專利名稱：一種富集產(chǎn)聚酮類化合物細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物富集方法，特別是涉及一種富集產(chǎn)聚酮類化合物細(xì)菌的方法及其使用的熒光標(biāo)記探針。
背景技術(shù)：
聚酮是一大類結(jié)構(gòu)多樣化的天然產(chǎn)物，具有重要的醫(yī)用價(jià)值，包括大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、蒽環(huán)類、聚醚類等許多抗生素都屬于該類化合物。世界上聚酮來源的藥物每年的銷售額達(dá)80億美元。聚酮類化合物主要來源于微生物、植物等生物的次級代謝產(chǎn)物，由于微生物體積小、繁殖速度快、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟，因此成為尋找新聚酮類化合物的重要資源。傳統(tǒng)的方法是首先分離微生物，再進(jìn)行活性篩選，分離活性次級代謝產(chǎn)物，這種方法是否能夠得到聚酮類化合物并不確定，是一種隨機(jī)的篩選方法。此外，自然界中90％以上的微生物采用上述方法無法分離培養(yǎng)，對這一部分無法分離培養(yǎng)的微生物資源的開發(fā)利用仍然處于探索時(shí)期。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，弄清了聚酮類化合物生物合成途徑的分子機(jī)理并對生物合成途徑的基因進(jìn)行了克隆研究。聚酮類化合物的生物合成有著很強(qiáng)的規(guī)律性，目前已知的聚酮類化合物按合成途徑主要分為大環(huán)聚酮類化合物和芳香環(huán)聚酮類化合物兩種，這兩類化合物分別由I型聚酮合成酶合成途徑(PKSI)和II型聚酮合成酶合成途徑(PKS II)合成。通過克隆得到了一系列聚酮類化合物生物合成基因簇，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的組合生物合成技術(shù)近幾年得到了很大的發(fā)展，成為新藥開發(fā)的重要策略之一。因此，尋找新的聚酮類化合物產(chǎn)生菌及其生物合成基因成為目前的研究熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)有微生物富集技術(shù)主要是根據(jù)微生物種屬(如真菌，放線菌等)或物理性質(zhì)(如嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿等)進(jìn)行富集，尚未見有針對產(chǎn)某一類特定化合物的微生物的富集方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種富集產(chǎn)聚酮類化合物細(xì)菌的新方法，它能夠從環(huán)境樣品中富集產(chǎn)生聚酮類化合物的細(xì)菌，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種富集產(chǎn)聚酮類化合物細(xì)菌的方法，其特征是首先將環(huán)境樣品制成液體混懸液，經(jīng)過濾、離心收集微生物，再用緩沖液制成菌懸液，然后用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與菌懸液進(jìn)行原位雜交，將能產(chǎn)生聚酮類化合物的細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，對雜交后的菌懸液采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微生物的分選，將熒光標(biāo)記的細(xì)菌從菌懸液中分選出來。
本發(fā)明的方法能夠富集環(huán)境中(如土壤、河水、湖水、海水、海泥、海洋動(dòng)植物共附生)產(chǎn)聚酮類化合物的細(xì)菌，特別是富集環(huán)境樣品中大量存在的未能培養(yǎng)的細(xì)菌，具有針對性強(qiáng)、操作簡單、快速、靈敏、高效的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
1.環(huán)境樣品的預(yù)處理如采用海水、湖水或河水，可用200目尼龍篩網(wǎng)過濾除去雜質(zhì)，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾餅用PBS緩沖液懸浮，使細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml；如采用海洋動(dòng)植物樣品，則將海洋動(dòng)植物樣品切成小塊，PBS浸泡，超聲振蕩，用200目尼龍篩網(wǎng)過濾除去雜質(zhì)，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾餅用PBS緩沖液懸浮，使細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml；如采用土壤或海泥樣品，則將土壤或海泥加適量的PBS，振蕩混勻，靜置10分鐘后取上清液，沉淀繼續(xù)加 PBS重復(fù)前述操作，反復(fù)三次。上清液用200目尼龍篩網(wǎng)過濾除去雜質(zhì)，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾餅用PBS緩沖液懸浮，使細(xì)胞濃度為108個(gè)/ml。
2.探針的設(shè)計(jì)本發(fā)明所用的探針設(shè)計(jì)在聚酮合成酶系中酮基合成酶(KS)和?；D(zhuǎn)移酶(AT)基因的保守區(qū)域，長度為21個(gè)堿基，每條探針的5’末端標(biāo)記熒光染料，命名為KS1和AT1，其序列分別為KS15’CGT CGA GGC CCA CGG CAC CGG 3’AT15’TTC TCC GGC CAG GGC TCC CAG 3’該組序列的5’末端分別標(biāo)記熒光染料FITC，由發(fā)明人提供，上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
3.熒光原位雜交取微生物菌懸液1ml，5000×g離心5min，沉淀加250μm PBS，750μm4％PFA，重新懸浮微生物細(xì)胞，4℃固定1-3h。5000×g離心5min，沉淀用乙醇/PBS混合液(7∶3，vol∶vol)懸浮。同上條件離心，沉淀用100μl雜交緩沖液(0.9MNaCl，0.01％SDS，20mMTris-HCl[pH7.2]，25％deionized formamide)懸浮，同時(shí)加入熒光標(biāo)記探針2.5ng/μl，46℃雜交3h，反應(yīng)結(jié)束后，5000×g離心5min，PBS洗滌一次。
4.流式細(xì)胞儀分選雜交后的細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀FACS Vantage(Becton Dickinson)進(jìn)行分選，側(cè)向散射光波長為488nm，收集熒光陽性區(qū)域的細(xì)胞，得到能夠產(chǎn)生聚酮類化合物的細(xì)菌。
權(quán)利要求
1.一種富集產(chǎn)聚酮類化合物細(xì)菌的方法，其特征是首先將環(huán)境樣品制成液體混懸液，經(jīng)過濾、離心收集微生物，再用緩沖液制成菌懸液，然后用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與菌懸液進(jìn)行原位雜交，將能產(chǎn)生聚酮類化合物的細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，對雜交后的菌懸液采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微生物的分選，將熒光標(biāo)記的細(xì)菌從菌懸液中分選出來。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的探針設(shè)計(jì)在聚酮合成酶系中酮基合成酶(KS)和酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)基因的保守區(qū)域，其5’末端分別標(biāo)記熒光染料，其序列分別為KS15’CGT CGA GGC CCA CGG CACCGG 3’；AT15’TTC TCC GGC CAG GGC TCC CAG 3’
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的環(huán)境樣品包括土壤、河水、湖水、海水、海泥、海洋動(dòng)植物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的菌懸液濃度為105-108個(gè)細(xì)胞/ml。
全文摘要
一種富集產(chǎn)聚酮類化合物細(xì)菌的方法，其特征是首先將環(huán)境樣品制成液體混懸液，經(jīng)過濾、離心收集微生物，再用緩沖液制成菌懸液，然后用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與菌懸液進(jìn)行原位雜交，將能產(chǎn)生聚酮類化合物的細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，對雜交后的菌懸液采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微生物的分選，將熒光標(biāo)記的細(xì)菌從菌懸液中分選出來。本發(fā)明的方法能夠富集環(huán)境中(如土壤、河水、湖水、海水、海泥、海洋動(dòng)植物共附生)產(chǎn)聚酮類化合物的細(xì)菌，特別是富集環(huán)境樣品中大量存在的未能培養(yǎng)的細(xì)菌，具有針對性強(qiáng)、操作簡單、快速、靈敏、高效的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07H21/00GK1597926SQ20041002457
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者朱天驕, 李靜 申請人:中國海洋大學(xué)