專利名稱：利用淀粉液化芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用淀粉液化芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的方法，利用淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生產(chǎn)抗菌肽，此抗菌肽具有作為食品防腐劑和飼料添加劑的潛力。
背景技術(shù)：
近年來，由于藥物的濫用，藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問題日漸嚴(yán)重，從而引發(fā)了人們對食品安全的關(guān)注，越來越多的國家開始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽因其獨(dú)特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊作用機(jī)理，已引起人們的極大的研究興趣，成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。抗菌肽(Antibacterial Peptides)是生物體產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)抗菌作用的陽離子多肽，一般其分子量小于5kD，氨基酸數(shù)目小于100，是生物先天免疫的重要組成成分。迄今為止，已在許多生物包括昆蟲、鳥類、動(dòng)物、植物及原核生物中發(fā)現(xiàn)600多種內(nèi)源性抗菌活性肽。這些抗菌肽不僅有廣譜抗細(xì)菌能力，而且有的對真菌、病毒及癌細(xì)胞也有一定的抑殺作用。此外，還具有穩(wěn)定性好、水溶性好、抗菌機(jī)理獨(dú)特、對高等動(dòng)物正常細(xì)胞無害等特點(diǎn)，屬無毒副作用、無殘留、無致細(xì)菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑。
國外，對抗菌肽已有較深的研究，在生產(chǎn)實(shí)際中有許多應(yīng)用。在食品防腐領(lǐng)域，目前已得到廣泛使用的抗菌肽是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的乳鏈菌肽(Nisin)，1990年被列入我國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)(GB2760)。由于Nisin可以被消化道的胰凝乳蛋白酶消化，不存在任何殘留、對身體無害，是目前公認(rèn)安全和應(yīng)用范圍最廣的天然肽類食品防腐劑。但也存在局限性，例如抑菌譜較窄，僅對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出顯著的抑制作用，對革蘭氏陰性菌和真菌沒有活性，在中性和堿性條件下對熱不穩(wěn)定，從而使其在食品中的應(yīng)用受到了一定限制。此外，從天然食品納豆中分離的納豆芽孢桿菌被證實(shí)也能產(chǎn)生抗菌肽，其在納豆食品的防腐中起到重要作用。其它也還有很多關(guān)于抗菌肽食品添加劑的研究，主要集中在乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽，但在實(shí)際應(yīng)用的還很少。因此，進(jìn)一步開發(fā)抗菌譜更廣，性能更加優(yōu)良的抗菌肽防腐劑顯得更加迫切。
在動(dòng)物飼料添加劑領(lǐng)域，抗菌肽的促生長防病效果，已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)。我國，抗菌肽作為飼料添加劑的研究，近些年成為業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注熱點(diǎn)。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)將柞蠶抗菌肽基因在酵母中表達(dá)，利用酵母大量生產(chǎn)抗菌肽，用于飼料添加劑。據(jù)報(bào)道，柞蠶抗菌肽應(yīng)用于預(yù)防及治療雞的白痢效果明顯。應(yīng)用含抗菌肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬料，飼喂試驗(yàn)結(jié)果表明，蠶抗菌肽可減輕斷奶仔豬的腹瀉?；淈S雞飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，酵母基因工程抗菌肽可促進(jìn)小雞生產(chǎn)和減少排泄物氮含量，對粵黃雞具有促生長、保健和治療疾病的功能。抗菌肽酵母制劑作飼料添加劑的應(yīng)用效果顯著。而其它大規(guī)模運(yùn)用于生產(chǎn)實(shí)際的抗菌肽添加劑已不多見。
由于動(dòng)物源抗菌肽的來源有限，限制了其在實(shí)際中的大規(guī)模應(yīng)用。而微生物抗菌肽和動(dòng)物源抗菌肽相比，具有明顯的優(yōu)勢。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本大大降低，且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響，是克服抗菌肽實(shí)際應(yīng)用技術(shù)瓶頸的最佳途徑。
據(jù)報(bào)道，許多微生物可以產(chǎn)生抗菌肽，但未見利用淀粉化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)產(chǎn)生抗菌肽用于食品防腐及飼料添加劑的報(bào)道。淀粉液化芽孢桿菌通常被用來生產(chǎn)食品用淀粉酶，為食品中允許使用的食品微生物，具有極高的安全性。本技術(shù)利用淀粉化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)產(chǎn)生的抗菌肽抗菌譜廣、性能優(yōu)良，在食品防腐及飼料添加劑領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明是通過利用淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生產(chǎn)抗菌肽，此抗菌肽具有廣譜的抗菌活性、pH范圍廣、耐熱性能好，可作為食品防腐劑和飼料添加劑。
技術(shù)方案本發(fā)明利用淀粉液化芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的方法及產(chǎn)品，其特征在于以淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌種，種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，或接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)28～37℃培養(yǎng)2～4天后，提取，濃縮，吸附、干燥，生產(chǎn)一種抗菌肽產(chǎn)品；其中1)種子培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000ml，pH7.2；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO41g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000ml，pH7.0；3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕粉20％，麥麩70％，谷氨酸鈉5％，葡萄糖5％。
上述利用淀粉液化芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的方法，其特征在于將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調(diào)整pH到2，靜置后離心，沉淀用乙醇進(jìn)一步提取，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；或者將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后在上清液中加入25％體積的乙酸乙酯進(jìn)行提取，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；或者將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，于發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵，積累抗菌代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后上清液用Millipore超濾膜截留分子量3000以內(nèi)的生物分子，再將濾出液經(jīng)過納濾膜，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；或者將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)28～37℃培養(yǎng)2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品或再經(jīng)甲醇提取后，干燥，賦型劑吸附，混勻，得抗菌肽成品。
上述方法生產(chǎn)的抗菌肽產(chǎn)品，其特征在于本發(fā)明抗菌肽產(chǎn)品，是抗菌脂肽surfactin和fangycin兩類同系物的混合物，一類同系物分子量分別為994Da、1008Da、1022Da和1036Da；另一類同系物分子量分別為1449Da、1463Da、1477Da和1491Da。純品為黃色粘稠物，能耐受100℃ 30min的加熱，能抑制金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、蠟樣芽胞桿菌、溶血鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等革蘭氏陽性致病菌和大腸桿菌、熒光假單胞菌、沙門氏菌和耶爾森氏菌等革蘭氏陰性菌，以及酵母和黑曲霉、黑根霉、點(diǎn)青霉、毛霉、米曲霉、擴(kuò)展青霉、無花果曲霉、黃色鐮刀霉、番茄灰霉和草莓灰霉病菌等多種食品腐敗菌；在pH2-12活性不喪失。
有益效果 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為1.本發(fā)明首次利用淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生產(chǎn)抗菌肽，用于食品防腐和動(dòng)物飼料添加劑。該抗菌肽抗菌譜廣，對多株革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌有效，對酵母菌、霉菌也有明顯的抑制作用。而目前廣泛應(yīng)用的天然抗菌肽食品防腐劑Nisin抗菌譜相對較窄，僅對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出顯著的抑制作用，對革蘭氏陰性菌和真菌沒有活性。也顯示了在作為動(dòng)物促生長、防治腸道疾病和飼料防霉劑方面具有很好的應(yīng)用前景。該抗菌肽在pH2-12活性不喪失，而Nisin僅在酸性條件下抗菌活性穩(wěn)定。能耐受100℃ 30min的加熱，顯示了能耐受食品加工及飼料制粒的高溫處理的優(yōu)越性。
2.抗菌肽作為一種新型的食品防腐和飼料添加劑，具有無毒、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，符合當(dāng)今綠色安全食品生產(chǎn)的要求。淀粉液化芽孢桿菌通常被用來生產(chǎn)食品用淀粉酶，為食品中允許使用的食品微生物，具有極高的安全性。
3.本發(fā)明用微生物生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本大大降低，且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響，是克服抗菌肽飼料添加劑實(shí)際應(yīng)用技術(shù)瓶頸的最佳途徑。


圖1本發(fā)明抗菌肽產(chǎn)品中的抗菌肽各組分的LC-MS圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌種(公知公用菌株，16SrRNA基因序列GenBank登錄號為DQ177319)通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000ml，pH7.2；
再于發(fā)酵罐28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h(液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO41g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000ml，pH7.0。)，積累抗菌代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后上清液經(jīng)濃縮、干燥，得抗菌肽成品。經(jīng)高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。經(jīng)LC-MS測定，該抗菌肽產(chǎn)品是抗菌脂肽surfactin和fangycin兩類同系物的混合物，一類同系物分子量分別為994Da、1008Da、1022Da和1036Da；另一類同系物分子量分別為1449Da、1463Da、1477Da和1491Da(附圖1)。對比試驗(yàn)結(jié)果表明，該抗菌肽產(chǎn)品在pH 2-12活性不喪失，而Nisin僅在酸性條件下抗菌活性穩(wěn)定，能耐受100℃30min的加熱，顯示了能耐受食品加工及飼料制粒的高溫處理的優(yōu)越性。
實(shí)施例2淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)后，于發(fā)酵罐28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h(液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO41g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000ml，pH7.0。)，積累抗菌代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調(diào)整pH到2，靜置后離心，沉淀用甲醇進(jìn)一步提取，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品，經(jīng)高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
實(shí)施例3淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)后，于發(fā)酵罐28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h(液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCL 0.5g，KH2PO41g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000ML，pH7.0。)，積累抗菌代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后在上清液中加入25％體積的乙酸乙酯進(jìn)行提取，提取后進(jìn)行干燥，提取物經(jīng)賦型劑吸附，得抗菌肽成品，經(jīng)高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
實(shí)施例4淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，于發(fā)酵罐28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h(液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO41g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000ml，pH7.0。)，積累抗菌代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后上清液用超濾膜截留分子量3000以內(nèi)的生物分子，再將濾出液經(jīng)過納濾膜，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品，經(jīng)高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
實(shí)施例5淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基(固體發(fā)酵培養(yǎng)基(％)豆粕粉20，麥麩70，谷氨酸鈉5，葡萄糖5)，經(jīng)28～37℃的培養(yǎng)2～4天后，經(jīng)甲醇提取后，干燥，賦型劑吸附，混勻，得抗菌肽成品，經(jīng)高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
實(shí)施例6淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基(固體發(fā)酵培養(yǎng)基(％)豆粕粉20，麥麩70，谷氨酸鈉5，葡萄糖5)，經(jīng)28～37℃的培養(yǎng)2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品，經(jīng)高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于5g/kg，可用于動(dòng)物飼料添加劑。
表1 ES-2抗菌物質(zhì)的抗菌譜

注-無效果；以上編號為AS系列的菌株來自于中國菌種保藏中心；其它菌株及其試驗(yàn)結(jié)果由江蘇省疾病控制中心提供。
權(quán)利要求
1.一種利用淀粉液化芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的方法，其特征在于以淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌種，種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，或接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)28～37℃培養(yǎng)2～4天后，提取，濃縮，吸附、干燥，生產(chǎn)一種抗菌肽產(chǎn)品；其中1)種子培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000ml，pH7.2；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCl0.5g，KH2PO41g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000ml，pH7.0；3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕粉20％，麥麩70％，谷氨酸鈉5％，葡萄糖5％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用淀粉液化芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的方法，其特征在于將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調(diào)整pH到2，靜置后離心，沉淀用乙醇進(jìn)一步提取，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；或者將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后在上清液中加入25％體積的乙酸乙酯進(jìn)行提取，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；或者將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，于發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵，積累抗菌代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，然后上清液用Millipore超濾膜截留分子量3000以內(nèi)的生物分子，再將濾出液經(jīng)過納濾膜，提取物經(jīng)賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；或者將淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通過種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)28～37℃培養(yǎng)2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品或再經(jīng)甲醇提取后，干燥，賦型劑吸附，混勻，得抗菌肽成品。
3.用權(quán)利要求1或2所述方法生產(chǎn)的抗菌肽產(chǎn)品，其特征在于該抗菌肽產(chǎn)品是抗菌脂肽surfactin和fangycin兩類同系物的混合物，一類同系物分子量分別為994Da、1008Da、1022 Da和1036Da；另一類同系物分子量分別為1449 Da、1463 Da、1477 Da和1491 Da，純品為黃色粘稠物，能耐受100℃30min的加熱，能抑制金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、蠟樣芽胞桿菌、溶血鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等革蘭氏陽性致病菌和大腸桿菌、熒光假單胞菌、沙門氏菌和耶爾森氏菌等革蘭氏陰性菌，以及酵母和黑曲霉、黑根霉、點(diǎn)青霉、毛霉、米曲霉、擴(kuò)展青霉、無花果曲霉、黃色鐮刀霉、番茄灰霉和草莓灰霉病菌等多種食品腐敗菌；在pH 2-12活性不喪失。
4.權(quán)利要求3所述抗菌肽產(chǎn)品在食品防腐、動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種抗菌肽的生產(chǎn)方法和產(chǎn)品，它是通過利用淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amylolique faciens)ES－2菌株，種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，2％接種，28～35℃，進(jìn)行液體深層發(fā)酵30～48h，或接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)28～37℃培養(yǎng)2～4天后，提取，濃縮，吸附、干燥。本發(fā)明抗菌肽產(chǎn)品，分子量分別為994、1008、1022、1036和1449、1463、1477、1491 Da，它們是抗菌脂肽surfactin和fangycin兩類同系物的混合物，純品為黃色粘稠物，能耐受100℃30min的加熱，在pH 2－12活性不喪失，對細(xì)菌、真菌具有廣譜的抗菌活性、耐熱性能好，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道不易產(chǎn)生耐藥性，利用此方法生產(chǎn)成本低、工藝相對簡單，可作為食品防腐劑和飼料添加劑。
文檔編號C12R1/07GK1840683SQ200610037888
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者陸兆新, 孫力軍, 別小妹, 呂鳳霞, 方傳記, 劉姝, 黃現(xiàn)青 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)