專(zhuān)利名稱(chēng)：：生產(chǎn)化合物Ⅱ的棒狀細(xì)菌的制作方法生產(chǎn)化合物II的棒狀細(xì)菌本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2002年7月30日、申請(qǐng)?zhí)枮?2815448.7、發(fā)明名稱(chēng)為"生產(chǎn)化合物II的棒狀細(xì)菌"的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)?，F(xiàn)有技術(shù)化合物，尤其L-氨基酸、維生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，用于人用藥、用于制藥業(yè)、用于化妝品、用于食品業(yè)及用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。眾多的這些化合物是從棒狀細(xì)菌尤其谷氨棒桿菌菌株中發(fā)酵制備的。由于其及其重要性，己持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施。如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或例如通過(guò)離子交換層析對(duì)產(chǎn)物形式的加工，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對(duì)抗代謝物有抗性或有調(diào)節(jié)重要性的代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。一些年以來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)用于棒桿菌菌株的改良，其通過(guò)擴(kuò)增各個(gè)氨基酸生物合成基因，并研究對(duì)氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。一種通用的方法包括通過(guò)附加型復(fù)制質(zhì)粒擴(kuò)增特定微生物中某些生物合成基因。這種方法的缺點(diǎn)是在發(fā)酵期間(在工業(yè)過(guò)程中發(fā)酵通常進(jìn)行許多代)，所述質(zhì)粒自發(fā)喪失(分離不穩(wěn)定性)。另一種方法包括利用在特定微生物中不復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制一些生物合成基因。在這種方法中，將包括克隆的生物合成基因的質(zhì)粒整合入該微生物的染色體生物合成基因中(Reinschdd等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60(1)，126-132(1994);Jetten等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)學(xué)43(1):76-82(1995))。這種方法的缺點(diǎn)是質(zhì)粒的核苷酸序列及選擇所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中，這例如對(duì)生物量的處理和利用是一個(gè)不利因素。另外，專(zhuān)家預(yù)期這種菌株由于在相應(yīng)于工業(yè)發(fā)酵中常用的代次中通過(guò)"坎貝爾典型交換(Campbelltypecrossover)"的去整合(disintegration)而不穩(wěn)定。發(fā)明目的本發(fā)明人提供了改良使用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)化合物的新措施。發(fā)明概述本發(fā)明提供了棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌屬，其產(chǎn)生一或多種所需的化合物，其特征在于a)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在單個(gè)拷貝的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述感興趣的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得(capbleof/enable)在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及b)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述感興趣的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了制備一或多種化合物的方法，其中包括以下步a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵如下的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌屬i)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在單個(gè)拷貝的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及ii)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯和/或細(xì)菌細(xì)胞中的化合物，c)分離所述化合物，任選地d)伴有、大于)0-100w^的發(fā)酵肉湯的組分和域生物量。發(fā)明詳述應(yīng)理解所述化合物特別是指氨基酸，維生素，核苷和核苷酸?，F(xiàn)有技術(shù)已知并可獲得這些化合物的生物合成途徑。氨基酸優(yōu)選是指L-氨基酸，尤其是蛋白原性L(fǎng)-氨基酸，選自L(fǎng)-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺,甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸,L-酪氨酸,L-苯丙氨酸，L-組氨酸,L-賴(lài)氨酸,L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸，及它們的鹽，特別是L-賴(lài)氨酸，L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸。特別優(yōu)選L-賴(lài)氨酸。蛋白原性氨基酸應(yīng)理解為在天然蛋白質(zhì)中存在的氨基酸，天然蛋白質(zhì)即微生物、植物、動(dòng)物和人的蛋白質(zhì)。維生素特別是指維生素Bl(硫胺素)，維生素B2(核黃素)，維生素B5(泛酸)，維生素B6(吡哆醇)，維生素B12(氰鈷胺素)，煙酸/煙酰胺，維生素M(葉酸)和維生素E(生育酚)及它們的鹽，優(yōu)選泛核苷及核苷酸特別是指S-腺苷甲硫氨酸，肌苷-5'-單磷酸及鳥(niǎo)苷-5'-單磷酸及它們的鹽。棒狀細(xì)菌特別是棒桿菌屬那些細(xì)菌。在棒桿菌屬中優(yōu)選谷氨酸棒桿菌，產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)禾口嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)。這組細(xì)菌菌株的分類(lèi)信息見(jiàn)于Kampfer和Kroppenstedt(加拿大微生物學(xué)雜志42,989-1005(1996))及US-A-5，250，434所述。谷氨酸棒桿菌菌種的合適菌株特別是那些已知的野生型菌株CorynebacteriumglutamicumATCC13032CorynebacteriumacetoglutamicumATCC15806CorynebacteriumacetoacidophilumATCC13870CorynebacteriumliliumATCC15990CorynebacteriummelassecolaATCC17965CorynebacteriumherculisATCC13868Arthrobactersp.ATCC243Brevibacteriumchang-fUaATCC14017BrevibacteriumflavumATCC14067BrevibacteriumlactofermentumATCC13869BrevibacteriumdivaricatumATCC14020BrevibacteriumtaipeiATCC13744禾口MicrobacteriumammoniaphilumATCC21645及從中產(chǎn)生的生產(chǎn)化合物的突變體或菌株，如本領(lǐng)域已知的那些突變體或菌株。產(chǎn)氨棒桿菌(C.ammoniagenes)菌種的合適菌株特別是已知的野生型菌株BrevibacteriumammoniagenesATCC6871BrevibacteriumammoniagenesATCC15137禾口Corynebacteriumsp.ATCC21084及從中產(chǎn)生的生產(chǎn)化合物的突變體或菌株，如本領(lǐng)域已知的那些突變體或菌株。嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(C.thermoaminogenes)菌種的合適菌株特別是已知的野生型菌株CorynebacteriumthermoaminogenesFERMBP-1539CorynebacteriumthermoaminogenesFERMBP-1540CorynebacteriumthermoaminogenesFERMBP-1541禾口CorynebacteriumthermoaminogenesFERMBP-1542及從中產(chǎn)生的生產(chǎn)化合物的突變體或菌株，如本領(lǐng)域已知的那些突變體或菌株。具有ATCC標(biāo)號(hào)的菌株可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA，美國(guó))。具有FERM標(biāo)號(hào)的菌株可得自國(guó)立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,AISTTsukubaCentral6,1-1-1Higashi，TsukubaIbaraki，曰本)。提及的嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌菌株(FERMBP-1539,FERMBP-1540,FERMBP-1541和FERMBP-1542)在US-A5，250，434中描述。開(kāi)放讀框(ORF)描述了一段編碼或可編碼一種蛋白質(zhì)或多肽或核糖核酸的核苷酸序列，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有對(duì)其功能的描述。在將一種功能指定給提及的核苷酸序列節(jié)段后，其一般稱(chēng)為基因。等位基因一般是指給定基因的另外的形式。該形式通過(guò)核苷酸序列中的不同加以區(qū)別。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用內(nèi)源的即物種特征性開(kāi)放讀框、基因或等位基因。這些應(yīng)理解為存在于物種群體例如谷氨酸棒桿菌中的開(kāi)放讀框、基因或等位基因或其核苷酸序列。本發(fā)明文中"在特定希望的位點(diǎn)(基因座)天然存在的單拷貝的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因"是指這樣的情況，即在相應(yīng)野生型或相應(yīng)親代生物體或起始生物體中一個(gè)基因一般以其核苷酸序列形式在其位點(diǎn)或基因位點(diǎn)以一個(gè)拷貝天然存在。這個(gè)位點(diǎn)優(yōu)選在染色體中。因此，例如lysC基因或編碼谷氨酸棒桿菌的反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因是以一個(gè)拷貝中存在于lysC位點(diǎn)或lysC基因座或lysC基因位點(diǎn)，其一側(cè)是開(kāi)放讀框orfX和leuA基因，另一側(cè)是asd基因。反饋抗性天冬氨酸激酶是指，與野生形式相比，對(duì)賴(lài)氨酸和蘇氨酸的混合物或者AEC(氨基乙基半胱氨酸)和蘇氨酸的混合物或者賴(lài)氨酸自身或者AEC自身的抑制具有較低敏感性的天冬氨酸激酶。生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌株典型含有這種反饋抗性或脫敏的天冬氨酸激酶。已知谷氨酸棒桿菌染色體的核苷酸序列，并可見(jiàn)于專(zhuān)利申請(qǐng)EP-A-11087卯及歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg,德國(guó)和Cambridge,英國(guó))的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AX114121。OrfX的核苷酸序列，leuA基因和asd基因的登錄號(hào)為AX120364(orfX)，AX123517(leuA)和AX123519(asd)。另外，也可以使用數(shù)據(jù)庫(kù)例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，Bethesda,MD,美國(guó))或者瑞士生物信息學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫(kù)(Swissprot,Geneva,Switzerland)或者蛋白質(zhì)信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)(PIR，Washington,DC，美國(guó))。開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的兩或多個(gè)拷貝的"串聯(lián)排列"是指這些拷貝以相同方向緊密相鄰排列。"另一個(gè)基因位點(diǎn)"是指第二個(gè)基因位點(diǎn)，其核苷酸序列不同于至少在天然位點(diǎn)復(fù)制的ORF、基因或等位基因的序列。這個(gè)另一個(gè)基因位點(diǎn)，或者在這個(gè)另一個(gè)位點(diǎn)存在的核苷酸序列，優(yōu)選在染色體內(nèi)，而且一般對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)生所需化合物是非必需的。所述"另一個(gè)位點(diǎn)"當(dāng)然不僅包括所述開(kāi)放讀框或基因的編碼區(qū)，還包括位于上游的與表達(dá)和調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域或核苷酸序列，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)性核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)和弱化子。這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)上游的1-800,1-600,1-400，l-200，l-100或l-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，還包括位于下游的區(qū)域，例如轉(zhuǎn)錄終止子。這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)下游的1-400，1-200,1-100，1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。原噬菌體是指一種噬菌體，特別是其基因組，其與宿主的基因組一起復(fù)制且不發(fā)生感染顆粒的形成。缺陷噬菌體是指一種原噬菌體，特別是其基因組，其由于各種突變的結(jié)果而喪失形成所謂感染顆粒的能力。缺陷噬菌體也稱(chēng)為隱性噬菌體。原噬菌體和缺陷噬菌體通常以整合形式存在于其宿主的染色體中?，F(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于其的進(jìn)一步詳述例如EdwardA.Birge的教材所述(細(xì)菌和噬菌體遺傳學(xué)，3"ed.，Springer-Verlag,美國(guó)紐約1994)，或者S.Klaus等的教材所述(Bakterienviren，GustavFischerVerlag，Jena,德國(guó)1992)。為產(chǎn)生本發(fā)明的棒狀細(xì)菌，分離所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，優(yōu)選包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，至少兩個(gè)拷貝排列成一排，優(yōu)選串聯(lián)排列，然后優(yōu)選借助于在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或僅有限程度復(fù)制的載體，將這些序列轉(zhuǎn)移進(jìn)所需棒狀細(xì)菌中，并分離其中在特定希望的天然位點(diǎn)摻入ORF、基因或等位基因的兩個(gè)拷貝而不是最初存在的單拷貝的那些細(xì)菌，在該特定天然位點(diǎn)(基因座)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，以及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。所述表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，例如ORF、基因或等位基因編碼區(qū)上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)核糖核酸結(jié)合位點(diǎn)及弱化子，一般在編碼區(qū)上游的1一800，1—600，1一400，1_200，1—100或1一50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。所述表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，例如ORF、基因或等位基因編碼區(qū)下游的轉(zhuǎn)錄終止子，一般在編碼區(qū)下游的1—400，1—200，I一IOO，1—50或1—25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增的ORF、基因或等位基因的兩側(cè)沒(méi)有所用載體的序列或者物種外源DNA的殘余，例如限制切割位點(diǎn)。在每種情況中，任選地，兩側(cè)最多有這種DNA的24個(gè)，優(yōu)選最多12個(gè)，特別優(yōu)選最多6個(gè)核苷酸。任選地，所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝插入在另一個(gè)基因位點(diǎn)或者一些另外的基因位點(diǎn)，在該另外的基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。優(yōu)選地，在所述的另外的基因位點(diǎn)沒(méi)有所用載體的序列或者物種外源DNA的殘余，例如限制切割位點(diǎn)。任選地，在該另外的基因位點(diǎn)保留摻入的ORF、基因或等位基因上游或下游的這種DNA的最多24個(gè)，優(yōu)選最多12個(gè)，特別優(yōu)選最多6個(gè)核苷酸。本發(fā)明因此還提供了一種產(chǎn)生棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生一或多種化合物，其特征在于a)分離希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，優(yōu)選包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將所述ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少兩個(gè)拷貝排列成一列，優(yōu)選串聯(lián)排列，c)將根據(jù)b)獲得的核苷酸序列摻入載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或者只有限程度復(fù)制，d)將根據(jù)b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述棒狀細(xì)菌在該特定希望的天然位點(diǎn)具有希望的ORF、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的單拷貝，在該特定的天然位點(diǎn)(基因座)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，f)任選地，將所述ORF、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝導(dǎo)入另一個(gè)基因位點(diǎn)，在所述另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。通過(guò)本發(fā)明的方法，棒狀細(xì)菌或者制備化合物的發(fā)酵方法的產(chǎn)率在選自以下一組的一或多個(gè)方面得以改良至少0.5—1.0%或者至少1.0—1.5%，或者至少1.5—2.0%:濃度(形成的化合物，基于單位體積)，產(chǎn)量(形成的化合物，基于消耗的碳源)，產(chǎn)物形成速率(形成的化合物，基于時(shí)間)。關(guān)于常規(guī)的遺傳工程方法的指導(dǎo)，例如分離染色體DNA，質(zhì)粒DNA，操作限制酶等，見(jiàn)于Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。關(guān)于在棒狀細(xì)菌中轉(zhuǎn)化和接合的指導(dǎo)見(jiàn)于TWerbach等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29，356—362(1988))，Schafer等(細(xì)菌學(xué)雜志172，1663—1666(19卯)及基因145，69—73(1994))，及Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84—87(1991))。僅有限程度復(fù)制的載體是指質(zhì)粒載體，其根據(jù)宿主或載體培養(yǎng)條件下而復(fù)制或不復(fù)制。因此，僅在低于31°C才能復(fù)制的棒狀細(xì)菌的溫度敏感性質(zhì)粒已經(jīng)由Nakamura等描述(US-A-6，303，383)。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，尤其棒桿菌屬棒狀細(xì)菌，其特征在于a)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在單個(gè)拷貝的用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及b)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種制備L-賴(lài)氨酸的方法，包括以下步驟-a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵如下的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌屬i)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的單個(gè)拷貝的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及ii)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯和/或細(xì)菌細(xì)胞中的L一賴(lài)氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離所述L一賴(lài)氨酸，任選地d)伴有〉(大于)0—100wt。^的發(fā)酵肉湯的組分禾n/或生物量。"用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝"是指所有、優(yōu)選內(nèi)源的開(kāi)放讀框、基因或等位基因，其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良賴(lài)氨酸生產(chǎn)的作用。增強(qiáng)是指特定的基因產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或酶的胞內(nèi)濃度或活性提高。這些特別包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap,gap2，gdh，gnd，lysC，lysC服，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFSR，P9gk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsl，ptsM，pyc，pycP458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM,tal，thyA，tkt,tpi,zwal，zwf和zwfA213T。這些在表1中概括及說(shuō)明。這些特別包括編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。各種lysCFBR等位基因在表2中概括及說(shuō)明。優(yōu)選以下lysCFBR等位基因lysCA279T(用蘇氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸),lysCA279V(用纈氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸),lysCS301F(用苯丙氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第301位絲氨酸)，lysCT308I(用異亮氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第308位蘇氨酸),lysCS301Y(用酪氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第301位絲氨酸)，lysCG345D(用天冬氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第345位甘氨酸)，lysCR320G(用甘氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第320位精氨酸),lysCT311I(用異亮氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第311位蘇氨酸)，lysCS381F(用苯丙氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第381位絲氨酸)。特別優(yōu)選lysCFBK等位基因lysCT311I(用異亮氨酸置換SEQIDNO:2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第311位蘇氨酸)，其核苷酸序列示于SEQIDNO:3;編碼的天冬氨酸激酶蛋白的氮基酸序列示于SEQIDNO:4。可以使用以下開(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列作為"另外的基因位點(diǎn)"，其對(duì)生長(zhǎng)和賴(lài)氨酸生產(chǎn)是非必需的aecD，ccpAl，ccpA2，citA，citB，ci伍，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysRl，lysR2，lysR3，menE，mqo,pck，pgi，poxB禾口zwa2，特另lj是基因aecD，gluA，gluB，gluC，gluD和pck。這些在表3中概括并說(shuō)明。另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。表l:用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBK等位基因<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>lysCFBR-174594US5688671-A(序列11)174594lysCFBR-174595lysCA279TUS5688671-A(序列12)174595lysCFBR-174596US5688671-A(序列13)174596lysCFBR-174597lysCA279TUS5688671-A(序列14)174597lysCFBR-X57226lysCS301YEP0387527Kalinowskietal"Molecular加dGeneralGenetics224:317-324(19卯)X57226lysCFBR-LI6848lysCG345DFollettieandSinskeyNCBINucleotideDatabase(1990)LI6848lysCFBR-L27125lysCR320GlysCG345DJettenetal.，AppliedMicrobiologyBiotechnology43:76-82(1995)L27125lysCFBRlysCT3川WO0063388(序列17)lysCFBRlysCS301FUS3732144lysCFBRlysCS381FlysCFBRJP6261766(序列1)lysCFBRlysCA279TJP6261766(序列2)iysCFBRlysCA279VJP6261766(序列3)lysCFBRlysCS301FJP6261766(序列4)lysCFBRlysCT3081JP6261766(序列5)表3用于整合賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的另外的基因位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸，所述方法的特征在于a)分離用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的所述ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少兩個(gè)拷貝排列成一列，優(yōu)選串聯(lián)排列，c)將根據(jù)b)獲得的核苷酸序列摻入一載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或者只有限程度復(fù)制，d)將根據(jù)b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述棒狀細(xì)菌在該特定希望的天然位點(diǎn)具有希望的ORF、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的單拷貝，在該特定的天然位點(diǎn)(基因座)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，f)任選地，將所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝導(dǎo)入另一個(gè)基因位點(diǎn)，在所述另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-甲硫氨酸/L-蘇氨酸的棒狀細(xì)菌，尤其棒桿菌屬，其特征在于a)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在單個(gè)拷貝的用于甲硫氨酸或蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及b)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述的用于甲硫氨酸或蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種制備L-甲硫氨酸/L-蘇氨酸的方法，包括以下步驟-a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵如下的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌屬i)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在用于甲硫氨酸或蘇氨酸生產(chǎn)的單個(gè)拷貝的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及ii)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L一甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離所述L一甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸，任選地d)伴有^大于)0—100wt^的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。"用于甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)，基因或等位基因的拷貝"是指所有、優(yōu)選內(nèi)源的開(kāi)放讀框、基因或等位基因，其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良甲硫氨酸生產(chǎn)的作用。這些特別包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysR，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap,gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，metA，metB，metE，metH，metY,msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsl，ptsM，pyc，pycP458S,sigC，sigD,sigE，sigH，sigM，tal,thyA，tkt，tpi,zwal，zwf和zwfA213T。這些在表4中概括并說(shuō)明。這些特別包括編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBK等位基因(見(jiàn)表2),及編碼反饋抗性高絲氨酸脫氫酶的homFBK等位基因。所述用于甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)、任選地第四個(gè)或第五個(gè)拷貝可以整合在另一個(gè)位點(diǎn)?？梢允褂靡韵麻_(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列brnE，brnF，brnQ，ccpAl，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，guA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysRl，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。這些在表5中概括并說(shuō)明。另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。表4:用于甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表5用于整合甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的另外的基因位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>"用于蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝"是指所有、優(yōu)選內(nèi)源的開(kāi)放讀框、基因或等位基因，其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良蘇氨酸生產(chǎn)的作用。這些包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysl，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsl,ptsM，pyc,pycP458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，thrB，thrC，thrE，zwal，zwf禾卩zwfA213T。這些在表6中概括并說(shuō)明。這些特別包括編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(見(jiàn)表2)及編碼反饋抗性高絲氨酸脫氫酶的homFBK等位基因。用于蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因或等位基因的至少第三個(gè)、任選地第四個(gè)或第五個(gè)拷貝可以整合在一個(gè)位點(diǎn)。為此可以使用以下開(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列ccpAl，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC,gluD，glyA，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD，luxR，luxS，lysRl，lysR2，lysR3，mdh，menE，metA，metD，pck，poxB，sigB和zwa2。這些在表7中概括并說(shuō)明。另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。表6用于蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表7用于整合蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的另外的基因位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>本發(fā)明還提供了生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸，特征在于a)分離用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少兩個(gè)拷貝排列成一列，優(yōu)選串聯(lián)排列，c)將根據(jù)b)獲得的核苷酸序列摻入一載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或者僅有限程度復(fù)制，d)將根據(jù)b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述細(xì)菌在特定希望的天然位點(diǎn)具有用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的所需的ORF、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的單拷貝，在該特定的天然位點(diǎn)(基因座)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，f)任選地將用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝導(dǎo)入另一個(gè)基因位點(diǎn)，在所述另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序歹ij，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-纈氨酸的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌屬，其特征在于a)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在單個(gè)拷貝的用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及b)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述的用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在該另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)L-纈氨酸的方法，其包括以下步驟a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵如下棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌屬i)所述細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是存在用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)，基因或等位基因的單拷貝，而是具有優(yōu)選串聯(lián)排列的所述開(kāi)放讀框(ORF)，基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，在該特定位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，ii)所述細(xì)菌任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)還具有所述用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝，在所述另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L-纈氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-纈氨酸，任選地d)伴有^大于)0—100wt%的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。"用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝"是指所有、優(yōu)選內(nèi)源的開(kāi)放讀框、基因或等位基因，其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良纈氨酸生產(chǎn)的作用。這些包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因brnE，brnF，brnEF，cstA，cysD，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，ilvB,ilvN，ilvBN，ilvC，ilvD，ilvEmsiK，pgk，ptsH，ptsl，ptsM，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tpi，zwal。這些在表8中概括并說(shuō)明。這些特別包括編碼纈氨酸抗性的乙酰乳酸合酶ilvBN等位基因。所述用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)，任選地第四個(gè)或第五個(gè)拷貝可以整合入另一個(gè)位點(diǎn)。可以使用以下開(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列aecD，ccpAl，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，luxR，lysRl，lysR2，lysR3，panB，panC，poxB和zwa2。這些在表9中概括并說(shuō)明。另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。表8用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表9用于整合纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的另外的基因位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>本發(fā)明相應(yīng)地還提供了一種生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生L-纈氨酸，所述方法的特征在于a)分離用于纈氨酸生產(chǎn)的所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將用于纈氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少兩個(gè)拷貝排列成一列，優(yōu)選串聯(lián)排列，c)將根據(jù)b)獲得的核苷酸序列摻入一載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或者只有限程度復(fù)制，d)將根據(jù)b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述細(xì)菌在特定的希望的天然位點(diǎn)具有用于纈氨酸生產(chǎn)的所需的ORF、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的單拷貝，在該特定的天然位點(diǎn)(基因座)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，f)任選地將用于纈氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝導(dǎo)入另一個(gè)基因位點(diǎn)，在所述另一個(gè)基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。在實(shí)施本發(fā)明期間，可以將串聯(lián)排列的lysCF^等位基因的兩個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的lysC基因位點(diǎn)，同時(shí)使該lysC基因位點(diǎn)中沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這種菌株例如是菌株DSM139921ysCFBR::lysCFBR?？梢杂糜趯ysCFBK等位基因的兩個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的lysC基因位點(diǎn)的質(zhì)粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1示于圖1。在實(shí)施本發(fā)明期間，還可以將串聯(lián)排列的lysE等位基因的兩個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的lysE基因位點(diǎn)，同時(shí)使該lysE基因位點(diǎn)中沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這種菌株例如是菌株ATCC21513_171ysE::lysE。可以用于將lysE基因的兩個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的lysE基因位點(diǎn)的質(zhì)粒示于圖2。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacB2xlysESma1/1。最后，在實(shí)施本發(fā)明期間，可以將串聯(lián)排列的zwal基因的兩個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的zwal基因位點(diǎn)，同時(shí)使該zwal基因位點(diǎn)中沒(méi)有能/使得在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這種菌株例如是菌株ATCC21513—17zwal::zwal。可以用于將zwal基因的兩個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的zwal基因位點(diǎn)的質(zhì)粒示于圖3。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBzwalzwal。為生產(chǎn)化合物，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的棒狀細(xì)菌可以連續(xù)培養(yǎng)或者不連續(xù)培養(yǎng)，所述不連續(xù)培養(yǎng)是分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)或者重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法的概述見(jiàn)Chmiel所著教材(Bioprozesstechnik1.EinfhrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag，Stuttgart:1991))或者Storhas所著教材(BioreaktorenundperiphereEimichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden,1994))。所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見(jiàn)于美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的"細(xì)菌學(xué)通用方法手冊(cè)"(美國(guó)華盛頓D.C.，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無(wú)機(jī)化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長(zhǎng)所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長(zhǎng)必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當(dāng)補(bǔ)加?？梢赃m當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在2(TC45°C，優(yōu)選25'C—4(TC。持續(xù)培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物形成最大量。此目的通常在10160小時(shí)范圍內(nèi)達(dá)到。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的棒狀細(xì)菌，尤其產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，具有令人意想不到的高穩(wěn)定性。它們?cè)谥辽?0—20，20—30,30—40，40—50個(gè)，優(yōu)選至少50—60，60—70，70—80和80—90個(gè)代次或細(xì)胞分裂周期過(guò)程中保持穩(wěn)定。以下微生物已經(jīng)被保藏谷氨酸棒桿菌菌株DSM139921ySCFBR::lysCFBR以純培養(yǎng)物形式于2002年6月5日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，德國(guó)不倫瑞克)，保藏號(hào)DSM15036。質(zhì)粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1以大腸桿菌菌株DH5ocmcr/pKl8mobsacB2xlysCSma2/l(=DH5alphamcr/pKl8mobsacB2xlysCSma2/l)的純培養(yǎng)物形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年4月20日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ,德國(guó)不倫瑞克)，保藏號(hào)DSM14244。谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513—171ysE::lysE以純培養(yǎng)物形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年6月5日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，德國(guó)不倫瑞克)，保藏號(hào)DSM15037。谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513—17zwal::zwal以純培養(yǎng)物形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年6月5日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ,德國(guó)不倫瑞克)，保藏號(hào)DSM15038。實(shí)施例1:在谷氨酸棒桿菌的染色體中產(chǎn)生lysCFBR等位基因lysCT311I的串聯(lián)重復(fù)體1.1構(gòu)建串聯(lián)載體pK18mobsacB2xlysCSma2/1通過(guò)常規(guī)方法從谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)140:1817—1828(1994))。谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中通過(guò)多次非定向誘變、選擇和突變體選擇而產(chǎn)生。該菌株對(duì)賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并具有一種反饋抗性天冬氨酸激酶，其對(duì)賴(lài)氨酸和蘇氨酸的混合物(各25mM)的抑制作用不敏感。lysCFBR等位基因的核苷酸序列示于SEQIDNO:3。在下文也稱(chēng)為lysCT311L編碼的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO:4。這個(gè)菌株的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年1月16日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶lysC基因或等位基因的一個(gè)DNA節(jié)段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌lysC基因的序歹iJ(Kalinowski等，分子微生物學(xué)5(5),1197-1204(1991);登錄號(hào)X57226)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCR:lysClbeg(SEQIDNo:15):5，TA(GGATCC)TCCGGTGTCTGACCACGGTG3'lysC2end:(SEQIDNO:16):5，AC(GGATCC)GCTGGGAAATTGCGCTCTTCC3,所示引物由MWGBiotech合成，PCR反應(yīng)通過(guò)Innis等所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行(PCR方案，方法與應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增長(zhǎng)度大約為L(zhǎng)7kb的一個(gè)DNA節(jié)段，其攜帶lysC基因或等位基因。另外所述引物含有限制性?xún)?nèi)切酶BamHI的切割位點(diǎn)的序列，其在以上所示核苷酸序列中用括號(hào)標(biāo)示。攜帶菌株DSM13994的lysCFBR等位基因lysCT311I的長(zhǎng)度大約為1.7kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳鑒別，從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化(QIA快速凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。然后利用TopoTA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek,TheNetherlands,Cat.NumberK4600-01)，在載體pCRII-TOPO中進(jìn)行片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于含有卡那霉素(50mg/1)、具有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-D-吡喃半乳糖苷，64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。獲得的質(zhì)粒在分離DNA后通過(guò)限制切割而檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中電泳。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pCRETOPOlysC。擴(kuò)增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過(guò)Sanger等所述雙脫氧鏈終止方法測(cè)定(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)74:5463-5467(1977))，使用PEAppliedBiosystems的ABIPrism3777測(cè)序設(shè)備(Weiterstadt，德國(guó))。所述PCR產(chǎn)物的編碼區(qū)序列示于SEQIDNo:3。相關(guān)天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO:4。堿基胸腺嘧啶在菌株DSM13994的lysC^等位基因編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:3)的第932位發(fā)現(xiàn)。堿基胞嘧啶在野生型基因的相應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)(SEQIDNO:1)。異亮氨酸在菌株DSM13994的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列(SEQIDNo:4)的第311位發(fā)現(xiàn)。蘇氨酸在野生型蛋白的相應(yīng)位置蛋白發(fā)現(xiàn)(SEQIDNo:2)。在編碼區(qū)第932位含有胸腺嘧啶并因此編碼在氨基酸序列第311位含有異亮氨酸的天冬氨酸激酶蛋白的lysC等位基因，在下文稱(chēng)為lysCFBR等位基因lysCT311L攜帶lysCFBR等位基因lysCT311I的質(zhì)粒pCRIITOP01ysC，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年4月20日以大腸桿菌菌株TOP10/pCRIITOPOlysC的純培養(yǎng)物形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ,Braunschweig,德國(guó))，保藏號(hào)DSM14242。從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分離質(zhì)粒DNA，用限制酶Bamffl切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg,德國(guó))，借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden,德國(guó))在瓊脂糖凝膠(O.8%)中分離后,將大約1.7kb的含有l(wèi)ySCFBR的DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離，用Klenow聚合酶(Boehringer，Mannheim)形成突出端并用于與Schafer等所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因14，69—73(1994))連接。該載體預(yù)先用限制酶Smal切割并用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim,德國(guó))，將其與大約L7kb的含有l(wèi)ysCFBR片段混合，將所述混合物用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg,德國(guó))處理。然后將大腸桿菌菌株DH5a(Grantetal.,PNASUSA,87(1990)4645-4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1巻，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。借助于得自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)酶HindIII限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacB2xlysCSma2。在第二步中，將質(zhì)粒pCRII-TOPOlysC用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia,Freiburg,德國(guó))，{昔助于QIAquick凝膠提取i式劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))在瓊脂糖凝膠(0.8%)中分離后，將大約1.7kb的含有l(wèi)ySC皿的DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離，并用于與本實(shí)施例所述載體pK18mobsacBlysCSma2連接。將該載體預(yù)先用限制酶BamHI切割并用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim,德國(guó))，之后與大約1.7kb的含有l(wèi)ysCFBR的片段混合，將所述混合物用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia,Freiburg,德國(guó))處理。然后將大腸桿菌菌株DH5oc(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645—4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1巻，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加25mg/1卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。借助于得自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)酶HindIII限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacB2xlysCSma2/1。該質(zhì)粒圖示于圖根據(jù)布達(dá)佩斯條約，質(zhì)粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1于2001年4月20日以大腸桿菌菌株DH5otmcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1(=DH5alphamcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1)的純培養(yǎng)物形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))，保藏號(hào)DSM14244。1.2在谷氨酸棒桿菌菌株DSM13992中產(chǎn)生lysCFBR等位基因lysCT311I的串聯(lián)重復(fù)體將實(shí)施例1.1中所述載體pK18mobsacB2xlysCSma2/1轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM13992中，通過(guò)對(duì)Schafer等所述方法加以修改后的方法進(jìn)行(1990，微生物學(xué)雜志172:1663—1666)。谷氨酸棒桿菌菌株DSM13992從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中通過(guò)多次非定向誘變、選擇和突變體選擇而產(chǎn)生。該菌株對(duì)鏈霉素有抗性并對(duì)賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有表型抗性。然而該菌株具有一種野生型天冬氨酸激酶(見(jiàn)SEQIDNO:l和2)，其對(duì)賴(lài)氨酸和蘇氨酸的混合物(各25mM)的抑制作用敏感。這個(gè)菌株的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年1月16日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))。載體pK18mobsacB2xlysCSma2/1在DSM13992中不能獨(dú)立復(fù)制，而只有整合入染色體中才保留在細(xì)胞中。將接合混合物鋪板于補(bǔ)加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港，紐約，1989)上對(duì)具有整合的pK18mobsacB2xlysCSma2/1的克隆進(jìn)行選擇。將生長(zhǎng)的克隆鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，在33。C溫育16小時(shí)。為切除只具有一個(gè)拷貝的lysC基因的質(zhì)粒，在LB液態(tài)培養(yǎng)基中溫育16小時(shí)之后，將所述克隆在具有10%蔗糖的LB瓊脂上培養(yǎng)。質(zhì)粒pK18mobsacB含有一個(gè)拷貝的sacB基因，其將蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖。因此只有其中已經(jīng)再次切除整合的pK18mobsacB2xlysCSma2/1的那些克隆能在具有蔗糖的LB平板上生長(zhǎng)。對(duì)大約40—50個(gè)菌落測(cè)試"在蔗糖存在下生長(zhǎng)"和"在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)"的表型。在切除期間，lysC基因的兩個(gè)拷貝或者僅一個(gè)拷貝可以與所述質(zhì)粒一起切除。為證實(shí)lysC的兩個(gè)拷貝保留在染色體中，借助于Innis等所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，19卯，學(xué)術(shù)出版社)研究示出"在蔗糖存在下生長(zhǎng)"和"在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)"的大約20個(gè)菌落。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶lysC基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCR:lysCKl(SEQIDNO:5):5TCGGTGTCATCAGAGCATTG3,lysCK2(SEQIDNO:6):5,TCGGTTGCCTGAGTAATGTC3，所述引物在具有原始lysC基因座的對(duì)照克隆中擴(kuò)增出大約l.9kb的DNA片段。在染色體lysC基因座中具有l(wèi)ysC基因的第二個(gè)拷貝的克隆中，擴(kuò)增出大約3.6kb的DNA片段。擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別?；跀U(kuò)增的片段長(zhǎng)度，對(duì)具有一個(gè)染色體lysC基因拷貝的克隆和具有兩個(gè)染色體lysC基因拷貝的克隆加以區(qū)分。借助于RocheDiagnostics的LightCycler(Mannheim,德國(guó))，研究在染色體上具有l(wèi)ysC基因兩個(gè)完整拷貝的io個(gè)克隆，以證實(shí)這兩個(gè)拷貝是否是具有突變體lysCT311I的lysC^等位基因，或者原始野生型lysC是否存在于lysCF^等位基因lysCT311I的兩側(cè)。所述LightCycler是一種熱循環(huán)儀和熒光計(jì)組合設(shè)備。使用以下寡核苷酸引物通過(guò)PCR在第一階段擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的大約500bp的DNA節(jié)段(Innis等，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)，所述引物為L(zhǎng)C國(guó)lysCl誦fbr(SEQIDNO:7):5，aaccgttctgggtatttccg3，LC-lysC2-fbr(SEQIDNO:8):5，tccatgaactctgcggtaac3，在第二階段，用不同長(zhǎng)度的及用不同熒光染料(光循環(huán)儀(LC)一Red640和熒光素)標(biāo)記的另外兩個(gè)寡核苷酸，借助于"熒光共振能量轉(zhuǎn)移"方法(FRET)，使用解鏈曲線(xiàn)分析(Lay等，臨床化學(xué)43:2262—2267(1997))檢測(cè)突變的存在，所述寡核苷酸在突變位點(diǎn)區(qū)域中雜交，其為:lysC311國(guó)C(SEQIDNO:9):5，LC-Red640—gcaggtgaagatgatgtcggt—(P)3，lysC311-A(SEQIDNO:10):5，tcaagatctccatcgcgcggcggccgtcggaacg3—熒光素3，所示進(jìn)行PCR的引物由MWGBiotech合成，所示進(jìn)行雜交的寡核苷酸由TIBMOLBIOL(德國(guó)柏林)合成。以此方式鑒別一個(gè)克隆，其在兩個(gè)lysC拷貝的編碼區(qū)的第932位含有堿基胸腺嘧啶，并因此具有兩個(gè)lysC^等位基因lysCT31U。所述菌株稱(chēng)為谷氨酸棒桿菌DSM139921ySCFBR::lysCFBR。所述菌株谷氨酸棒桿菌DSM139921ysCFB、lysCFBK根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2002年6月5日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))，保藏號(hào)DSM15036。實(shí)施例2:在谷氨酸棒桿菌的染色體中產(chǎn)生lysE基因的串聯(lián)重復(fù)體2.1構(gòu)建串聯(lián)載體pK18mobsacB2xlysESma1/1從大腸桿菌菌株DSM12871(EP-A-1067193)中分離攜帶質(zhì)粒pEC71ysE的質(zhì)粒DNA。所述質(zhì)粒含有編碼賴(lài)氨酸輸出蛋白的lysE基因。這個(gè)菌株的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1999年6月10日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))。將質(zhì)粒pEC71ysE用限制酶BamHI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))切割，在瓊脂糖凝膠(0.8%)中分離后借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))從瓊脂糖凝膠中分離大約l.lkb的lysE片段，用Klenow聚合酶(Boehringer，Mannheim)形成突出端并用于與Schafer等所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因14，69—73(1994))連接。將該載體預(yù)先用限制酶Smal切割并用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim，德國(guó))，其與大約l.lkb的lysE片段混合，將所述混合物用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg,德國(guó))處理。然后將大腸桿菌菌株DH5a(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645—4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1巻，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，19S9)。借助于得自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)酶BamHI和EcoRI限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBlxlysESmal。在第二步中，將質(zhì)粒pEC71ysE用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia,Freiburg,德國(guó))，借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Hilden,德國(guó))在瓊脂糖凝膠(0.8%)中分離后，將大約Ukb的lysE片段從瓊脂糖凝膠中分離，并用于與本實(shí)施例所述載體pK18mobsacBlxlysESmal連接。將該載體預(yù)先用限制酶BamHI切害ij，用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim,德國(guó))，之后與大約l.lkb的lysE片段混合，將所述混合物用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia,Freiburg,德國(guó))處理。然后將大腸桿菌菌株DH5a(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(19卯)4645—4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1巻，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，19S9)。借助于得自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)酶EcoRI和Sail或者Seal限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacB2xlysESma1/1。該質(zhì)粒圖示于圖2。2.2在谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513_17中產(chǎn)生lysE基因的串聯(lián)重復(fù)體將實(shí)施例2.1中所述載體pK18mobsacB2xlysESma1/1轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513_17中，通過(guò)對(duì)Schafer等所述方法加以修改后的方法進(jìn)行(1990，微生物學(xué)雜志172:1663—1666)。谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513_17從谷氨酸棒桿菌ATCC21513中通過(guò)多次非定向誘變、選擇和突變體選擇而產(chǎn)生。該菌株對(duì)賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并且是亮氨酸和高絲氨酸原養(yǎng)型。所述載體在ATCC21513_17不能獨(dú)立復(fù)制，而只有整合入染色體中才保留在細(xì)胞中。將接合混合物鋪板于補(bǔ)加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港，紐約，1989)上，對(duì)具有整合的pK18mobsacB2xlysESma1/1的克隆進(jìn)行選擇。將生長(zhǎng)的克隆鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，在33。C溫育16小時(shí)。為切除只具有一個(gè)拷貝的lysE基因的質(zhì)粒，在LB液態(tài)培養(yǎng)基中溫育16小時(shí)之后，將所述克隆在具有10%蔗糖的LB瓊脂上培養(yǎng)。質(zhì)粒pK18mobsacB含有一個(gè)拷貝的sacB基因，其將蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖。因此只有其中己經(jīng)再次切除整合的pK18mobsacB2xlysESma1/1的那些克隆能在具有蔗糖的LB平板上生長(zhǎng)。對(duì)大約40—50個(gè)菌落測(cè)試"在蔗糖存在下生長(zhǎng)"和"在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)"的表型。在切除期間，lysE基因的兩個(gè)拷貝或者僅一個(gè)拷貝可以與所述質(zhì)粒一起切除。為證實(shí)lysE的兩個(gè)拷貝保留在染色體中，借助于Innis等所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)研究示出"在蔗糖存在下生長(zhǎng)"和"在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)"的大約20個(gè)菌落。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶lysE基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCR:lysEK—1(SEQIDNO:ll):5TTGCTTGCACAAGGACTTCAC3，lysEK—2(SEQIDNO:12):5，TATGGTCCGCAAGCTCAATG3'所述引物在具有原始lysE基因座的對(duì)照克隆中擴(kuò)增出大約1.2kb的DNA片段。在染色體lysE基因座中具有l(wèi)ysC基因的第二個(gè)拷貝的克隆中，擴(kuò)增出大約2.3kb的DNA片段。擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別。基于擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度，對(duì)具有一個(gè)染色體lysE基因拷貝的克隆和具有兩個(gè)染色體lysE基因拷貝的克隆加以區(qū)分。因此可以證實(shí)菌株ATCC21513—17在染色體上攜帶lysE基因的兩個(gè)完整拷貝。所述菌株稱(chēng)為谷氨酸棒桿菌ATCC21513—171ysE::lysE。所述菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21513一171ysE::lysE根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2002年6月5日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))，保藏號(hào)DSM15037。實(shí)施例3:在谷氨酸棒桿菌染色體中產(chǎn)生zvval基因的串聯(lián)重復(fù)體3.1構(gòu)建串聯(lián)載體pK18mobsacBzwalzwal從攜帶質(zhì)粒pCR2，lzwalexp的大腸桿菌菌株DSM13115(EP-A-1111062)中分離質(zhì)粒DNA。所述質(zhì)粒含有編碼細(xì)胞生長(zhǎng)因子1的zwal基因。這個(gè)菌株的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1999年10月19日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))。將質(zhì)粒pCR2.1zwalexp用限制酶EcoRI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg,德國(guó))切割，在瓊脂糖凝膠(0.8%)中分離后借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Hilden，德國(guó))從瓊脂糖凝膠中分離lkb的zwal片段，并用于與Schafer等所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因14，69—73(1994))連接。將該載體預(yù)先用限制酶EcoRI切割并用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim，德國(guó))，之后與lkb的zwal片段混合，將所述混合物用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg,德國(guó))處理。然后將大腸桿菌菌株DH5ot(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645—4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1巻，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，19S9)。借助于得自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)酶NheI限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。對(duì)質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果示出兩個(gè)zwal片段同時(shí)以所希望方向的克隆在克隆載體pK18mobsac中。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBzwalzwal。該質(zhì)粒圖示于圖3。3.2在谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513一17中產(chǎn)生zwal基因的串聯(lián)重復(fù)體將實(shí)施例3.1中所述載體pK18mobsacBzwalzwal轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513_17中，通過(guò)對(duì)Schafer等所述方法加以修改后的方法進(jìn)行(19卯，微生物學(xué)雜志172:1663—1666)。谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21513J7從谷氨酸棒桿菌ATCC21513中通過(guò)多次非定向誘變、選擇和突變體選擇而產(chǎn)生。該菌株對(duì)賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并且是亮氨酸和高絲氨酸原養(yǎng)型。所述載體在ATCC21513—17不能獨(dú)立復(fù)制，而只有整合入染色體中才保留在細(xì)胞中。將接合混合物鋪板于補(bǔ)加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港，紐約，1989)上，對(duì)具有整合的pK18mobsacBzwalzwal的克隆進(jìn)行選擇。將生長(zhǎng)的克隆鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，在33-C溫育16小時(shí)。為切除只具有一個(gè)拷貝的zwal基因的質(zhì)粒，在LB液態(tài)培養(yǎng)基中溫育16小時(shí)之后，將所述克隆在具有10%蔗糖的LB瓊脂上培養(yǎng)。質(zhì)粒pK18mobsacB含有一個(gè)拷貝的sacB基因，其將蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖。因此只有其中已經(jīng)再次切除整合的pK18mobsacBzwalzwal的那些克隆能在具有蔗糖的LB平板上生長(zhǎng)。對(duì)大約40—50個(gè)菌落測(cè)試"在蔗糖存在下生長(zhǎng)"和"在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)"的表型。在切除期間，zwal基因的兩個(gè)拷貝或者僅一個(gè)拷貝可以與所述質(zhì)粒一起切除。為證實(shí)有zwal的兩個(gè)拷貝保留在染色體中，借助于Innis等所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)研究示出"在蔗糖存在下生長(zhǎng)"和"在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)"的大約20個(gè)菌落。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶zwal基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCR:zwal-A2(SEQIDNO:13):5，CACTTGTCCTCACCACTTTC3，zwal-El(SEQIDNO:14):5TTCTACTGGGCGTACTTTCG3，所述引物在具有原始zwal基因座的對(duì)照克隆中擴(kuò)增出大約1.3kb的DNA片段。在染色體zwal基因座中具有zwal基因的第二個(gè)拷貝的克隆中，擴(kuò)增出大約2.3kb的DNA片段。擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別。基于擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度，對(duì)具有一個(gè)染色體zwal基因拷貝的克隆和具有兩個(gè)染色體zwal基因拷貝的克隆加以區(qū)分。因此可以證實(shí)菌株ATCC21513一17在染色體上攜帶zwal基因的兩個(gè)完整拷貝。所述菌株稱(chēng)為谷氨酸棒桿菌ATCC21513J7zwalzwal。所述菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21513一17zwalzwal根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2002年6月5日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))，保藏號(hào)DSM15038。實(shí)施例4:生產(chǎn)賴(lài)氨酸將在實(shí)施例l一3中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM139921ysCFB11:lysCFBR，ATCC21513—171ysE::lysE和ATCC21513—17zwal::zwal，在適于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)上清中賴(lài)氨酸含量。為此，首先在33'C將菌株在瓊脂平板上溫育24小時(shí)。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MM培養(yǎng)基。在搖床上以240rpm于33匯溫育預(yù)培養(yǎng)物24小時(shí)。用這一預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(波長(zhǎng)660nm)為O.l。培養(yǎng)基MM也用作主培養(yǎng)物。培養(yǎng)基MM:CSL5g/lMOPS20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)50g/l:(NH4)2S0425g/lKH2P040.1g/1MgS04*7H201.0g/lCaCl22H2010mg/lFeS047H2010mg/lMnS04H205.0mg/l生物素(過(guò)濾滅菌)0.3mg/l硫胺素HC1(過(guò)濾滅菌)0.2mg/lCaC0325g/l用氨水將CSL(玉米漿)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和所述鹽溶液的pH調(diào)節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無(wú)菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaC03。在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。在33'C和80%濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。48小時(shí)后，用Biomek1000(BeckmannInstrumentsGmbH，Munich)在660nm測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定賴(lài)氨酸生成量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表10。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>附圖簡(jiǎn)述示出的堿基對(duì)數(shù)目是在重復(fù)測(cè)定中獲得的近似值。圖1:質(zhì)粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1圖。所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KmR:卡那霉素抗性基因HindIII:限制酶HindIII的切割位點(diǎn)BamHI:限制酶BamHI的切割位點(diǎn)lysC:lysCfbR等位基因lysCT311IsacB:sacB基因RP4mob:具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV:復(fù)制起點(diǎn)V圖2:質(zhì)粒pK18mobsacB2xlysESma1/1圖。所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義-KanR:卡那霉素抗性基因Sail:限制酶Sail的切割位點(diǎn)BamHI:限制酶Bamffl的切割位點(diǎn)EcoRI:限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)Seal:限制酶ScaI的切割位點(diǎn)lysE:lysE基因sacB:sacB基因RP4mob:具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV:復(fù)制起點(diǎn)V圖3:質(zhì)粒pK18mobsacBzwalzwal圖。所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR:卡那霉素抗性基因EcoRI:限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)Nhel:限制酶NheI的切割位點(diǎn)zwal:zwal基因sacB:sacB基因RP4mob:具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV:復(fù)制起點(diǎn)V序列表<110>德古薩股份公司<120>生產(chǎn)化合物II的棒狀細(xì)菌<130>DEDEG0504<160>14<170>Patentlnversion3.<210><211><212>1263DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>CDS<222>(1)..(1263)<223>lysC野生型基因<400>1gtggccctggtcgtacagaaatafggcggttcctcgcttgagagtgcgMetAlaLeuValValGinLysTyrGlyGlySerSerLeuGluSerAla15101548gaacgcattagaaacgtcgetgaaeggategttgccaccaagaaggetGluArglieArgAsnValAlaGluArglieValAlaThrLysLysAla20253096ggaaatgatgtcgtggttgtctgctccgcaatgggagacaccacggatGlyAsnAspValValValValCysSerAlaMetGlyAspThrThrAsp354045144gaacttetagaacttgcagcggcagtgaatcccgttccgccagetcgtGluLeuLeuGluLeuAlaAlaAlaValAsnProValProProAlaArg505560192gaaatggatatgetcctgactgetggtgagcgtatttctaacgetetcGluMetAspMetLeuLeuThrAlaGlyGluArglieSerAsnAlaLeu65707580240gtcgccatggetattgagtcccttggcgcagaagcccaatctttcacgValAlaMetAlalieGliiSerLeuGlyAlaGluAlaGinSerPheThr859095288ggctctcaggetggtgtgetcaccaccgagcgccacggaaacgcacgcGlySerGinAlaGlyValLeuThrThrGluArgHisGlyAsnAlaArg100105110336attgttgatgtcactccaggtcgtgtgcgtgaagcaetcgatgagggclieValAspValThrProGlyArgValArgGluAlaLeuAspGluGly115120125384aagatctgcattgttgetggtttccagggtgttaataaagaaacccgcLyslieCyslieValAlaGlyPheGinGlyValAsnLysGluThrArg130135140432gatgtcaccacgttgggtcgtggtggttctgacaccactgcagttgcgAspValThrThrLeuGlyArgGlyGlySerAspThrThrAlaValAla145150155160480ttggcagetgetttgaacgetgatgtgtgtgagatttacteggacgttLeuAlaAlaAlaLeuAsnAlaAspValCysGlulieTyrSerAspVal165170175528gacggtgtgtataccgetgacccgcgcategttcctaatgcacagaagAspGlyValTyrThrAlaAspProArglieValProAsnAlaGinLys180185190576ctggaaaagetcagettcgaagaaatgctggaacttgetgetgttggcLeuGluLysLeuSerPheGluGluMetLeuGluLeuAlaAlaValGly195200205624tecaagattttggtgctgcgcagtgttgaatacgetcgtgcattcaatSerLyslieLeuValLeuArgSerValGluTyrAlaArgAlaPheAsn210215220672attgecggctctatggaggatattcctgtggaaga'agcagtccttacclieAlaGlySerMetGluAsplieProValGluGluAlaValLeuThr245250255768ggtgtcgcaaccgacaagtecgaagecaaagtaaccgttctgggtattGlyValAlaThrAspLysSerGluAlaLysValThrValLeuGlylie260265270816tecgatsagccaggcgaggetgcgaaggttttccgtgcgttggetgatSerAspLysProGlyGluAlaAlaLysValPheArgAlaLeuAlaAsp275280285864gcagsaateaacattgacatggttctgcagaacgtctcttctgtagaaAlaGlulieAsnlieAspMetValLeuGinAsnValSerSerValGlu290295300912gacggcaccaccgacateaccttcacctgccctcgttecgacggccgcAspGlyThrThrAsplieThrPheThrCysProArgSerAspGlyArg305310315320960cgcgcgatggagatettgaagaagcttcaggttcagggcaactggaccArgAlaMetGlulieLeuLysLysLeuGinValGinGlyAsnTrpThr3253303351008aatgtgctttacgacgaccaggtcggcaaagtctecetcgtgggtgetAsnValLeuTyrAspAspGinValGlyLysValSerLeuValGlyAla3403453501056ggcatgaagtctcacccaggtgttaccgcagagttcatggaagetctg1104ccacttcgcgtacgctegtcttatagtaatgatcccggcactttg720ProLeuArgValArgSerSerTyrSerAsnAspProGlyThrLeu230235240gl5t32gV2GlyMetLysSerHisProGlyValThrAlaGluPheMetGluAlaLeu355360365cgcgatgtcaacgtgaacategaattgatttecacctctgagattcgt1152ArgAspValAsnValAsnlieGluLeulieSerThrSerGlulieArg370375380atttecgtgctgatecgtgaagatgatctggatgetgetgcacgtgcalieSerValLeulieArgGluAspAspLeuAspAlaAlaAlaArgAla385390395徹1200ttgestgsgcagttccagctgggcggcg33gscgaagecgtcgtttatLeuHisGluGinPheGinLeuGlyGlyGluAspGluAlaValValTyr4054104151248gcaAlaggcGlysecThrggaGly420cgcArg1263<210><211><212><213>2421PRT<秦>2MetAlaLeuCorynebacteriumglutamic咖LysTyrGlyValVal5GinGluArglieGlyAsnGlu!Leu50Arg20AsnValAlaGluAsp35ValValValValLeuGluLeuMaAla55Arg25Gly10SerSerLeuGlulieValAlaThrCys40SerAlaMetGlyAlaValAsnProAsp45Val60Lys30Ser15AlaLysAlaThrThrAspProProAlaArgGlu65MetAspMetLeuValAlaMetAlaGlySerGinlieValLysAsp115lie85Ala100LeuThrAlaGly70GluSer!LeuGlyGlyValLeuThrValThrProGlylie130CyslieValAlaAsp145ValThrThrLeuGly150Arg120Thr105ValGluAla90GluGly135ArgPheGinGlyArg75ArgGlyGlySerValAsp155lieSerAsnAlaGluAlaGinSerArgHisGlyGluAsn110Phe95AlaLeu80ThrAla140ArgAspGluGlyLysGluThrArgLeu125ThrThrAlaValAla160LeuAlaAlaAlaLeuAsnAlaAspValCysGlulieTyrSerAspVal165170175AspGlyValTyrThrAlaAspProArglieValProAsnAlaGinLys180185190LeuGluLysLeuSerPheGluGluMetLeuGluLeuAlaAlaValGly195200205SerLyslieLeuValLeuArgSerValGluTyrAlaArgAlaPheAsn210215220ValProLeuArgValArgSerSerTyrSerAsnAspProGlyThrLeu225230235240lieAlaGlySerMetGluAsplieProValGluGluAlaValLeuThr245250255GlyValAlaThrAspLysSerGluAlaLysValThrValLeuGlylie260265270SerAspLysProGlyGluAlaAlaLysValPheArgAlaLeuAlaAsp275280285AlaGlulieAsnlieAspMetValLeuGinAsnValSerSerValGlu290295300AspGlyThrThrAsplieThrPheThrCysProArgSerAspGlyArg305310315320ArgAlaMetGlulieLeuLysLysLeuGinValGinGlyAsnTrpThr325330335AsnValLeuTyrAspAspGinValGlyLysValSerLeuValGlyAla340345.350GlyMetLysSerHisProGlyValThrAlaGluPheMetGluAlaLeu355360365ArgAspValAsnValAsnlieGluLeulieSerThrSerGlulieArg370375380lieSerValLeulieArgGluAspAspLeuAspAlaAlaAlaArgAla385390395400LeuHisGluGinPheGinLeuGlyGlyGluAspGluAlaValValTyr405410415AlaGlyThrGlyArg420<210>3<211>1263<212>DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>CDS<222>(1)"(1263)<223>lysC-fbr等扭基因lysCT311I<徹>:gtggccMetAlactgLeugtcValValGin333LyststTyrggcGlyggtGly10tecSertegSercttLeuGluagtSer15gcgAla48gaacgcattagaaacgtcgetgaaeggategttgccaccaagaaggetGluArglieArgAsnValAlaGluArglieValAlaThrLysLysAla20253096ggaaatgatgtcgtggttgtctgctecgcaatgggagacaccacggatGlyAsnAspValValValValCysSerAlaMetGlyAspThrThrAsp354045144g33GlucttLeu50LeugasGlucttLeugcaAlagcgAla55gcaAlagtgValsatAsncccProgttVal60ccgProCC3ProgetAlacgtArg192gaaatggatatgetcctgactgetggtgagcgtatttctaacgetetcGluMetAspMetLeuLeuThrAlaGlyGluArglieSerAsnAlaLeu6570"7580240gtcgccatggetattgagteccttggcgcagaagcccaatctttcacgValAlaMetAlalieGluSerLeuGlyAlaGluAlaGinSerPheThr859095288ggctctcaggetggtgtgetcaccaccgagcgccacggaaacgcacgcGlySerGinAlaGlyValLeuThrThrGluArgHisGlyAsnAlaArg100105110336attgttgatgtcactccaggtcgtgtgcgtgaagcaetcgatgagggclieValAspValThrProGlyArgValArgGluAlaLeuAspGluGly115120125384aagatetgcattgttgetggtttccagggtgttaataaagaaacccgcLyslieCyslieValAlaGlyPheGinGlyValAsnLysGluThrArg130135140432gatgtcaccacgttgggtcgtggtggttctgacaccactgcagttgcgAspVslThrThrLeuGlyArgGlyGlySerAspThrThrAlaValAla145150155160480ttggcagetgetttgaacgetgatgtgtgtgagatttacteggacgttLeuAlaAlaAlaLeuAsnAlaAspValCysGlulieTyrSerAspVal165170175528gacggtgtgtataccgetgacccgcgcategttcctsatgcacagaagAspGlyValTyrThrAlaAspProArglieValProAsnAlaGinLys180185190576ctgLeugs3Glu33gLys195etcLeuSerttcPhegaaGlugaaGlu200atgMetctglieug33GlucttLeugetAla205getAlagttValggcGly624tecaagattttggtgctgcgcagtgttgaatacgetcgtgcattcaat672SerLyslieLeuValLeuArgSerValGluTyrAlaArgAlaPheAsn210215220gacggcaccaccgacateatettcsectgccctcgttecgscggccgcAspGlyThrThrAsplieliePheThrCysProArgSerAspGlyArg305310315320960cgcgcgatggagatettgaagaagcttcaggttcagggcaactggaccArgAlaMetGlulieLeuLysLysLeuGinValGinGlyAsnTrpThr3253303351008cgcgatgtcaacgtgaacategaattgatttecacctctgsgattcgt1152ArgAspValAsnValAsnlieGluLeulieSerThrSerGlulieArg370375380atttecgtgctgatecgtgaagatgatctggatgetgetgcacgtgca1200lieSerValLeulieArgGluAspAspLeuAspAlaAlaAlaArgAla385390395400ttgcatgagcagttccagctgggcggcgaagacgaagecgtcgtttat1248LeuHisGluGinPheGinLeuGlyGlyGluAspGluAlaValValTyr405410415gcaggcaccggacgc1263AlaGlyThrGlyArg420<210>4<211>421ccacttcgcgtacgctcgtcttatagtaatgatcccggcactttg720ProLeuArgValArgSerSerTyrSerAsnAspProGlyThrLeu230235240attgecggctctatggsggait3ttcctgtggei3gssgesgtccttsec768lieAlaGlySerMetGluAsplieProValGluGluAlaValLeuThr245250255ggtgtcgcaaccgacaagtecgaagecaaagtaaccgttctgggtatt816GlyValAlaThrAspLysSerGluAlaLysValThrValLeuGlylie260265270tecgataagccaggcgsggetgcgaaggttttccgtgcgttggetgat864SerAspLysProGlyGluAlaAlaLysValPheArgAlaLeuAlaAsp275280285gcagaaateaacattgacatggttctgcagaacgtctcttctgtaAlaGlulieAsnlieAspMetValLeuGinAsnValSerSerVal290295300satgtgctttacgacgaccaggtcggcaaagtctecetcgtgggtgetAsnValLeuTyrAspAspGinValGlyLysValSerLeuValGlyAla34034535010561104ggcatgaagtctcacccaggtgttaccgcagagttcatgGlyMetLysSerHisProGlyValThrAlaGluPheMet355360365t32gV23u<01gGtetac1gG<212>PRT<213>Corynebacteriumglutamicum<400>4MetAlaLeuValValGinLysTyrGlyGlySerSerLeuGluSerAla151015GluArglieArgAsnValAlaGluArglieValAlaThrLysLysAla202530GlyAsnAspValValValValCysSerAlaMetGlyAspThrThrAsp354045GluLeuLeuGluLeuAlaAlaAlaValAsnProValProProAlaArg505560GluMetAspMetLeuLeuThrAlaGlyGluArglieSerAsnAlaLeu65707580ValAlaMetAlalieGluSerLeuGlyAlaGluAlaGinSerPheThr859095GlySerGinAla100lieValAspVal115GlyValLeuThrThrGlu105ThrProGlyArgVal120LyslieCyslieValAlaGly130135ArgPheGinGlyArgHisGluAlaValAsn140GlyAsnAlaArg110LeuAspGluGly125LysGluThrArgAspValThrThr145LeuAlaAlaAlaLeuLeu165Gly150ArgGlyGlySerAspAspThr155ThrAlaValAla160AsnAlaAspValCys170GlulieTyrSerAspVal175AspGlyValTyr180ThrAlaAspProArglieValPro185AsnAlaGinLys190LeuGluLysLeu195SerPheGluGluMetLeuGluLeu200SerLyslieLeuValLeuArg210215SerValGluTyrAla220AlaAlaValGly205ArgAlaPheAsnValProLeuArg225ValArg230SerSerTyrSerAsnAspProGlyThrLeu235240lieAlaGlySerMetGluAsplieProValGluGlu245250AlaValLeuThr255GlyValAlaThr260AspLysSerGluAlaLysValThr265ValLeuGlylie270SerAspLysProGly275AlaGlulieAsnlie290AspGlyThrThrAsp305ArgAlaMetGlulie325AsnValLeuTyrAsp340GlyMetLysSerHis355ArgAspValAsnVal370lieSerValLeulie385LeuHisGluGinPhe405AlaGlyThrGlyArg420<210>5<211>20<212>DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>misc一feature<222>(1)..(20)<223>引輛lysCKl<400>5tcggtgtcatcagagcattg20<210>6<211>20<212>DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>misc—feature<222>(1)"(20)<223>弓l敘lysCK274GluAlaAlaLysValPheArgAla280285LeuAlaAspAspMetVal!LeuGinAsnValSer295300SerValGlulieliePheThrCysProArgSer310315AspGlyArg320LeuLysLysLeuGinValGinGly330AsnTrpThr335AspGinValGlyLysValSerLeu345ValGlyAla350ProGlyValThrAlaGluPheMet360365GluAlaLeuAsnlieGluLeulieSerThrSer375380GlulieArgArg390GluAspGinLeuGlyAspLeuAspAlaAla395GlyGluAspGluAla410AlaArgAla400ValValTyr415<權(quán)>6tcggttgcctgagtaatgtc20<210><211><212><213><220><221><222><223>20Corynebacteriumglutamicummisc—feature(1).:(20)IiC-lysCl-fbr<權(quán)>7aaccgttctgggtatttccg20<210><211><212><213><220><221><222><223>820DNACorynebacteriumglutamicummiscfeature(1)(20)LC-lysC2-fb:r<權(quán)>8tccatgaactctgcggtaac20<210><211><212><213><220><221><222>921DNACorynebacteriumglutamicummisc_feature(1).:(21)<223>寡核苷酸lysC311-C<400>9gcaggtgaagatgatgtcggt21<210><211><212><213><220><221><222>1035DNACorynebacteriumglutamicummisc—feature(1).:(35)<223>寡核苷酸lysC311-A<400>10tcaagatctccatcgcgcggcggccgtcggaacga<210>1135<211><212><213><220><221><222><223>20DNACorynebacteriumglutamicummisc—feature(1).:(20)弓l物lysEK-l<權(quán)>11tgcttgcacaaggacttcac<210>12<211>20<212>DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>misc一feature<222>(1)..(20)<223>弓l物lysEK-2<400>12tatggtccgcaagctcaatg<210>13<211>20<212>DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>misc_feature<222>(1)…(20)<223>弓l物zwal-A2<400>13cacttgtcctcaccactttc<210>14<211>20<212>DNA202020<213>Corynebacteriumglutamicum<220><221>misc_feature<222>(1>.:(20)<223>弓l敘zwal-El<400>14ttctactgggcgtactttcg20權(quán)利要求1.用于生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法，該方法包括以下步驟a)發(fā)酵棒狀細(xì)菌，所述細(xì)菌具有兩個(gè)拷貝的基因；所述基因生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸并在所述細(xì)菌中存在于其天然的位點(diǎn)，且它們選自由以下所組成的組的一個(gè)或多個(gè)基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，Pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pycP458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T；在所述基因的兩側(cè)最多殘留所用載體序列或物種外源DNA的24個(gè)核苷酸殘基，且其中的兩個(gè)拷貝的所述基因在所述位點(diǎn)串聯(lián)排列；b)濃縮發(fā)酵肉湯和/或細(xì)菌細(xì)胞中的L-賴(lài)氨酸；c)分離所述L-賴(lài)氨酸，任選地d)伴有0-100wt％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的基因的拷貝是選自以下一組的一個(gè)或多個(gè)基因lysCFBR，lysE和zwal。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的基因的拷貝是lysE基因。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的基因的拷貝是zwal基因。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的基因的拷貝是lysCfBK等位基因，其編碼反饋抗性形式的天冬氨酸激酶。6.權(quán)利要求5的方法，其中由lysCFBK等位基因所編碼的反饋抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，SEQIDNO:2具有選自以下一組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換A279V，S301F，T308I,S301Y，G345D，R320G，T311I禾卩S381F。7.權(quán)利要求5的方法，其中由lysCFBK等位基因所編碼的反饋抗性形式的天冬氨酸激酶具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。8.權(quán)利要求5的方法，其中l(wèi)ysC^等位基因的編碼區(qū)具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述棒狀細(xì)菌屬于棒桿菌10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)菌屬于谷氨酸棒桿菌菌種。全文摘要本發(fā)明涉及棒狀細(xì)菌及通過(guò)發(fā)酵這些細(xì)菌制備化合物的方法，所述棒狀細(xì)菌在特定希望的位點(diǎn)(基因座)不是天然存在單拷貝的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因，而是具有優(yōu)選地串聯(lián)排列的所述感興趣的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少兩個(gè)拷貝，并任選地在另一個(gè)基因位點(diǎn)具有所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少第三個(gè)拷貝。文檔編號(hào)C12N9/00GK101126075SQ20071013716公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2002年7月30日優(yōu)先權(quán)日2001年8月6日發(fā)明者卡羅琳·賴(lài)內(nèi)恩,布里吉特·巴瑟,格奧爾格·蒂爾巴赫,貝蒂娜·默克爾申請(qǐng)人:德古薩股份公司