專利名稱：作為酶底物的新吩噁嗪酮衍生物及其在檢測具有肽酶活性的微生物中作為指示劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測肽酶活性的新顯色酶底物。這些底物可被用在包括產(chǎn)生物理化學(xué)信號的酶促水解步驟的應(yīng)用中，特別是在微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、組織學(xué)等等。和大部分是發(fā)熒光的現(xiàn)有底物相比，本發(fā)明的顯色底物可被特別用于檢測微生物的凝膠培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兩傻娘@色在反應(yīng)介質(zhì)中不擴(kuò)散并因此在菌落中聚集。
本發(fā)明也涉及包含上述底物的反應(yīng)介質(zhì)，涉及所述底物或所述介質(zhì)在檢測表達(dá)肽酶活性的革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陽性細(xì)菌和酵母中的應(yīng)用，也涉及使用方法。
氨肽酶通常用以命名能夠水解裂解氨基酸的?；筒分g所生成酰胺基的酶，肽酶通常用以命名能夠水解裂解肽的?；鶜埢筒分g所生成酰胺基的酶。在本申請中，視情況而定，術(shù)語″肽酶″可以表示如上所述的肽酶和氨肽酶。
不擴(kuò)散的檢測肽酶活性的顯色酶底物已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述并被熟知。因此，這樣的底物受到申請人的專利申請WO-A-98/04735和WO-A-99/38995的保護(hù)。然而，這些底物表現(xiàn)出各種各樣的缺點(diǎn)它們很難合成，純度和得率低。另外，用于培養(yǎng)基，必須很精確限定培養(yǎng)基成分以便觀察到顏色。其它已知的底物無一可被用于在固體培養(yǎng)物中檢測混合培養(yǎng)物中的微生物。
眾所周知，吩噁嗪酮(phenoxazinone)衍生的分子具有產(chǎn)生熒光的能力。它們能被用作-充當(dāng)酸堿指示劑，如Stuzka，V.等人，1963，CollectionCzech.Chem.Commun.，28，1399-1407所述，-充當(dāng)熒光標(biāo)記，例如用于示蹤蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾，如Nakanishi J.等人，2001，Analytical Chemistry，73(13)，2920-2928.所述。
從未有吩噁嗪酮衍生物被用作酶底物。
根據(jù)本發(fā)明，提出用于檢測表達(dá)肽酶活性的微生物的新顯色酶底物。本發(fā)明也涉及包含上述底物的反應(yīng)介質(zhì)，也涉及該底物或該介質(zhì)檢測肽酶活性的應(yīng)用，以及使用方法。
實(shí)際上，申請人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，有可能通過使用顯色吩噁嗪酮衍生物檢測表達(dá)肽酶活性的微生物，它產(chǎn)生的顯色不在反應(yīng)介質(zhì)中擴(kuò)散，并因此聚集在菌落中，在培養(yǎng)基中通過菌落顏色的變化表明肽酶活性。
在用待測微生物接種含本發(fā)明底物的反應(yīng)介質(zhì)之后，當(dāng)后者不能夠水解該底物時，觀察到呈無色到白色的菌落。另一方面，當(dāng)它們能夠水解本發(fā)明的底物時，觀察到顯色的菌落。
本發(fā)明的吩噁嗪酮衍生物都顯色并發(fā)出熒光，而且具有檢測靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
因此，本發(fā)明的主題是式(I)的顯色酶底物 其中-R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成下式的萘環(huán) 或下式的任選取代的香豆素環(huán)
-或者R1和R2各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，鹵族原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺?；?，-R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成下式的任選取代的萘環(huán) -或者，R3和R4各自獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，SO3H基或氨磺酰基，可以認(rèn)為(i)R1/R2和R3/R4中至少之一與其連接的苯環(huán)組成如上所述任選取代的萘環(huán)或香豆素環(huán)，和(ii)當(dāng)R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成任選取代的香豆素環(huán)時，R3和R4與它們連接的苯環(huán)不組成任選取代的萘環(huán)，-R5和R6各自獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基或C1-C6烷基，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)R1/R2和R3/R4與它們連接的苯環(huán)分別組成萘環(huán)時，R6表示鹵素原子，-R7和R8各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧烷基，羧基或磺酸基，-或者R7和R8與它們連接的兩個碳原子一起組成C4-C6環(huán)，-R9表示氫原子，溴原子，氯原子，苯甲?；?CO2H基或-SO3H基，
應(yīng)當(dāng)理解，如果R9非氫原子，那么R5是氫原子，-R’表示氫原子或C1-C6烷基，-R”表示氫原子或C1-C6烷基，-或者R’和R”一起與它們連接的氮原子組成含一個或多個雜原子的雜環(huán)，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或無。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“芳基”尤其指C6-C10芳環(huán)，特別是苯基，苯甲基，1-萘基或2-萘基。芳烷基的芳基部分同樣如此。
本發(fā)明的芳烷基和羧基烷基中的烷基也是C1-C6。
術(shù)語″C1-C6烷基″指含1到6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。舉例來說，上述可以是甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基，戊基，異戊基，和己基。
術(shù)語″鹵素原子″是指氯、溴、碘和氟。
術(shù)語″雜原子″指不同于碳原子的原子，例如O，N或S。
R’和R”形成的雜環(huán)可以是任意大小，但優(yōu)選含5到7個環(huán)成員。
雜環(huán)的實(shí)例包括嗎啉，哌嗪，哌啶，吡咯烷和咪唑烷環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明說明書，取代基R1/R2和R3/R4組成的各種萘和香豆素環(huán)由包括連同相應(yīng)取代基的虛線表示以為了清楚，并可能顯示所述環(huán)在本發(fā)明的吩噁嗪酮衍生物結(jié)構(gòu)式(I)中的位置。
本發(fā)明的封端劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知能夠保護(hù)胺類的任何封端劑。例如叔丁氧基羰基(N-tBOC)，9-芴氧羧基，增溶劑例如琥珀酰，或非代謝性的即非天然的氨基酸例如2-哌啶酸。
該封端劑不是系統(tǒng)地存在于本發(fā)明的化合物中。在這種情況下，當(dāng)本發(fā)明的化合物無封端劑時(X是無)，本發(fā)明的化合物是鹽形式，例如氯化物，溴化物或三氟醋酸鹽。
在結(jié)構(gòu)式(I)中A表示的氨基酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，A表示氨基酸或最多含10個相同或不同氨基酸的肽。優(yōu)選地，出于對底物成本的考慮，A表示氨基酸或最多含4個相同或不同氨基酸的肽。
根據(jù)某一實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物具有結(jié)構(gòu)式(I) 其中-R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成下式的萘環(huán) 或下式的任選取代的香豆素環(huán) -或者R1和R2各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺酰基，-R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成下式任選取代的萘環(huán)
-或者R3和R4各自獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或氨磺?；梢哉J(rèn)為(i)R1/R2和R3/R4中至少之一與其連接的苯環(huán)組成如上所述任選取代的萘環(huán)或香豆素環(huán)，和(ii)當(dāng)R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成任選取代的香豆素環(huán)時，R3和R4與它們連接的苯環(huán)不組成任選取代的萘環(huán)，-R5和R6各自獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基或C1-C6烷基，應(yīng)當(dāng)理解(i)R6表示氫原子，當(dāng)R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)或香豆素環(huán)時，和(ii)R6表示鹵素原子，當(dāng)R1/R2和R3/R4與它們連接的苯環(huán)分別組成苯環(huán)時，-R3和R8分別獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧基烷基，羧基或磺酸基，-或者R3和R8與它們連接的兩個碳原子一起組成C4-C6環(huán)，-R9表示氫原子，溴原子，氯原子，苯甲?；?，-CO2H基或-SO3H基，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)R9非氫原子時，那么R5是氫原子，-R’表示氫原子或C1-C6烷基，-R”表示氫原子或C1-C6烷基，-或者R’和R”與它們連接的氮原子一起組成含一或多個雜原子的雜環(huán)，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或無。
根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物選自結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)，或R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成香豆素環(huán)，或者R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)，其它取代基如上定義，應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)R1/R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)或香豆素環(huán)的時候，R3/R4不會與它們連接的苯環(huán)同時組成萘環(huán)，反之亦然。
因此，根據(jù)此實(shí)施方案，酶底物是下列結(jié)構(gòu)式(I)的化合物 其中-R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成下式萘環(huán) 或下式任選取代的香豆素環(huán) -或者R1和R2各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺酰基，-R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成下式任選取代的萘環(huán)
-或者R3和R4分別獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或氨磺酰基，應(yīng)該理解R1/R2和R3/R4當(dāng)中有一個且僅有一個與它們連接的苯環(huán)組成如上所述的任選取代的萘環(huán)或香豆素環(huán)，-R5和R6分別獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，或C1-C6烷基，-R7和R8分別獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧基，羧基烷基，羧基或磺酸基，-或者R3和R8與它們連接的兩個碳原子一起組成C4-C6環(huán)，-R9表示氫原子，溴原子，氯原子，苯甲?；?CO2H基或-SO3H基，應(yīng)該理解，當(dāng)R9非氫原子時，那么R5是氫原子，-R’表示氫原子或C1-C6烷基，-R”表示氫原子或C1-C6烷基，-或者R’和R”與它們連接的氮原子一起組成含一或多個雜原子的雜環(huán)，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或無。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，A表示氨基酸或最多含10個相同或不同氨基酸的肽。優(yōu)選地，A表示氨基酸或最多含4個相同或不同氨基酸的肽。
根據(jù)某一具體實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物是具有下列結(jié)構(gòu)式(Ia)的酶底物
其中R5，R6和A和X如上所述。
結(jié)構(gòu)式(Ia)的化合物是結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1和R2基與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)，而R3和R4分別是氫原子。
優(yōu)選地，在結(jié)構(gòu)式(Ia)的化合物中，R5表示氫原子，R6表示氫原子或例如氯原子的鹵素原子，A為選自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端劑或無。
根據(jù)另一個具體實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物是結(jié)構(gòu)式(Ib)的酶底物 其中R5，R7，R8，A和X如上所述。
結(jié)構(gòu)式(Ib)的化合物是結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成香豆素環(huán)，而R3，R4和R6分別是氫原子。
優(yōu)選地，在結(jié)構(gòu)式(Ib)的化合物中，R5表示氫原子，R7和R8各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基或羧基烷基，或R7和R8與它們連接的兩個碳原子一起組成C4-C6環(huán)，A為選自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端劑或無。
還根據(jù)另一個具體實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物是結(jié)構(gòu)式(Ic)的酶底物
其中R5，R6，R9，A和X如上所述。
結(jié)構(gòu)式(Ic)的化合物是結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)，R1和R2分別是氫原子。
優(yōu)選地，在結(jié)構(gòu)式(Ic)的化合物中，R5，R6和R9基分別表示氫原子，A是選自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端劑或無。
還根據(jù)另一個具體實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物是結(jié)構(gòu)式(Id)的酶底物 其中R5，R6，A和X如上所述。
結(jié)構(gòu)式(Id)的化合物是結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1/R2和R3/R4與它們連接的苯環(huán)分別組成萘環(huán)。
依賴于R1/R2和R3/R4基所成的環(huán)，本發(fā)明的化合物可以按照若干制備方法制備，即R1/R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)，或R1/R2與它們連接的苯環(huán)組成香豆素環(huán)，或R3/R4和它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)，或R1/R2和R3/R4分別與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)。
因此，按照以下方案1中表示的方法可以制備結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)方案1
根據(jù)上述的方案1，結(jié)構(gòu)式(I)化合物(其中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán))由適量的2-氨基-5-硝基苯酚化合物(a)與適量的鹵化1，4-萘醌(b)制備，，它們已經(jīng)預(yù)先加熱到沸點(diǎn)，然后冷卻到25℃，使得生成相應(yīng)的9-硝基-苯并[a]吩噁嗪酮(c)?；衔颿接著與乙酰丙酮酸二價銅鹽的混合物反應(yīng)，該乙酰丙酮酸二價銅鹽與氫化硼鈉預(yù)先反應(yīng)，使得生成化合物(d)?；衔?d)隨后與一或多個任選保護(hù)的氨基酸(6)在冷卻到-12℃的水浴中反應(yīng)以便生成結(jié)構(gòu)式(I)的化合物。這里應(yīng)當(dāng)指出，毫無疑問，當(dāng)A是單個氨基酸時，化合物(6)中的A’相當(dāng)于化合物(I)的A，但包括一個另外的羥基。換句話說，當(dāng)A是單個氨基酸時，A’以-C(O)OH結(jié)束，當(dāng)A通過-C(O)-被連接到-NH-時，脫去-OH。當(dāng)A是具有至少兩個氨基酸的鏈時，A’的最后一個氨基酸如上所述，即它相對于A的最后一個氨基酸還包括一個另外的羥基。
結(jié)構(gòu)式(Ia)的化合物中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)而R6是氫原子，它還可以按照以下方案1a所描述的方法制備。
方案1a
按照方案1a，在-3℃下由適量的3-乙酰氨基苯酚化合物(1)與亞硝酸鹽(2)例如亞硝酸鈉(X＝Na)，亞硝酸鉀(X＝K)等反應(yīng)制備結(jié)構(gòu)式(Ia)的化合物。由此得到的亞硝基乙酰氨基苯酚(3)隨后與1，3-二羥基萘(4)在溶劑例如丁醇中反應(yīng)，加熱到大約70℃，然后加入濃硫酸并繼續(xù)加熱到90℃，然后冷卻，使得生成適量的9-乙酰氨基-苯并[a]吩噁嗪-5-酮。后者化合物隨后由適量的濃硫酸加熱使得產(chǎn)生9-氨基-苯并[a]吩噁嗪-5-酮。最后的步驟相當(dāng)于方案1的最后的步驟。
可以按照以下方案2的方法制備結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成香豆素環(huán)方案2
按照上述的方案2，在有化合物(8)的情況下氧化和氯化適量的對苯二胺衍生物(7)，以便按照Willstaetter和Mayer(1904，Chem.Ber.371498)的方法獲得N，N’-二氯-對苯醌二亞胺(9)，從而制備結(jié)構(gòu)式(I)化合物，結(jié)構(gòu)式(I)化合物中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成香豆素環(huán)，并且，如結(jié)構(gòu)式(I)化合物的一般定義表示，R6是氫原子。后者化合物隨后在醇溶液與5，7-二羥基香豆素(10)反應(yīng)以便獲得適量的7-氨基-1，2-吡喃酮基吩噁嗪-3-酮(11)。最后的步驟相當(dāng)于方案1的最后步驟。
用上述方法無疑可以制備結(jié)構(gòu)式(Ib)的化合物，它是結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成香豆素環(huán)。
按照以下方案3所示的方法可以制備結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)方案3
按照上述的方案3，根據(jù)Fischer & Hepp(參考文獻(xiàn)36.2，1807，1903)的方法，適量的2-萘酚(12)與適量的4-硝基苯酚(13)縮合以便產(chǎn)生適量的萘吩噁嗪酮(14)，從而可以制備結(jié)構(gòu)式(I)化合物，在結(jié)構(gòu)式(I)化合物中R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)。后者化合物(14)按照Kehrman & Gottrau(參考文獻(xiàn)38，2574，1905)的方法隨后與鹽酸羥胺(15)反應(yīng)以便獲得羥基亞胺和氨基酮(分別是化合物16和17)。最后的步驟相當(dāng)于方案1的最后的步驟。
采用上述方法無疑可以制備結(jié)構(gòu)式(Ic)的化合物，它是R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)的結(jié)構(gòu)式(I)化合物。
最終，按照以下方案4所示方法可以制備本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式(I)化合物，其中R1/R2和R3/R4基分別與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)(結(jié)構(gòu)式(Id)的化合物)方案4
按照上述的方案4，通過適量的1-氨基-2-萘酚-4磺酸(18)與適量的2-羥基-1，4-萘醌(19)縮合以便生成適量的二萘磺酸噁嗪酮(20)，從而制備結(jié)構(gòu)式(I)化合物，其中R1/R2和R3/R4分別與它們連接的苯環(huán)組成萘環(huán)。此化合物(20)隨后在有銨的情況下加熱以便生成氨基二萘噁嗪酮(21)。此方法的最后步驟相當(dāng)于方案1的最后步驟。
上述方法中，起始反應(yīng)物(化合物(1)、(2)、(4)、(6)、(7)、(8)、(10)、(12)、(13)、(15)、(18)和(19))為市售，更詳細(xì)地說是來自Aldrich。
本發(fā)明的主題也是一種反應(yīng)介質(zhì)，它單獨(dú)使用至少一種如上定義的結(jié)構(gòu)式(I)的顯色酶底物或與至少一種不同于本發(fā)明底物所檢測的酶活性的其它特異性酶底物聯(lián)用。
實(shí)際上，當(dāng)表達(dá)肽酶活性的微生物接種到含本發(fā)明化合物的反應(yīng)介質(zhì)內(nèi)或表面時，出現(xiàn)的顯色不會在反應(yīng)介質(zhì)內(nèi)或表面擴(kuò)散，并因此聚集在菌落中。
術(shù)語″本發(fā)明的反應(yīng)介質(zhì)″是用來指能用于展示至少一種微生物的至少一種酶活性的介質(zhì)。
此反應(yīng)介質(zhì)可以僅用作顯色介質(zhì)或用作培養(yǎng)基和顯色介質(zhì)。在第一種情況下，在接種前培養(yǎng)微生物。而在第二種情況下，反應(yīng)介質(zhì)也構(gòu)成培養(yǎng)基，它組成本發(fā)明的具體實(shí)施方案。
該反應(yīng)介質(zhì)可以是固體、半固體或液體。術(shù)語″固體介質(zhì)″是用來指，例如，凝膠介質(zhì)。
瓊脂是在微生物學(xué)上適合培養(yǎng)微生物的常用固體介質(zhì)，但也有可能使用明膠或瓊脂糖。某些制品是市售的，諸如，Columbia瓊脂，Trypcase大豆瓊脂，Mac Conkey瓊脂，Sabouraud瓊脂或更通常的，Handbook of Microbiological Media(CRC Press)所述的那些。
優(yōu)選地，當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)也是培養(yǎng)基時，它為凝膠型，反應(yīng)介質(zhì)中瓊脂數(shù)量是2到40g/l，并優(yōu)選9到25g/l。
本發(fā)明的酶底物可以在寬泛的pH范圍內(nèi)被使用，更詳細(xì)地在pH5.5和10之間。
反應(yīng)介質(zhì)中本發(fā)明酶底物的濃度在0.025和0.40g/l之間，而且0.05g/l更好。這是因?yàn)樵诖说孜餄舛龋玫礁玫娘@色對比度。
反應(yīng)介質(zhì)可以包括至少一種不同于本發(fā)明底物所檢測的酶活性的其它特異性底物。其它底物的酶促水解產(chǎn)生不同于本發(fā)明底物所檢測信號的檢測信號，諸如，不同的顏色或熒光產(chǎn)物，以便證明例如檢測和/或鑒別和/或定量一種或多種微生物。
作為其它特異性底物，可以提及3-吲哚氧基型底物，例如5-溴-4-氯-3-羥基吲哚-β-D-葡萄糖苷(Biosynth)或5-溴-6-氯-3-羥基吲哚-β-D-半乳糖苷(Biosynth)或所有用于微生物檢測的其他底物。
其它特異性酶底物的濃度通常在0.01和2g/l之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能容易地根據(jù)使用的底物確定上述的濃度。
反應(yīng)介質(zhì)還可以包括一或多種其它成份，例如氨基酸，胨，碳水化合物，核苷酸，礦物質(zhì)，維生素，抗生素，表面活性劑，緩沖劑，磷酸鹽，銨鹽，鈉鹽或金屬鹽。介質(zhì)的實(shí)例如申請人的專利申請EP656421和WO99/09207所述。
因此本發(fā)明的酶底物和反應(yīng)介質(zhì)被用于診斷有肽酶活性的微生物。
因此，本發(fā)明的主題也是結(jié)構(gòu)式(I)的顯色酶底物或如上述定義的反應(yīng)介質(zhì)用于檢測和/或鑒別和/或定量表達(dá)至少一種肽酶活性的微生物的應(yīng)用。
該發(fā)明也涉及一種用于檢測和/或鑒別和/或定量表達(dá)至少一種肽酶活性的微生物的方法，特征在于該方法包含下列步驟·提供如上述定義的反應(yīng)介質(zhì)，·用待測生物樣品接種該介質(zhì)，·使其孵育，和·顯示至少一種肽酶活性的單獨(dú)存在或與至少一種不同于前述肽酶活性的其他酶活性的組合存在。
接種和孵育步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
例如，孵育溫度是37℃。至于孵育環(huán)境，厭氧或有氧都一樣。然而，優(yōu)選在需氧條件下進(jìn)行孵育，因?yàn)檫@能增加酶活性。
肉眼觀察到可見的顯色變化不在反應(yīng)介質(zhì)中擴(kuò)散，并因此聚集在菌落中。
作為利用本發(fā)明酶底物可被檢出的微生物的例子，可以提及革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陽性細(xì)菌和酵母。
作為革蘭氏陰性細(xì)菌，可以提及下列細(xì)菌屬假單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、變形菌屬、彎曲桿菌屬、嗜血菌屬、摩根氏菌屬、弧菌、耶爾森氏菌屬、不動桿菌屬、布蘭漢氏球菌屬、奈瑟氏球菌屬、伯克氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、哈夫尼菌屬、愛德華氏菌屬和軍團(tuán)菌屬。
作為革蘭氏陽性細(xì)菌，可以提及下列屬細(xì)菌腸球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、李斯特菌屬、梭菌屬、分枝桿菌屬和棒狀桿菌屬。
酵母的實(shí)例包括下列酵母屬假絲酵母、隱球酵母屬、糖酵母屬和絲孢酵母屬。
被分析的生物樣品是任何臨床樣品，例如唾液，血液，尿或大便樣品或其他可以有助臨床醫(yī)生進(jìn)一步診斷的任何樣品。樣品也可以是源自食物和/或制藥工業(yè)的產(chǎn)品或基礎(chǔ)產(chǎn)品，在該產(chǎn)品中有必要保證無致病微生物或統(tǒng)計污染菌群或者檢測特定微生物。
A為丙氨酸的本發(fā)明顯色底物具有下列優(yōu)點(diǎn)，即它們有可能將革蘭氏陰性細(xì)菌與革蘭氏陽性細(xì)菌區(qū)別開。
因此，本發(fā)明的另一個主題由一種在細(xì)菌中區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的方法組成，特征在于該方法包含下列步驟·提供一種如上述定義的反應(yīng)介質(zhì)，并且其中顯色底物的取代基A是丙氨酸，·用待測生物樣品接種所述介質(zhì)，·進(jìn)行孵育，和·顯示代表一種革蘭氏陰性菌或幾種革蘭氏陰性菌的至少一種顯色的存在。
至于A是脯氨酸的顯色底物，它們有下列優(yōu)點(diǎn)，即它們有可能區(qū)別白色假絲酵母(Candida albican)以及熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和Candida glabrata。
因此，本發(fā)明的另一個主題涉及一種區(qū)分白色假絲酵母物種與熱帶假絲酵母和Candida glabrata的方法，特征在于該方法包含下列步驟·提供一種如上述定義的反應(yīng)介質(zhì)，并且其中顯色底物的取代基A是脯氨酸，·用待測生物樣品接種所述介質(zhì)，·進(jìn)行孵育，并顯示代表白色假絲酵母物種的酵母的存在的至少一種顯色的存在。
利用非限制說明給出的下列實(shí)施例，可以更清楚地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1合成9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮(R3＝R4＝R5＝H的化合物(5))1.12-亞硝基-5-對乙酰氨基酚的制備
9g的3-乙酰氨基酚(Aldrich)溶于含2.8g氫氧化鈉的水溶液(100ml)。使用冰-鹽浴冷卻溶液到-3℃并加入5g亞硝酸鈉的水溶液(12ml)。
使用分液漏斗加入用等量水(25ml)稀釋的磷酸溶液到所述攪拌的溶液中。以某一速率進(jìn)行這樣的添加以便溫度保持在0℃或低于此溫度。然后生成紅-褐色沉淀物。在進(jìn)一步劇烈攪拌一小時后，測定pH以便確保完全酸性(pH＜2)。
過濾由此所獲得的粘稠懸浮液并用冷水小心地洗滌殘留物以便除去過量的酸和鹽。在適當(dāng)抽氣后，在真空干燥器中干燥殘余物。以68.6％的得率獲得7.36g的2-亞硝基-5-乙酰氨基酚。
1.29-乙酰氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制備在上述1.1中得到的1.8g粗產(chǎn)物和1.6g 1，3-二羥基萘(Aldrich)溶解在50ml丁基-1-醇中同時攪拌并加熱到70℃。逐滴加入1g濃硫酸到加熱的溶液并繼續(xù)加熱到90℃。在30分鐘后，讓混合物冷卻。抽濾除去固相并用少量乙醇完成洗滌。干燥后，以76％的得率獲得標(biāo)題化合物。
在硅膠板上使用醋酸乙酯/甲苯(3∶1)作流動相對所得產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜分析。得到淺橙黃色斑點(diǎn)(Rf＝0.8)。
1.39-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制備上述1.2中所得的1.5g化合物溶解在最少量體積的硫酸和水(1∶1)中，同時攪拌并加熱到100℃直到取樣并在水中稀釋為止，然后在乙酸乙酯中提取，通過薄層色譜法顯示沒有任何起始產(chǎn)物。攪拌由此所得的深色溶液并加熱到沸點(diǎn)若干分鐘，然后冷卻并倒入冰-水浴(300ml)中。沉淀物被研碎，然后進(jìn)行加熱到40℃并將產(chǎn)物靜置過夜。通過沉降讓上清液分離，然后過濾產(chǎn)物的懸浮液并用水洗滌。干燥后，以78％的得率獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
實(shí)施例29-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的氨基?；?結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中R1/R2組成萘環(huán)，R3＝R4＝R5＝R6＝H，A＝氨基酸和X＝N-t-BOC)將實(shí)施例1中所得0.52g(2mmol)相關(guān)的氨基化合物溶解在15ml二甲基甲酰胺(高效液相色譜質(zhì)量)同時加熱，然后溶于10ml的四氫呋喃中。在三頸燒瓶中使用氫氣(由硼氫化鈉/醋酸產(chǎn)生)以及0.1g的10％披鈀碳作催化劑氫化此溶液。暗紫色被出現(xiàn)的綠色熒光所取代。繼續(xù)氫化30分鐘，封閉燒瓶并靜置過夜。
3mmol氨基酸保護(hù)的N-tBOC溶解在10ml的無水四氫呋喃中并冷卻產(chǎn)物到-12℃(冰/鹽浴)。加入0.33g(3.3mmol)的N-甲基嗎啉到所述冷卻的溶液中，然后在-12℃和-9℃之間緩緩加入0.42g(3.1mmol)的氯甲酸異丁酯。5分鐘后，將上述的混合酸酐反應(yīng)混合物倒入還原胺的攪拌溶液，預(yù)先冷卻混合物到至少-5℃，同時導(dǎo)入氫氣以防止再氧化。10分鐘后，封閉燒瓶并在室溫再攪拌內(nèi)容物5小時。
過濾反應(yīng)混合物并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑(四氫呋喃)。將DMF溶液倒入充分?jǐn)嚢璧乃?冰混合物，濾過沉淀物，用水洗滌并自然干燥。粗產(chǎn)物溶解在二氯甲烷(DCM)中并用稀釋(0.2M)的氫氧化鈉洗滌，再用水洗滌。用硫酸鎂干燥后，除去溶劑。
在某些情況下，經(jīng)硅膠漏斗過濾DCM提取物以除去易被薄層色層分析法檢測出的微量原料。
在此實(shí)施例中獲得的化合物能以下列方法被去保護(hù)產(chǎn)物溶解在少量乙酸乙酯中并用相同量的氯化氫飽和的乙酸乙酯攪拌1小時。加入過量的無水醚，鹽酸鹽沉淀物被迅速濾過，然后用另外的醚或醚/礦物香精洗滌，并隨后在真空中干燥。
實(shí)施例39-氨基-6-乙氧羰基(carbethoxy)苯并[a]吩噁嗪-5-酮的合成(結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R1/R2組成萘和R3＝R4＝R5＝H和R6＝-C(O)OR’，所含R’＝C2H5)3.1 乙基1，3-二羥萘甲酸酯的制備按照Meyer和Bloch(Org.Synth.Coll.，Vol 3，p 132)所述的方法由丙二酸二乙酯和苯乙酰氯制備此化合物。
3.2 9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制備1.8g(10mmol)的2-亞硝基-5-乙酰氨基酚和2.08g(9mmol)的乙基1，3-二羥萘甲酸酯溶解在60ml的丁醇，同時加熱并在70℃攪拌混合物。逐滴加入濃硫酸并逐漸加熱溶液到大約90℃。在30分鐘后，讓反應(yīng)混合物冷卻并在5℃保留過夜。
抽濾除去紅色產(chǎn)物并用少量乙醇洗滌。
干燥后，以65％的得率獲得9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮。
3.3 9-氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制備在3.2中獲得的9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮溶解在硫酸(3ml)和乙醇(3ml)的混合物中。在同時逐步加入水(1ml)的時候加熱該混合物到80℃。迅速顯現(xiàn)胺的特征紫色。繼續(xù)水解直到樣品被水稀釋為止，然后在乙酸乙酯中提取，通過薄層色層分析法顯示沒有任何9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮。
將反應(yīng)混合物倒入150ml的冰凍水，通過抽濾收集產(chǎn)物，然后用水洗滌并干燥。以85％的得率獲得該產(chǎn)物。
實(shí)施例49-氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的氨基?；捎萌鐚?shí)施例2所述的方法，使用實(shí)施例3中獲得的產(chǎn)物并使用適量的被N-t-Boc保護(hù)的氨基酸。
對于胺化化合物的去保護(hù)，它被溶解在2ml的三氟乙酸中，接著用醚沉淀。通過薄層色譜法由此獲得均勻橙色粉末形式的產(chǎn)物。
實(shí)施例59-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的合成(結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R1/R2組成萘，R3＝R4＝R5＝H和R6＝Cl)5.1 9-硝基-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制備加入1.54g(10mmol)的95％純2-氨基硝基苯酚(Aldrich)到2.26g(10mmol)的2，3-二氯-1，4-萘醌(Fluka)的乙醇懸浮液，預(yù)先加熱到沸點(diǎn)，然后冷卻到25℃。攪拌混合物并加入1g無水醋酸鈉。若干小時后，生成桔褐色沉淀物。連續(xù)攪拌24小時后，固體被抽濾分離，干燥，然后從熱乙酸中重結(jié)晶(得率65％)。
5.2 9-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制備130mg(1mmol)的乙酰丙酮酸二價銅鹽，懸浮在10ml的乙醇中，與0.18g(5mmol)的氫化硼鈉在室溫下攪拌直到來源于此催化作用的褐色化合物生成為止(大約10分鐘)。上述5.1中獲得的1.29g(4mmol)化合物，在10ml的正丙醇中以懸浮液的形式被加入此混合物，接著加入0.37g(10mmol)的氫化硼鈉。該混合物在30℃攪拌3小時。
冷卻后，反應(yīng)混合物被倒入冰/水混合物，然后通過過濾回收粗產(chǎn)物并干燥。它被溶解在熱的正丁醇中并被過濾以便除去含銅的產(chǎn)物，從而得到純化。濃縮后，使標(biāo)題化合物結(jié)晶以產(chǎn)生0.68g的產(chǎn)物。
實(shí)施例69-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的氨基?；捎萌鐚?shí)施例2所述的方法，使用實(shí)施例5中獲得的產(chǎn)物和適量由N-t-Boc保護(hù)的氨基酸。
對于胺化化合物的去保護(hù)，也可以采用如實(shí)施例2所述的方法。
實(shí)施例75-氨基苯并[a]吩噁嗪-9-酮的合成(結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R3/R4組成萘和R1＝R2＝R5＝R6＝R9＝H)7.1萘吩噁嗪酮的制備使用Fisher & Hepp(上文)的方法無須顯著的調(diào)整，4-亞硝基苯酚和2-萘酚在冰醋酸中使用氯化鋅作縮合劑進(jìn)行縮合。
粗產(chǎn)物從熱的甲苯/礦物香精中以25％的得率再結(jié)晶。
這里所用的4-亞硝基苯酚是從Fluka獲得的市售產(chǎn)品被用下列方式改造此產(chǎn)物溶解在乙醚中，經(jīng)Phase-Sep紙過濾并與Norite攪拌一小時，從而得到純化。過濾后，醚溶液被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減少體積，然后冷卻以便獲得純亞硝基苯酚的結(jié)晶產(chǎn)物。
7.2胺產(chǎn)物的制備按照Kehrmann & Gottrau(上面)的方法，用200ml的純乙醇混合以上7.1中所得的3g萘吩噁嗪酮和3.0g鹽酸羥胺，并將混合物逐漸加熱到沸點(diǎn)。萘吩噁嗪酮的紅色逐漸被橙色取代而且出現(xiàn)堿的鹽酸鹽沉淀。濾過除去沉淀物，用少量乙醇洗滌，然后干燥以獲得得率63％的鹽酸鹽。
由此所得的1g鹽與水加熱被分解，然后通過冷卻以便產(chǎn)生游離堿的綠色殘余物。產(chǎn)物被濾過，在40℃溶解在幾ml的乙醇中，同時加入足量的HCl用于溶解。熒光紫-紅溶液與足量的無水醋酸鈉加熱產(chǎn)生游離基(free base)(暗綠色的金屬針狀)。濾過產(chǎn)物，用熱水洗滌，并干燥以獲得97％的得率。
實(shí)施例87-氨基-1，2-(3’，4’-環(huán)戊烯-2’吡喃酮基)-吩噁嗪-3-酮的合成(結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R1/R2組成香豆素，R7和R8與它們連接的兩個碳原子一起組成環(huán)戊烯，R3＝R4＝R5＝R6＝H)8.15，7-二羥-3，4-環(huán)戊烯香豆素的制備3.02g(24mmol)的間苯三酚和3.12g(20mmol)的乙基2-氧環(huán)戊烷羧酸酯在小燒瓶中用少量乙醇一起混合。冷卻后，30ml的硫酸/水混合物(75％w/w)加入到攪拌的混合物中。在室溫下繼續(xù)攪拌48小時。將半固體產(chǎn)物倒入完全攪勻的冰/水混合物并進(jìn)行過濾。用水完全洗滌殘余物，抽干，然后自然干燥。
從乙醇中再結(jié)晶產(chǎn)生薄層層析均勻的產(chǎn)物。產(chǎn)量是2.8g。
8.2標(biāo)題化合物的制備在以上8.1中得到的2.18g(10mmol)5，7-二羥-3，4-環(huán)戊烯香豆素溶解在40ml的熱乙醇中，而且加入1.74g(10ml)的1，4-二氯-對苯醌二亞胺到攪拌的溶液。讓反應(yīng)混合物在水浴鍋上緩慢回流幾分鐘，在此時間內(nèi)液體變成深紫色。進(jìn)一步回流20分鐘后，將反應(yīng)混合物倒入250ml含2g醋酸鹽的冰/水混合物。顯色物以深藍(lán)色沉淀物的形式被分離。通過抽濾除去由此所得的沉淀物，然后用水洗滌。干燥產(chǎn)物(1.5g)可以從乙酸和正丁醇再結(jié)晶。
實(shí)施例97-氨基-1，2-(4’-甲基-2’-吡喃酮基)吩噁嗪-3-酮的合成(結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R1/R2組成香豆素，R8是甲基，R7＝R3＝R4＝R5＝R6＝H)9.15，7-二羥-4-甲基香豆素的制備2.77g(22mmol)的間苯三酚和2.6g(20mmol)乙酰醋酸乙酯的混合物被一起熔融，冷卻混合物，然后迅速加入40ml硫酸/水的混合物(75％w/w)到該半固體物質(zhì)。攪拌混合物24小時，其間生成半固體物質(zhì)。將它倒入含5g醋酸鈉的冰/水混合物(300ml)，通過抽濾回收沉淀物。
反復(fù)用水洗滌并干燥后，粗產(chǎn)物從熱乙醇再結(jié)晶以產(chǎn)生3.05g的香豆素。
9.27-氨基-1，2-(4’-甲基-2’-吡喃酮基)吩噁嗪-3-酮的制備1.92g(10mmol)的5，7-二羥-4-甲基香豆素溶解在50ml的無水甲醇。將7.5g(0.125mol)的尿素加入到攪勻的熱溶液中以便減少放熱并減少產(chǎn)物的氯化。加入1.74g(10mmol)的1，4-二氯苯醌二亞胺到已經(jīng)攪拌回流24小時的反應(yīng)混合物。
將暗紫色溶液倒入完全攪勻的含10g醋酸鈉的冰/水混合物。通過真空過濾除去暗紫色沉淀物并進(jìn)行干燥。在加熱到50℃的200ml甲醇中通過懸浮純化該粗產(chǎn)物，同時逐步加入到完全攪勻的溶液，該溶液在20ml的水中含5g連二亞硫酸鈉和5g碳酸鈉。生成黃褐色沉淀物。
迅速過濾反應(yīng)混合物以便分離二氫形式的顯色沉淀物。用含少量連二亞硫酸鈉的水/冰混合物將其洗滌，由此濕潤的沉淀物被轉(zhuǎn)移到100ml的甲醇中。迅速攪勻的溶液被加熱到40℃，然后逐漸地加入水，從而使無色的顯色物(二氫形式)再氧化成為可能，并得到略呈暗紫色-褐色的沉淀物。最終，加入100ml的水以便終止顯色物的氧化和沉淀，它在濾過除去后被干燥。薄層層析法僅顯示單一的紫色化合物和微量的該化合物的二氫形式。
實(shí)施例107-氨基-1，2-(3’-羧乙基-4’-甲基-2’-吡喃酮基)吩噁嗪-3-酮的合成(結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R1/R2組成香豆素，R7＝羧乙基，R8＝甲基和R3＝R4＝R5＝R6＝H)10.1乙基5，7-二羥-4-甲基香豆素-3-丙酸酯的制備2.77g(22mmol)的間苯三酚和4.60g(20mmol)的二乙基乙酰戊二酸酯一起混合，冷卻，并與35ml的75％w/w硫酸/水混合物攪拌。繼續(xù)攪拌48小時。通過倒入攪勻的冰/水混合物并進(jìn)行抽濾來分離產(chǎn)物。用水徹底洗滌殘余物并自然干燥。
通過懸浮在乙醇中并與氫氧化鉀水溶液(3摩爾當(dāng)量)攪拌將產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化成游離酸。4小時后，加入pH2的2M鹽酸沉淀酸。抽濾除去大量的沉淀物，用水洗滌并抽干。自然干燥后，得到總量3.8g的目標(biāo)產(chǎn)物。
10.2標(biāo)題化合物的制備如實(shí)施例8.1使用1，4-二氯-對苯醌二亞胺和上述10.1中得到的酸制備所述化合物。反應(yīng)混合物倒入冰/水混合物，加入鹽酸直到獲得pH 2，以便確保顯色物的游離羧酸形式完全沉淀。所得干燥產(chǎn)物總量是2.2g。
實(shí)施例11表達(dá)亮氨酸-肽酶活性的微生物的檢測11.1檢測介質(zhì)的制備混合1.4g的biogelytone(bioMérieux)，0.84g的肉提取物(bioMérieux)，2.24g NaCl(Merck)，280μl的IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷，BIOSYNTH)水溶液(濃度10g/l)和4.2g歐洲瓊脂(bioMérieux)制備檢測介質(zhì)。
實(shí)施例2中所獲得的本發(fā)明的底物，其中氨基酸是亮氨酸(亮氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或亮氨酸-ABP)，或者現(xiàn)有技術(shù)的底物亮氨酸-氨基甲基香豆素(亮氨酸-AMC，BACHEM)，以下列方式被加入280ml滲透性水加入到介質(zhì)，混合物溶解在100℃的水浴鍋中。混合物在121℃高壓滅菌15分鐘并在水浴鍋中冷卻到50℃。
然后按照下面表1顯示的濃度加入溶解在二甲基亞砜(Merck)的底物表1
該介質(zhì)然后倒入培養(yǎng)皿中。
11.2微生物菌株的接種申請人收集的10個微生物菌株懸浮在生理鹽水中，被接種在每個介質(zhì)的菌落中。培養(yǎng)皿在37℃孵育48小時。所生成的菌落在孵育24和48小時后肉眼檢查。記錄這些菌落的顯色，擴(kuò)散以及顯色強(qiáng)度。
11.3結(jié)果結(jié)果可以表示為使用0到4為基礎(chǔ)的人為標(biāo)度范圍的顯色強(qiáng)度，擴(kuò)散時也使用從0到4作為基礎(chǔ)的人為標(biāo)度。下面表2給出這些結(jié)果，其中-Ta相當(dāng)于孵育時間，Cb相當(dāng)于毫米為單位的生長直徑，Ic相當(dāng)于顯色亮度，Cod相當(dāng)于菌落顏色和De相當(dāng)于擴(kuò)散，-B相當(dāng)于熒光藍(lán)和R相當(dāng)于粉紅色表2
以上表1和2所示結(jié)果表明本發(fā)明的顯色酶底物顯然可以檢測表達(dá)亮氨酸-肽酶活性的微生物，和現(xiàn)有技術(shù)的底物相比，在菌落周圍觀察到極其少量的擴(kuò)散。
實(shí)施例12表達(dá)脯氨酰-肽酶活性的微生物的檢測12.1檢測介質(zhì)的制備混合1.68g酵母提取物(bioMérieux)，1.4g biocase(bioMérieux)，1.26g麥芽提取物(bioMérieux)，0.08g葡萄糖(Merck)和3.92g瓊脂(bioMérieux)制備檢測介質(zhì)。
280ml滲透性水加入到粉末，然后混合物溶解在100℃的水浴鍋中。產(chǎn)物分離到兩個燒瓶，每個140ml。在121℃進(jìn)行高壓滅菌15分鐘，然后產(chǎn)物在水浴鍋中冷卻到50℃。
L-脯氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素(Pro-AMC，Bachem)加入到第一個燒瓶作對照，然后加入L-脯氨酰-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮(Pro-ABP，實(shí)施例2中所得的本發(fā)明底物，其中氨基酸是L-脯氨酸)到第二個燒瓶，最終濃度為50mg/l。
12.2微生物菌株的接種申請人采集的9個微生物菌株懸浮在生理鹽水中，被接種在每個介質(zhì)的菌落中。培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)24和48小時后肉眼檢查所生成的菌落。記錄菌落的大小，它們的顯色以及顯色亮度。
12.3結(jié)果按照段落11.3中所述規(guī)則和術(shù)語在以下表3表示結(jié)果。
表3用現(xiàn)有技術(shù)的Pro-AMC底物和本發(fā)明的Pro-ABP檢測微生物的脯氨酰-肽酶活性
以上表格所示結(jié)果表明本發(fā)明的顯色酶底物顯然可以檢測表達(dá)脯氨酰-肽酶活性的微生物，并更詳細(xì)地是區(qū)分白色假絲酵母物種與熱帶假絲酵母和Candida glabrata物種。
實(shí)施例13表達(dá)丙氨酰-肽酶活性的微生物的檢測
13.1檢測介質(zhì)的制備混合3.6g biogelytone(bioMérieux)，2.16g肉提取物(bioMérieux)1.26g麥芽提取物(bioMérieux)，5.76g NaCl(Merck)和10.8g瓊脂(bioMérieux)制備檢測介質(zhì)。
720ml滲透性水加入到粉末，然后混合物溶解在50℃的水浴鍋中。產(chǎn)物分離到兩個燒瓶，每個360ml。在121℃進(jìn)行高壓滅菌15分鐘，并在水浴鍋中將產(chǎn)物冷卻到100℃。
L-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素(Ala-AMC，Bachem)加入到第一個燒瓶作為對照，最終濃度為50mg/l，然后將L-丙氨酰-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮(Ala-ABP，實(shí)施例2中所獲得的本發(fā)明底物，其中氨基酸是L-丙氨酸)，加入到第二個燒瓶，最終濃度為25mg/l。
13.2微生物菌株的接種申請人采集的二十五個微生物菌株懸浮在生理鹽水中，被接種在每個介質(zhì)的菌落中。培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)24和48小時后肉眼檢查所生成的菌落。記錄菌落的尺寸，它們的顯色以及顯色亮度。
13.3結(jié)果按照段落11.3中所述規(guī)則和術(shù)語在以下表4表示結(jié)果。
表4用現(xiàn)有技術(shù)的Ala-AMC底物和本發(fā)明的Ala-ABP檢測微生物的丙氨酰-肽酶活性
以上表格所示結(jié)果表明本發(fā)明的顯色酶底物顯然可以檢測表達(dá)丙氨酰-肽酶活性的微生物，更詳細(xì)地是區(qū)分革蘭氏陰性細(xì)菌(表達(dá)活性)和革蘭氏陽性細(xì)菌(不表達(dá)活性)。
實(shí)施例14表達(dá)β-丙氨酸肽酶活性的微生物的檢測14.1檢測介質(zhì)的制備300ml Columbia介質(zhì)熔解在100℃的水浴鍋中并在121℃高壓滅菌15分鐘。然后產(chǎn)物在水浴鍋中冷卻到50℃。
介質(zhì)被分離到100ml的三個燒瓶，然后在50℃作為底物加入實(shí)施例4和6的那些底物，其中氨基酸是β-丙氨酸(分別為β-丙氨酸-9-氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或β-Ala-ACAP和β-丙氨酸-9-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮或β-Ala-ACHP)，按照以下表5所示濃度溶解在二甲基亞砜中。
表5
然后介質(zhì)倒入培養(yǎng)皿。
14.2微生物菌株的接種申請人采集的九個微生物菌株懸浮在生理鹽水中，按照以100000cfu/spot的比例多點(diǎn)接種，被接種在以上14.1制備的介質(zhì)上。培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)24和48小時后肉眼檢查所生成的菌落(每菌株一個菌落)。
14.3結(jié)果按照段落11.3中所述規(guī)則和術(shù)語在以下表6表示結(jié)果，其中RP表示淺桃紅。
表6
以上表格所示結(jié)果表明本發(fā)明的顯色酶底物顯然能檢測特異于銅綠假單胞菌的β-丙氨酸肽酶活性，所有其它菌株用這些底物顯示酶活性是陰性的。
實(shí)施例15使用A最少為兩個氨基酸的底物檢測表達(dá)丙氨酸肽酶活性的微生物15.1 檢測介質(zhì)的制備1000ml的Columbia介質(zhì)熔解在100℃的水浴鍋中，并在121℃高壓滅菌15分鐘。然后它在水浴鍋中冷卻到50℃。
此介質(zhì)分離到5個200ml的燒瓶中，在50℃作為底物加入實(shí)施例2中的底物，其中A是-介質(zhì)1L-丙氨酸(L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或A-ABP)-介質(zhì)2L-丙氨酸-L-丙氨酸(L-丙氨酸-L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或AA-ABP)，-介質(zhì)3L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-丙氨酸(L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或AAA-ABP)，-介質(zhì)4L-丙氨酸-甘氨酸，(L-丙氨酸-甘氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或AG-ABP)，和-介質(zhì)5甘氨酸-L-丙氨酸(甘氨酸--L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或GA-ABP)，每個底物溶解在DMSO中并以50mg/l的最終濃度使用。
然后介質(zhì)倒入培養(yǎng)皿。
15.2 微生物菌株的接種申請人采集的九個微生物菌株懸浮在生理鹽水中，按照以15000cfu/spot的比例多點(diǎn)接種，被接種在以上15.1制備的介質(zhì)上。培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)24和48小時后肉眼檢查所生成的菌落。
15.3結(jié)果按照段落11.3中所述規(guī)則和術(shù)語在以下表7和8表示結(jié)果，其中R＝粉紅色，RP＝淺桃紅和I＝無色。
表7
表8
以上表7和8所示結(jié)果表明，無論本發(fā)明的顯色酶底物的氨基酸鏈長度如何，都有可能檢測出具有丙氨酸肽酶活性的微生物菌株的酶表達(dá)。另外，由于氨基酸的本性和數(shù)量，根據(jù)研究中的菌株有可能改變用于檢測所述菌株的底物的特異性和靈敏度或毒性。
實(shí)施例16通過結(jié)組本發(fā)明底物和現(xiàn)有技術(shù)底物檢測微生物16.1檢測介質(zhì)的制備混合3.3g的酵母提取物、2.75g的Biocase、2.475g的麥芽提取物、0.165g的葡萄糖和7.7g的瓊脂并加入550ml的滲透性水。
混合物熔解在100℃的水浴鍋中并在121℃高壓滅菌15分鐘。然后在水浴鍋中冷卻到50℃。
在實(shí)施例2中所制備的本發(fā)明底物(其中氨基酸是脯氨酸)按0.05g/l的比例加入，同時按0.05g/l的比例加入作為現(xiàn)有技術(shù)的其它底物的5-溴-4-氨-3-羥基吲哚-β-D-葡萄糖苷。
然后介質(zhì)倒入培養(yǎng)皿。
16.2微生物菌株的接種申請人采集的十二個微生物菌株懸浮在生理鹽水中，被接種在上述16.1所制備介質(zhì)中。培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)24和48小時后肉眼檢查所生成的菌落。
16.3結(jié)果下面表9所示結(jié)果表示以mm為單位的生長尺寸，活性和顏色，Ta表示培養(yǎng)時間，R＝粉紅色，O＝橙色，V＝綠色，T＝青綠色，M＝褐色，GO＝橙灰色和GV＝灰綠色。
表9
以上表9所示的結(jié)果表明可以清楚地觀察到由菌株顯現(xiàn)的酶活性顯色特性，如下-在菌株僅具有脯氨酸肽酶活性的情況，由本發(fā)明底物的水解作用引起粉紅色到橙色的顯色(大腸桿菌、摩氏摩根氏菌、鮑氏不動桿菌、蜂房哈夫尼菌、遲鈍愛德華氏菌和白色假絲酵母)，-在菌株僅具有β-葡糖苷酶活性的情況，由現(xiàn)有技術(shù)底物的水解作用引起青綠色的顯色(松鼠葡萄球菌、糞腸球菌)和-對于具有兩種酶活性的菌株為綠色到褐色的顯色，源自2種顯色粉紅色/橙色和青綠色的混合(粘質(zhì)沙雷氏菌，液化沙雷氏菌，肺炎克雷伯氏菌，銅綠假單胞菌和無害李斯特氏菌)。
因此，根據(jù)其代謝作用，有可能檢測出每種菌株特有的一些不同酶活性。
權(quán)利要求
1.一種顯色酶底物，其特征在于其符合下列式(I) 其中-R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成下式的萘環(huán) 或下式的任選取代的香豆素環(huán) -或者R1和R2各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺?；?R3和R4與它們連接的苯環(huán)組成下式的任選取代的萘環(huán) -或者，R3和R4各自獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或氨磺?；?，應(yīng)當(dāng)理解(i)R1/R2和R3/R4中至少之一與其連接的苯環(huán)組成如上所述任選取代的萘環(huán)或香豆素環(huán)，和(ii)當(dāng)R1和R2與它們連接的苯環(huán)組成任選取代的香豆素環(huán)時，R3和R4與它們連接的苯環(huán)不組成任選取代的萘環(huán)，-R5和R6各自獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基或C1-C6烷基，應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)R1/R2和R3/R4與它們連接的苯環(huán)分別組成萘環(huán)時，R6表示鹵素原子，-R7和R8各自獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧烷基，羧基或磺酸基，-或者R7和R8一起與它們連接的兩個碳原子組成C4-C6環(huán)，-R9表示氫原子，溴原子，氯原子，苯甲酰基，-CO2H基或-SO3H基，應(yīng)當(dāng)理解，如果R9不是氫原子，那么R5是氫原子，-R’表示氫原子或C1-C6烷基，-R”表示氫原子或C1-C6烷基，-或者R，和R”一起與它們連接的氮原子組成含一個或多個雜原子的雜環(huán)，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或無。
2.如權(quán)利要求1所述的顯色酶底物，其特征在于R1/R2和R3/R4之中有且只有一個與它連接的苯環(huán)組成如權(quán)利要求1所定義的被任選取代的萘或香豆素環(huán)。
3.如權(quán)利要求2所述的顯色酶底物，其特征在于它符合下列式(Ia) 其中R5，R6，A和X如權(quán)利要求1所定義。
4.如權(quán)利要求3所述的顯色酶底物，其特征在于R5表示氫原子，R6表示氫原子或鹵素原子，A是選自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端劑或無。
5.如權(quán)利要求2所述的顯色酶底物，其特征在于它符合下列式(Ib) 其中R5，R7，R8，A和X如權(quán)利要求1所定義。
6.如權(quán)利要求5所述的顯色酶底物，其特征在于R5是氫原子，R7和R8分別獨(dú)立地表示氫原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基或羧烷基，或R7和R8與它們連接的兩個碳原子一起構(gòu)成C4-C6環(huán)，A是選自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端劑或無。
7.如權(quán)利要求2所述的顯色酶底物，其特征在于它符合下列式(Ic) 其中R5，R6，R9，A和X如權(quán)利要求1所定義。
8.如權(quán)利要求7所述的顯色酶底物，其特征在于R5，R6和R9分別表示氫原子，A是選自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端劑或無。
9.如權(quán)利要求1所述的顯色酶底物，其特征在于它符合下列式(Id) 其中R5，R6，A和X如權(quán)利要求1所定義。
10.反應(yīng)介質(zhì)，其只使用權(quán)利要求1-9中任一項的至少一種顯色酶底物，或聯(lián)合使用至少一種其它的酶底物，所述其它的酶底物特異于與本發(fā)明底物所檢測的酶活性不同的酶活性。
11.如權(quán)利要求10所述的介質(zhì)，其特征在于它是一種培養(yǎng)基。
12.如權(quán)利要求10或11所述的介質(zhì)，其特征在于它是凝膠形式。
13.如權(quán)利要求1到9任一項所述的顯色酶底物，或如權(quán)利要求10到12任一項所述的反應(yīng)介質(zhì)用于檢測和/或鑒別和/或定量表達(dá)至少一種肽酶活性的微生物的用途。
14.一種用于檢測和/或鑒別和/或定量表達(dá)至少一種肽酶活性的微生物的方法，其特征在于該方法包含下列步驟·提供一種權(quán)利要求10到12任一項所述的反應(yīng)介質(zhì)，·用待測生物樣品接種所述介質(zhì)，·進(jìn)行孵育，和·顯示至少一種肽酶活性的單獨(dú)存在或與至少一種不同于所述肽酶活性的其他酶活性的組合存在。
15.一種在細(xì)菌中區(qū)分革蘭氏陽性微生物和革蘭氏陰性微生物的方法，特征在于該方法包含下列步驟·提供一種如權(quán)利要求10到12任一項所述的反應(yīng)介質(zhì)，其中顯色底物的取代基A是丙氨酸，·用待測生物樣品接種所述介質(zhì)，·進(jìn)行孵育，和·顯示至少一種代表一種革蘭氏陰性微生物或幾種革蘭氏陰性微生物的存在的顯色的存在。
16.一種區(qū)分白色假絲酵母物種與熱帶假絲酵母和Candidaglabrata物種的方法，特征在于該方法包含下列步驟·提供一種如權(quán)利要求10到12任一項所述的反應(yīng)介質(zhì)，其中顯色底物的取代基A是脯氨酸，·用待測生物樣品接種所述介質(zhì)，·進(jìn)行孵育，和·顯示至少一種代表白色假絲酵母物種存在的顯色的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有下列通式(I)的新酶底物，其中R
文檔編號C12Q1/37GK1788005SQ200480012876
公開日2006年6月14日 申請日期2004年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月13日
發(fā)明者A·詹姆斯, J·佩里, A·里格比, S·斯坦福斯 申請人:拜奧默里克斯公司