專利名稱：一種塵螨變應(yīng)原制備的病毒去除和滅活處理工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變應(yīng)原提取制備工藝，具體地說(shuō)是一種塵螨變應(yīng)原浸液制備中的病毒去除滅活處理工藝。
背景技術(shù)：
近50年變應(yīng)患病率在全球急劇上升，估計(jì)全球40％以上的人群是具特應(yīng)性(atopy)。哮喘在兒童中患病率為10％～15％，全球有1.0～1.5億患兒，是西方國(guó)家兒童慢性病住院醫(yī)治的主要病種，許多國(guó)家為此支付巨大的衛(wèi)生經(jīng)費(fèi)。1997年《歐洲變應(yīng)白皮書》指出21世紀(jì)變應(yīng)流行，預(yù)防日益上升的變應(yīng)/哮喘的患病率，2000年成立了世界變應(yīng)組織(World Allergy Organization。WAO)，負(fù)責(zé)變態(tài)反應(yīng)學(xué)的交流和教育，研討防治策略。
塵螨是螨性變應(yīng)(mite allergy)是上世紀(jì)60年代變應(yīng)學(xué)的一項(xiàng)突破，公認(rèn)為世界性衛(wèi)生問(wèn)題。屋塵中的住家螨類廣泛分布于全球有人群生活的地方，是強(qiáng)烈的變應(yīng)原，引起的是全身性變態(tài)反應(yīng)(allergy)，包括變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻球結(jié)膜炎、特應(yīng)性濕疹/皮炎、變應(yīng)性蕁麻疹等，螨性變應(yīng)相應(yīng)占各該病種的80％左右。2003年全球哮喘防治策略(GINA)委員會(huì)提出全球哮喘病人估計(jì)有3億，2000年我國(guó)兒童哮喘患病率為0.5-3％，初步估計(jì)中國(guó)有1000萬(wàn)左右的哮喘兒童，全國(guó)共有2500萬(wàn)左右的哮喘病人，而2000年國(guó)內(nèi)在27城市調(diào)查兒童哮喘患病率較1990年上升70％左右。有的大城市則上升了一倍還多。這與大氣污染及生活模式不斷西化有關(guān)，隨著居住條件的改善，人們?cè)诿芊饪照{(diào)室內(nèi)工作、生活和學(xué)習(xí)時(shí)間越來(lái)越多，因而室內(nèi)過(guò)敏原成了主要的致敏因素。
關(guān)于螨作為哮喘的變應(yīng)原問(wèn)題，德國(guó)Dekker在1928年已提出，至1964年才為荷蘭Voorhorst等證實(shí)屋塵螨的代謝產(chǎn)物是屋塵中的主要變應(yīng)原，以屋塵螨疫苗對(duì)患者進(jìn)行免疫治療有良好療效，現(xiàn)在研究已進(jìn)入分子水平。我國(guó)從上世紀(jì)七十年代初上海醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)螨類研究室開(kāi)始了塵螨變應(yīng)的系列研究，進(jìn)行了大量基礎(chǔ)和應(yīng)用的調(diào)查研究，研制并生產(chǎn)粉塵螨疫苗供診斷和免疫治療螨性變態(tài)反應(yīng)具特效，取得了顯著的成績(jī)。
″變應(yīng)原″的制備和應(yīng)用必須符合安全、有效、可控的原則。目前制備變應(yīng)原浸液中的病毒滅活工藝還未受到重視。鑒于病毒對(duì)人體的危害，根據(jù)國(guó)家對(duì)生物制劑制定的有關(guān)安全法規(guī)，有必要在此過(guò)程中引進(jìn)病毒去除和滅活處理工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了提高塵螨變應(yīng)原浸液的安全性。為臨床治療提供安全、可靠的變應(yīng)原疫苗。
本發(fā)明采用了一種或多種方法聯(lián)合去除/滅活病毒。
(1)干熱法滅活病毒
提取過(guò)程中所用儀器300℃干烤24小時(shí)。培養(yǎng)基和提取緩沖溶液80℃加熱72小時(shí)，病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。所有操作過(guò)程均為嚴(yán)格無(wú)菌操作。
(2)用濾膜過(guò)濾變應(yīng)原提取液與常規(guī)分離方法比，膜分離工藝有分離迅速、節(jié)約能源、提高收率、減少污染、設(shè)備簡(jiǎn)單、連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)考慮到提取液中變應(yīng)原蛋白質(zhì)及多肽的分子量選擇適當(dāng)?shù)臑V膜系統(tǒng)，在過(guò)濾前對(duì)所選濾膜的病毒清除有效性和濾膜完整性進(jìn)行檢測(cè)。
(3)微波滅活病毒微波可以滅活有機(jī)體，對(duì)細(xì)菌、放線菌、真菌、噬菌體以及病毒等均有不同程度的滅活效果，且具有作用速度快、不殘留有害物等特點(diǎn)。
(4)色譜法去除病毒色譜法根據(jù)蛋白質(zhì)產(chǎn)物理化性質(zhì)的不同進(jìn)行設(shè)計(jì)及優(yōu)化從而達(dá)到分離雜蛋白及去除病毒等污染物。采用減小規(guī)模的色譜柱裝置對(duì)色譜過(guò)程的各個(gè)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。任何情況下，用于平衡、分離再生的緩沖液需與生產(chǎn)過(guò)程中使用的緩沖液相同。
(5)去除與滅活效果的驗(yàn)證去除與滅活病毒效果的驗(yàn)證在確保生物技術(shù)制品安全性方面起重要作用。對(duì)清除與滅活病毒效果的驗(yàn)證和評(píng)估有助于對(duì)任何未知、未發(fā)覺(jué)和有害病毒的去除提供一個(gè)可信的安全參考值。其目的是對(duì)滅活及去除病毒過(guò)程中定量估計(jì)病毒減少總水平方面有效的生產(chǎn)工序；驗(yàn)證過(guò)程始于原材料及不同生產(chǎn)階段的不同組分中添加有效量的某一病毒，并證明隨后的生產(chǎn)工序?qū)⑵淙コ驕缁睢?br> 驗(yàn)證中應(yīng)注意的其他事項(xiàng)有①應(yīng)選擇與生產(chǎn)過(guò)程中采用的原材料可能含有病毒種類的相關(guān)病毒或與其密切相關(guān)的特異模型病毒。所選病毒的理化性質(zhì)應(yīng)有代表性(病毒大小、核酸類型以及有無(wú)包膜等)，其中至少應(yīng)包含有一種對(duì)物理或化學(xué)處理有明顯抗性的病毒。
②應(yīng)研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)(包括機(jī)械參數(shù)和理化參數(shù))允許變化的幅度。
③研究病毒滅活動(dòng)力學(xué)，包括病毒滅活速率和滅活曲線。
④指示病毒滴度應(yīng)該盡可能高(病毒滴度應(yīng)≥106/ml)。
⑤加入的病毒與待驗(yàn)證樣品體積比不能高于1∶9。
⑥如可能，驗(yàn)證過(guò)程中每步取出的樣品應(yīng)盡快直接進(jìn)行病毒滴定，不做進(jìn)一步處理(如超離心、透析或保存、除去抑制劑或毒性物質(zhì)等)。如果樣品必須做進(jìn)一步處理，或不同時(shí)間取出的樣品要在同一時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)考慮這些處理方法對(duì)病毒檢測(cè)結(jié)果的影響。
⑦檢測(cè)方法可包括蝕斑形成、細(xì)胞病變(如合胞體或病灶形成)、終點(diǎn)滴定或其他方法。這些方法應(yīng)該有適宜的靈敏度和可重復(fù)性，每一個(gè)取樣點(diǎn)應(yīng)取雙份樣品并設(shè)有對(duì)照以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
⑧分別對(duì)各種病毒去除/滅活方法進(jìn)行病毒滅活效果驗(yàn)證。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的內(nèi)容，通過(guò)以下的實(shí)施例作具體說(shuō)明實(shí)施例1塵螨變應(yīng)原浸液的制備收集屋塵螨，稱量去脂材料，按1∶5比例(1g屋塵加入5ml提取液)加入碳酸氫鈉-鹽水提取液，提取72小時(shí)。每天在振蕩器上振蕩2小時(shí)，其余時(shí)間放入冰箱提取。
提取完成后，先用多層紗布過(guò)濾，棄去沉淀物，再用布氏漏斗加多層濾紙減壓過(guò)濾，澄清液體。記錄濾液量，放入透囊中透析24小時(shí)。使用碳酸氫鈉-鹽水提取液作為透析用液，每6小時(shí)更換一次。透析完畢，再稱量濾液，如因鹽析作用多出原量或少于原量，進(jìn)行濃縮或稀釋，使之保持原量。校正溶液pH值，使之保持在7。
在嚴(yán)格無(wú)菌操作下，將消毒蔡氏濾器安裝于消毒濾瓶上，用蒸餾水打濕濾板，倒入屋塵溶液。15分鐘后接通真空泵，使濾液穿過(guò)濾材滴入濾瓶，于無(wú)菌下分裝于瓶中。貼好標(biāo)簽，打上批號(hào)，放入4-6℃冰箱儲(chǔ)備待用。
實(shí)施例2干熱法滅活病毒提取過(guò)程中所用儀器300℃干烤24小時(shí)，培養(yǎng)基及提取緩沖液80℃加熱72小時(shí)，病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。驗(yàn)證時(shí)干燥箱內(nèi)應(yīng)設(shè)多個(gè)測(cè)溫點(diǎn)(包括制品內(nèi)、箱內(nèi)最高和最低溫度點(diǎn))。所有操作過(guò)程均為嚴(yán)格無(wú)菌操作。
實(shí)施例3過(guò)濾去除病毒在過(guò)濾前及過(guò)濾后應(yīng)測(cè)試濾膜的完整性。每次過(guò)濾均需采用新的濾膜。由于提取液中的變應(yīng)原蛋白質(zhì)和多肽分子量小于100kDa，故選用Millipore公司生產(chǎn)的ViresolveTM復(fù)合膜或Asahi公司生產(chǎn)的PLANOVA過(guò)濾分子量大于100kDa的病毒。
實(shí)施例4微波滅活病毒將除菌過(guò)濾前或除菌分裝后的提取液流經(jīng)一個(gè)可暴露于微波能量的一次性使用的單一環(huán)路通道，并在生產(chǎn)過(guò)程中相同的條件下暴露于微波，流速1ms，同時(shí)保持能量恒定，從而決定了溫度峰值不高于40℃。
實(shí)施例5色譜去除病毒將產(chǎn)物溶液通過(guò)Sephadex S-100分子篩，平衡、上樣和洗脫緩沖液均采用0.02M-PBS緩沖液，流速0.5ml/min。
實(shí)施例6去除與滅活病毒效果的驗(yàn)證在單獨(dú)的有病毒工作設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并由有病毒工作經(jīng)驗(yàn)的人員和設(shè)計(jì)制定按比例縮小純化工藝的生產(chǎn)人員共同完成。將病毒SV40(滴度2×106/ml)加入到要測(cè)試的每一生產(chǎn)步驟正在加工的材料中去(體積比不超過(guò)1∶9)，于不同時(shí)間取雙份樣品(一份對(duì)照)，并繪制滅活曲線；或進(jìn)行相應(yīng)的對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)病毒的感染性經(jīng)處理而失去。選用BHK-21細(xì)胞，采用蝕斑形成實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒進(jìn)行定量測(cè)定。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
微波病毒滅活效果分析取25ml加入病毒的產(chǎn)物溶液(同時(shí)取樣作對(duì)照)，將溶液流經(jīng)一個(gè)可暴露于微波能量的一次性使用的單一環(huán)路通道，并在生產(chǎn)過(guò)程中相同的條件下暴露于微波，流速1ms，同時(shí)保持能量恒定。樣品分前、中、后三部分收集，前后丟棄，保留中間部分用于病毒滴度的分析。
病毒清除試驗(yàn)中病毒清除因子的計(jì)算某一純化或滅活工序中病毒清除因子定義為純化前材料的病毒量與純化后準(zhǔn)備進(jìn)入下一工序材料病毒量的比值。
設(shè)起始材料容量V’，滴度10a’病毒量V’×10a’最終材料容量V”，滴度10a”病毒量V”×10a”則單個(gè)病毒清除因子Ri如下計(jì)算Ri=(V'×10a'')/(V''×10a'')]]>由于某些病毒滴度固有的不準(zhǔn)確性，因此用于計(jì)算總病毒清除因子的單個(gè)病毒清除因子應(yīng)大于1。整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的總病毒清除因子為各個(gè)生產(chǎn)步驟病毒清除因子的對(duì)數(shù)和，即第一次清除病毒開(kāi)始時(shí)和最后一次清除病毒后病毒量比值的對(duì)數(shù)。
實(shí)施例7去除與滅活病毒效果的驗(yàn)證在單獨(dú)的有病毒工作設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并由有病毒工作經(jīng)驗(yàn)的人員和設(shè)計(jì)制定按比例縮小純化工藝的生產(chǎn)人員共同完成。將病毒水泡性口炎病毒(VSV)，滴度8.13LogTCID50/ml，加入到要測(cè)試的每一生產(chǎn)步驟正在加工的材料中去(1∶9混合)，對(duì)照樣品立即從樣品和病毒混合液中取樣，-70℃凍存，作為零時(shí)對(duì)照樣品；處理樣品在不同時(shí)間(如干熱法處理緩沖液第1、2、3天)取樣品，培養(yǎng)細(xì)胞為VERO細(xì)胞，繪制滅活曲線；微波滅活時(shí)間太短故僅對(duì)對(duì)照和處理后樣品中病毒進(jìn)行測(cè)定。選用96孔細(xì)胞病變法對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
微波病毒滅活效果分析取25ml加入病毒的產(chǎn)物溶液(同時(shí)取樣作對(duì)照)，將溶液流經(jīng)一個(gè)可暴露于微波能量的一次性使用的單一環(huán)路通道，并在生產(chǎn)過(guò)程中相同的條件下暴露于微波，流速1ms，同時(shí)保持能量恒定。樣品分前、中、后三部分收集，前后丟棄，保留中間部分用于病毒滴度的分析。
病毒清除試驗(yàn)中病毒清除因子的計(jì)算同實(shí)施例6。
實(shí)施例8去除與滅活病毒效果的驗(yàn)證在單獨(dú)的有病毒工作設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并由有病毒工作經(jīng)驗(yàn)的人員和設(shè)計(jì)制定按比例縮小純化工藝的生產(chǎn)人員共同完成。將病毒呼腸病毒，滴度8.13LogTCID50/ml，加入到要測(cè)試的每一生產(chǎn)步驟正在加工的材料中去(1∶9混合)，對(duì)照樣品立即從樣品和病毒混合液中取樣，-70℃凍存，作為零時(shí)對(duì)照樣品；處理樣品在不同時(shí)間(如干熱法處理緩沖液第1、2、3天)取樣品，培養(yǎng)細(xì)胞為VERO細(xì)胞，繪制滅活曲線；微波滅活時(shí)間太短故僅對(duì)對(duì)照和處理后樣品中病毒進(jìn)行測(cè)定。選用96孔細(xì)胞病變法對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
微波病毒滅活效果分析取25ml加入病毒的產(chǎn)物溶液(同時(shí)取樣作對(duì)照)，將溶液流經(jīng)一個(gè)可暴露于微波能量的一次性使用的單一環(huán)路通道，并在生產(chǎn)過(guò)程中相同的條件下暴露于微波，流速1ms，同時(shí)保持能量恒定。樣品分前、中、后三部分收集，前后丟棄，保留中間部分用于病毒滴度的分析。
病毒清除試驗(yàn)中病毒清除因子的計(jì)算同實(shí)施例6。
權(quán)利要求
1.一種塵螨變應(yīng)原制備的病毒去除和滅活處理工藝，具體地說(shuō)是通過(guò)一種和多種方法對(duì)塵螨變應(yīng)原提取過(guò)程中的病毒去除和滅活處理工藝。1)干熱法提取過(guò)程中所用儀器300℃干烤，培養(yǎng)基及提取用緩沖液80℃加熱72小時(shí)，病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。所有操作過(guò)程均為嚴(yán)格無(wú)菌操作。2)過(guò)濾法用濾膜過(guò)濾變應(yīng)原提取液去除分子量大于100kDa的病毒。3)超聲法將除菌過(guò)濾前或除菌分裝后的提取液通過(guò)可暴露于微波能量的單一環(huán)路通道滅活病毒。4)色譜法用Sephadex S-100分子篩除去分子量大于100kDa的病毒。5)對(duì)所有去除和滅活病毒方法均進(jìn)行驗(yàn)證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活變應(yīng)原提取過(guò)程中的病毒。特征在于提取過(guò)程中所用儀器300℃干烤，培養(yǎng)基及提取用緩沖液80℃加熱72小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除變應(yīng)原提取過(guò)程中的病毒。特征在于用濾膜去除變應(yīng)原提取過(guò)程中的病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活變應(yīng)原提取過(guò)程中的病毒。其特征在于將除菌過(guò)濾前或除菌分裝后的提取液通過(guò)可暴露于微波能量的單一環(huán)路通道超聲滅活病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除變應(yīng)原提取過(guò)程中的病毒，起特征在于通過(guò)Sephadex S-100分子篩除去分子量大于100kDa的病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種塵螨變應(yīng)原浸液制備中的病毒去除和滅活處理工藝。通過(guò)一種或多種方法聯(lián)合去除/滅活病毒。具體的說(shuō)包括1)干熱法提取過(guò)程中所用儀器300℃干烤，培養(yǎng)基及提取用緩沖液80℃加熱72小時(shí)，病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。所有操作過(guò)程均為嚴(yán)格無(wú)菌操作。2)過(guò)濾法用濾膜過(guò)濾變應(yīng)原提取液去除分子量大于100kDa的病毒。3)超聲法將除菌過(guò)濾前或除菌分裝后的提取液通過(guò)可暴露于微波能量的單一環(huán)路通道滅活病毒。4)色譜法用Sephadex S－100分子篩除去分子量大于100kDa的病毒。5)對(duì)所有去除和滅活病毒方法均進(jìn)行驗(yàn)證。
文檔編號(hào)C12N7/04GK1763182SQ20051003647
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日
發(fā)明者劉志剛, 吉坤美, 喻海瓊 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)