專利名稱：抗菌肽ib－367的基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及抗菌肽的基因工程表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
抗生素的發(fā)現(xiàn)使人們對病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無策，對保護(hù)人類健康作出了巨大貢獻(xiàn)。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致病原菌株不斷產(chǎn)生耐藥性，一些過去抗生素非常有效得到控制的傳染性疾病，近年來死灰復(fù)燃。而且由于耐藥性的不斷增強(qiáng)和蔓延，現(xiàn)有抗生素已經(jīng)顯得無能為力。此外抗生素的普遍濫用和藥物殘留，一些抗生素的過敏反應(yīng)等諸多問題，已日趨嚴(yán)重和日益突出，迫切需要新一類的抗菌制劑加以解決。
面臨細(xì)菌耐藥性極大的挑戰(zhàn)和目前形勢的迫切性，研究者們?nèi)μ剿髋c目前作用機(jī)制完全不同的新型抗菌藥物。
抗菌肽廣泛存在于多種生物體內(nèi)，是生物體對外界病原物侵染而產(chǎn)生的一系列免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，其分子量小，性能穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的廣譜抗菌能力。這類抗菌肽作用于微生物膜(細(xì)胞膜、外膜)，破壞其屏障而達(dá)到殺傷細(xì)菌細(xì)胞的效果，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生，有希望成為新一代抗菌劑。
IB367蛋白一級結(jié)構(gòu)為Arg-Gly-Gly-Lue-Gys-Tyr-Gys-Arg-Gly-Arg-Phe-Gys-Val-Gys-Val-Gly-Arg，分子量約為1.9KDa，與另外一種抗菌肽Protegrin-1(NN2-Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Va-Gly-Arg-CONH2)是結(jié)構(gòu)類似物，分離于豬的白細(xì)胞(Deborah A.M.，et al.IB-367，a Protegrin Peptide with In Vitro and In Vivo Activities againstthe Microflora Associated with Oral Mucositis.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44(7)1803-1808.)。其抗菌譜廣泛，對于口腔中分離出的大部分細(xì)菌均有效，目前由資料顯示，該抗菌肽已經(jīng)在治療口腔感染上取得了一定的進(jìn)展。值得一提的是，該類多肽在體外抑制HIV方面顯示出了一定的效果。(Yau，Y.H.，et al.High Therapeutic Index of FactorC Sushi PeptidesPotent Antimicrobials against Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob.Agents Chemother.2001，452820-2825.)目前公開報道的IB-367均為化學(xué)合成產(chǎn)品，化學(xué)合成法工藝復(fù)雜，成本高，其生產(chǎn)過程使用大量有機(jī)溶劑，污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明旨在解決利用基因工程的方法高效表達(dá)抗菌肽IB367的問題。
技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種基因工程生產(chǎn)IB-367的方法。該方法包括合成IB-367的編碼序列，連接到合適的載體，在宿主細(xì)胞中表達(dá)和純化，其中編碼IB-367的DNA序列采用了大腸桿菌偏好的密碼子，具體序列見序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，表達(dá)載體可以是任何適合于大腸桿菌表達(dá)的載體，根據(jù)抗菌肽的分子量較小的特點(diǎn)，優(yōu)選融合表達(dá)載體，如pBS、pTrx、pTrxFus等，特別優(yōu)選GST融合表達(dá)載體，例如pGEX系統(tǒng)和pET系統(tǒng)的載體(購自amersham pharmacia biotech公司)，因?yàn)镚ST融合蛋白易于小分子肽的融合表達(dá)，鑒于純化需要目的肽和融合蛋白之間分子量有一定的差異，這樣小肽更容易純化徹底。而且為更好的適合于目的肽的切割。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2可采用常規(guī)方法用核酸自動合成儀合成。
基因工程表達(dá)的IB-367，對不同來源的5株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus最小殺菌濃度(MIC)為0.1～3μg/ml，對不同來源的5株銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa(綠膿桿菌)最小殺菌濃度(MIC)0.04～6μg/mL。對其它的如鏈球菌、變形桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌等都具有良好的殺菌作用。
有益效果本發(fā)明提供的基因工程生產(chǎn)IB-367的方法，采用了在大腸桿菌中的高豐度和使用規(guī)律高的密碼子，密碼子整體序列和密碼子之間重復(fù)少，減少了在復(fù)制過程中的錯配幾率，Tm值適中，在原核細(xì)胞融合表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的IB-367，占菌體總蛋白的48～52％。


pET42a(+)IB-367重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例，具體說明本法明。
本發(fā)明所用內(nèi)切酶、連接酶、其他分子生物學(xué)試劑和菌株E.coli DH5α購自Promega公司。電泳、感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)方法采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法進(jìn)行(薩姆布魯斯(Sambrool，J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)，北京，科學(xué)出版社，2002，8)。質(zhì)粒提取，采用上海生工試劑盒K192，按照使用說明進(jìn)行。
實(shí)施例1IB-367的基因工程表達(dá)表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化子的獲得按常規(guī)方法分別將核酸SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQID NO.5合成在質(zhì)粒pUC18載體上，依照說明書用SmaI(ccc/ggg)+EcoRI(g/aattc)對SEQ IDNO.1-pUC18酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖法(《分子克隆》)回收小片斷，用PhsAI(gacNN/NNgtc)+EcoRI(g/aattc)對載體pET42a(+)進(jìn)行酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖法回收大片斷，依照說明書用T4DNA連接酶連接回收產(chǎn)物，即可獲得含編碼IB-367的DNA序列的表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入新制備的大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，篩選并鑒定轉(zhuǎn)化子，常規(guī)方法提取質(zhì)粒，經(jīng)序列測定序列無誤。
誘導(dǎo)表達(dá)，檢測鑒定轉(zhuǎn)化子對照pET42a(+)BL21(DE3)plysS分別劃線含卡那霉素30ug/ml的LB平板，37℃培養(yǎng)的單個菌落接種含卡那霉素30ug/ml的LB肉湯20ml；以及空白對照BL21(DE3)plysS菌落接種不含抗生素的LB肉湯20ml。當(dāng)OD值達(dá)0.6時，分別加IPTG至終濃度1mM，37℃誘導(dǎo)表達(dá)2～3小時。5,000g離心5分鐘，保留上清，用20mM TrisHCl(pH8.0)洗滌，5,000g離心5分鐘，上清和沉淀保存于-80℃用于電泳檢測。在28KDa.分子量附近有條帶(分子量約27.9KDa)，即為融合蛋白，融合蛋白表達(dá)量分別是49％、52％、30％、42％和35％。
純化將GSTrap FF柱和HiTrap Benzamidine FF(high sub)(GE Healthcare-formerly AmershamBiosciences-Products)柱連接使用，使用AKTA Prime(amersham pharmacia biotech公司儀器)在線處理，樣品切割和Factor Xa去除一步完成。按GSTrap FF柱和HiTrap Benzamidine FF(high sub)說明書，配合使用Prime在線處理，濃縮得到IB-367，按照小肽分子的SDS-PAGE方法(石繼紅等，應(yīng)用SDS-PAGE顯示小分子多肽技術(shù)的探討，生物工程進(jìn)展，2001，Vol21，No.1，38～41)，SDS-PAGE電泳銀染檢測其分子量約為1.9KDa，序列測定與文獻(xiàn)報道一致。
實(shí)施例2抗菌效果檢測方法通過抑菌圈和殺菌濃度測定瓊脂糖擴(kuò)散抗菌鑒定(Agarose diffusion antimicrobial assay)(美國專利6,337,314，2002年1月8日)。
按照實(shí)施例1的方法得到基因工程表達(dá)的IB-367，對不同來源(標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌S.aureus，CMCC(B)26003和醫(yī)院臨床病例分離金黃色葡萄球菌菌株)的5株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus最小殺菌濃度(MIC)為0.1～3μg/ml，對不同來源(標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa Mignla，CMCC(B)10104和醫(yī)院臨床病例分離銅綠假單胞菌菌株)的5株P(guān)seudomonas aeruginosa銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)最小殺菌濃度(MIC)0.04～6μg/mL。
核苷酸序列表SEQ ID NO.1cgaggtggtc tgtgttattg tcgtggtcgt ttctgcgtgt gtgtgggccg c51SEQ ID NO.2cgaggcggcc tgtgttattg ccgtggtcgt ttctgcgtgt gcgtgggccg t51SEQ ID NO.3cgaggcggcc tgtgttattg ccgtggtcgt ttctgcgtgt gcgtgggccg t51SEQ IDNO.4cgaggagggc tgtgttattg ccggggtcgg ttctgcgtgt gcgtgggccg t51SEQ ID NO.5cgaggtggcc tgtgctactg ccgcggccgc ttctgcgttt gcgtcggccg c5權(quán)利要求
1.一種IB-367的基因工程生產(chǎn)方法，包括合成編碼IB-367的DNA序列，連接到適合的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)和純化，其中編碼IB-367的DNA序列為序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2
2.按照權(quán)利要求1的生產(chǎn)IB-367的方法，其中所用的表達(dá)載體是融合表達(dá)載體。
3.按照權(quán)利要求2的生產(chǎn)IB-367的方法，其中所用的表達(dá)載體是GST載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及抗菌肽IB－367的基因工程表達(dá)方法包括合成編碼IB－367的DNA序列，連接到適合的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)和純化，其中編碼IB－367的DNA序列，采用了在大腸桿菌中的高豐度和使用規(guī)律高的密碼子，密碼子整體序列和密碼子之間重復(fù)少，減少了在復(fù)制過程中的錯配幾率，T
文檔編號C12N15/12GK1920019SQ20051001483
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者楊旭, 吳全忠, 高峰, 姜燕 申請人:天津天士力制藥股份有限公司