'gerCBS513.88及其衍生物。若干絲狀真菌菌株可容易地由公眾在大量培養(yǎng)物保藏所中獲得，例如美國(guó)豐莫式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM)、CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏所(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)m'gerCBS513.88、As;erg/〃two^yzaeATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、Jcremom'Mmc/，ogewwwATCC36225或ATCC48272、7h'cAoc/e環(huán)aATCC26921或ATCC56765或ATCC26921、sq/aeATCC11906、CAo^M/wr/wm/wcA72ovve;iseATCC44006及其衍生物。將要用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的微生物菌株可以是天然存在的微生物，或通過(guò)任何種類的誘變技術(shù)(例如經(jīng)典誘變處理或遺傳工程技術(shù))從任何合適親本菌株獲得的微生物菌株。由用于進(jìn)行本發(fā)明方法的微生物產(chǎn)生的有價(jià)值化合物優(yōu)選為多肽，例如酶或藥物蛋白質(zhì)。然而，所述方法也適用于產(chǎn)生代謝物(例如類胡蘿卜素或維生素)，或同樣適用于產(chǎn)生生物質(zhì)。有價(jià)值的化合物可以由單個(gè)基因或組成生物合成或代謝途徑的一系列基因編碼，或可以是單個(gè)基因產(chǎn)物或一系列基因產(chǎn)物的直接結(jié)果。有價(jià)值化合物對(duì)微生物來(lái)說(shuō)可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)"異源化合物"在本文中被定義為對(duì)細(xì)胞并非天然的化合物；或其中進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾以改變所述天然化合物的天然化合物。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的有價(jià)值化合物可以是多肽。多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"在本文中不意指特定長(zhǎng)度的被編碼的產(chǎn)物，其因此包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"多肽"還包括結(jié)合形成被編碼產(chǎn)物的兩種或更多多肽。多肽還包括雜交多肽，其包含得自至少兩種不同多肽的部分或完整多肽序列的組合，其中一種或多種對(duì)絲狀真菌細(xì)胞來(lái)說(shuō)可是異源的。多肽還包括上述多肽的天然等位變體和設(shè)計(jì)的變體和雜交多肽。多肽可以是膠原或明膠，或其變體或雜交體。多肽可以是抗體或其部分、抗原、凝固因子、酶、激素或激素變體、受體或其部分、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、報(bào)告子或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、涉及分泌過(guò)程的蛋白質(zhì)、涉及折疊過(guò)程的蛋白質(zhì)、陪伴分子、肽氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子、糖基化因子、轉(zhuǎn)錄因子、合成肽或寡肽、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)可以是酶，例如蛋白酶、神經(jīng)酰胺酶、環(huán)氧化物水解酶、氨基肽酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、醛縮酶、羥化酶、氨基肽酶、脂肪酶。多肽可以是細(xì)胞外分泌的酶。這類酶可屬于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、連接酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、甲殼酶、角質(zhì)酶(cutinase)、脫氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶。所述酶可以是糖酶如纖維素酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶、/3-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或/3-糖苷酶、半纖維素酶或果膠分解酶，例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果膠甲基酯酶、果膠裂合酶果膠酶、內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯木聚糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂合酶或淀粉酶；水解酶，異構(gòu)酶或連接酶，磷酸酶例如植酸酶，酯酶例如脂肪酶，蛋白水解酶，氧化還原酶例如氧化酶，轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。所述酶可以是植酸酶。所述酶可以是氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、內(nèi)切蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、過(guò)氧化氫酶、甲殼酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶。a-半乳糖苷酶、糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、e-葡萄糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、蛋白水解酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、脫氨基酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、單加氧酶。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的有價(jià)值化合物可以是多糖。所述多糖可以是任何多肽，其包括但不限于粘多糖(例如肝素和透明質(zhì)酸)和含氮多糖(例如甲殼質(zhì))。在更優(yōu)選的選擇中，多肽為透明質(zhì)酸。術(shù)語(yǔ)"代謝物"包括初級(jí)和次級(jí)代謝物；所述代謝物可以是任何代謝物。優(yōu)選的代謝物為檸檬酸。代謝物可以由一個(gè)或多個(gè)基因(如生物合成或代謝途徑中的多個(gè)基因)編碼。初級(jí)代謝物是細(xì)胞初級(jí)代謝或一般代謝的產(chǎn)物，其涉及能量代謝、生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)。次級(jí)代謝物是次級(jí)代謝的產(chǎn)物(參閱例如R.B.Herbert,TheBiosynthesisofSecondaryMetabolites,ChapmanandHall,NewYork,1981)。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的初級(jí)代謝物可以是，但不僅限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、三酰甘油或維生素。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的次級(jí)代謝物可以是，但不僅限于生物堿、香豆素、類黃酮、聚酮化合物、奎寧、甾族化合物、肽或萜。次級(jí)代謝物可以是抗伺育劑、吸引劑、殺菌劑、殺真菌劑、激素、殺蟲(chóng)劑或殺鼠劑。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法可作為分批(batch)、重復(fù)分批(repeatedbatch)、補(bǔ)料分批(fed-batch)、重復(fù)補(bǔ)料分批(repeatedfed-batch)或連續(xù)培養(yǎng)方法而進(jìn)行。在分批方法中，在培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始前將所有的培養(yǎng)基成分作為整體直接添加進(jìn)培養(yǎng)基中。在重復(fù)分批方法中，進(jìn)行培養(yǎng)基的部分收集和部分補(bǔ)充完全培養(yǎng)基，任選地重復(fù)若干次。在補(bǔ)料分批方法中，微生物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)物形成所必需的化合物的部分在培養(yǎng)方法開(kāi)始之前提供于初始培養(yǎng)基中。在所述培養(yǎng)方法的進(jìn)程中，可向所述方法中以一次補(bǔ)料或各化合物單獨(dú)補(bǔ)料添加額外的碳源、氮源和/或其它化合物。在重復(fù)補(bǔ)料分批或持續(xù)培養(yǎng)方法中，在培養(yǎng)中額外添加完全的初始培養(yǎng)基。初始培養(yǎng)基可作為整體補(bǔ)料，或以例如碳源和氮源的獨(dú)立的流補(bǔ)料。在重復(fù)分批補(bǔ)料方法中，以規(guī)律的時(shí)間間隔移出部分包含生物質(zhì)的培養(yǎng)基，但是在連續(xù)方法中，部分培養(yǎng)基的移出持續(xù)進(jìn)行。由此，用部分新鮮培養(yǎng)基對(duì)所述培養(yǎng)過(guò)程加以補(bǔ)充，確保培養(yǎng)基的體積和/或重量恒定。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，應(yīng)用分批補(bǔ)料或重復(fù)分批補(bǔ)料方法，其中向培養(yǎng)方法中添加碳源和/或氮源和/或其它化合物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，向培養(yǎng)方法中添加碳源和/或氮源。本發(fā)明的另一方面涉及對(duì)培養(yǎng)基下游加工的選擇。根據(jù)本發(fā)明使用氧限制有助于下游加工，這特別是由于有價(jià)值化合物的高產(chǎn)量和副產(chǎn)品的低數(shù)量導(dǎo)致的。下游加工可包括回收以及配制步驟。優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明的氧限制方法獲得的有價(jià)值化合物被從培養(yǎng)基中回收和/或配制于合適的組合物中。培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束后，可使用開(kāi)發(fā)來(lái)用于回收目的有價(jià)值化合物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從培養(yǎng)基中回收有價(jià)值產(chǎn)物。從而，要使用的相關(guān)的下游加工技術(shù)取決于有價(jià)值化合物的性質(zhì)和細(xì)胞定位，并取決于所期望的目的產(chǎn)物純度水平。在一種典型的回收方法中，使用例如離心或過(guò)濾將生物質(zhì)從培養(yǎng)液中分離。然后在有價(jià)值化合物積累在內(nèi)部或與微生物細(xì)胞結(jié)合的情況下，從生物質(zhì)中回收有價(jià)值化合物。當(dāng)然，同樣也可使用生物質(zhì)。否則，當(dāng)有價(jià)值產(chǎn)物從微生物細(xì)胞中分泌出時(shí)，將其從培養(yǎng)液中回收。生物質(zhì)和/或有價(jià)值化合物可配制為而提或固體產(chǎn)物。優(yōu)選地，從培養(yǎng)物中回收通過(guò)本發(fā)明方法獲得的有價(jià)值化合物，并/或?qū)⑵渑渲朴诤线m的組合物中。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)乂印erg"/MSm'ger工業(yè)制造植酸酶根據(jù)WO98/46772設(shè)計(jì)并構(gòu)建過(guò)表達(dá)植酸酶的J^^^7/mm'gwCBS513.88。操作細(xì)胞庫(kù)在-8(TC下儲(chǔ)存于約1ml的小管中。接種程序向預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加一管內(nèi)容物帶擋板的2L搖瓶(20g/LComSteepSolid、20g/L葡萄糖，pH6.5(用NaOH調(diào)節(jié))，300ml培養(yǎng)基，在12rC下蒸汽滅菌30分鐘)。預(yù)培養(yǎng)物在34。C和220rpm下生長(zhǎng)40小時(shí)。當(dāng)然，可根據(jù)搖瓶結(jié)構(gòu)和小管的存活力改變時(shí)間。連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)基由葡萄糖和麥芽糖糊精以及鹽級(jí)分的混合組成。鹽級(jí)分與W098/37179中12頁(yè)的表1匹配。對(duì)該表格的改變?yōu)镸gS04.7aq0.25g/L、CaC12.2aq0.22g/L、(NH4)2S046g/L、擰檬酸.1aq0.2g/L(螯合劑)。用于分批和補(bǔ)料的培養(yǎng)基組成相同。用于碳限制或氧限制的葡萄糖濃度分別為22.5或45g/L，而麥芽糖糊精分別為2.5或5.0g/L。培養(yǎng)基以兩種級(jí)分蒸汽滅菌，其中一種級(jí)分組合了糖和氯化鈣。滅菌前培養(yǎng)基鹽級(jí)分的pH為4.5(硫酸)，并在將所述級(jí)分并入發(fā)酵罐后控制(硫酸、氨)相同的pH。溫度控制在34X:。用于碳限制或氧限制的空氣流分別為1.0或0.5vvm(每分鐘每培養(yǎng)基體積的空氣體積)。生物反應(yīng)器以6。％的接種體比例接種。操作體積為10L。對(duì)于碳受控的發(fā)酵，將DOT控制為接種前培養(yǎng)基DOT的20。X。術(shù)語(yǔ)"DOT"(溶解氧張力)被定義為溶解的氧的度量，并被表示為大氣壓下空氣中飽和的溶解氧的百分比，即100%DOT為在大氣壓下可溶解的氧的最大量。DOT控制發(fā)酵一般用于碳受限制的發(fā)酵。對(duì)于氧受限制的發(fā)酵而言，將氧轉(zhuǎn)移率控制(借助于攪拌速度)為相同稀釋率時(shí)碳受限下測(cè)量值的80%,從而建立氧限制。以周期性的方式使用Clarol作為消泡劑最早的24小時(shí)為每30分鐘2秒，然后稍后為每小時(shí)2秒。為了達(dá)到穩(wěn)態(tài)，進(jìn)行至少5倍體積的改變。對(duì)每種穩(wěn)態(tài)進(jìn)行一次新發(fā)酵。結(jié)果如從圖1到圖4可觀察到(圖中每個(gè)點(diǎn)都代表獨(dú)立的穩(wěn)態(tài))，氧限制提供了與碳限制相比顯著更高的以葡萄糖和氧為基礎(chǔ)的生物質(zhì)產(chǎn)率。更有趣的是，以葡萄糖和氧為基礎(chǔ)的酶產(chǎn)率也被增強(qiáng)，盡管氧吸收速率更低。這清楚地展示了發(fā)酵在氧限制下進(jìn)行時(shí)更高的生產(chǎn)力和更具成本效益的方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1.通過(guò)培養(yǎng)微生物來(lái)生產(chǎn)有價(jià)值化合物的方法，所述方法包括在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，并向培養(yǎng)物中進(jìn)料適量的氧，以將培養(yǎng)物維持在氧限制的條件下，所述培養(yǎng)基中所有營(yíng)養(yǎng)物在整個(gè)培養(yǎng)周期中過(guò)量提供。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述培養(yǎng)物中添加適量的氧，以保證OTR與OUR基本相同。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中向所述培養(yǎng)物中添加適量的氧，以進(jìn)一步保證OTR盡可能的高。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中通過(guò)調(diào)節(jié)至少一種下述參數(shù)調(diào)節(jié)所述OTR，所述參數(shù)選自攪動(dòng)、充氣、超壓、輸入氣流中氧百分比、培養(yǎng)基重量、整體培養(yǎng)基粘度。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中通過(guò)將所述培養(yǎng)基的溫度改變?yōu)楸茸罴焉L(zhǎng)發(fā)生的水平高或低2到6。C之間的水平來(lái)調(diào)節(jié)所述整體培養(yǎng)基粘度。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中通過(guò)將所述培養(yǎng)基的溫度提高為比最佳生長(zhǎng)發(fā)生的水平高2到6i:之間的水平來(lái)降低所述整體培養(yǎng)基粘度。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中通過(guò)將所述培養(yǎng)基的溫度降低為比最佳生長(zhǎng)發(fā)生的水平低2到6r之間的水平來(lái)降低所述整體培養(yǎng)基粘度。8.如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述生產(chǎn)期間所述培養(yǎng)物被維持在氧限制的條件下。9.如權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物為絲狀微生物，優(yōu)選絲狀真菌。10.如權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的方法，其中獲得的所述有價(jià)值化合物被從所述培養(yǎng)基中回收和/或被配制于合適的組合物中。11.如權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有價(jià)值化合物為代謝物。12.如權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有價(jià)值化合物為多肽，優(yōu)選為酶。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)微生物生產(chǎn)有價(jià)值化合物的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，其中在整個(gè)培養(yǎng)周期中過(guò)量提供所有營(yíng)養(yǎng)物，并且，其中向培養(yǎng)物中進(jìn)料合適數(shù)量的氧，以保持所述培養(yǎng)物處于氧限制的條件下。文檔編號(hào)C12P21/00GK101287839SQ200680009614公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2006年3月23日優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日發(fā)明者羅希爾·莫伊倫貝格,菲利普·塞利·佛朗克斯·戈丹申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司