專利名稱：抗腸毒素c的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于單克隆抗體及其應(yīng)用，具體地說涉及抗腸毒素C2的特異性單克隆抗體，產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤，以及所述單克隆抗體在檢測腸毒素C2中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin，縮寫為SE)是金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物之一。它是一種可溶性蛋白質(zhì)，單一的多肽鏈，含有較多的賴氨酸、酪氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸等氨基酸，耐熱，經(jīng)100℃煮沸30分鐘不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響，故誤食污染腸毒素的食物后，在腸道作用于內(nèi)脂神經(jīng)受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產(chǎn)生急性胃腸炎癥狀。腸毒素SE含有A、B、C、D四種血清型(分別縮寫為SEA，SEB，SEC，SED)，其中腸毒素SEC又被分為C1、C2及C3三個(gè)血清型(分別縮寫為SEC1，SEC2，SEC3)。90年代開展了利用金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1、C2、D等作超級抗原用于癌癥治療方面的研究。因此無論是食品或是藥物都有檢測SEC2含量的需求。目前已有的檢測方法包括反向被動(dòng)膠乳凝集法(RPLA)和多抗法。反向被動(dòng)膠乳凝集法(RPLA)是半定量的方法，靠肉眼判斷凝集結(jié)果，難以做到客觀準(zhǔn)確。多抗法采用SEC免疫羊獲得多克隆抗體，用于檢測腸毒素C，其特異性和靈敏度較差。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種測定SEC2的、有較好特異性和靈敏度的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性抗SEC2的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種產(chǎn)生特異性抗腸毒素SEC2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性檢測SEC2的試劑盒。
本發(fā)明人經(jīng)過大量的研究探索，研究出一種免疫球蛋白，它是可特異性與腸毒素SEC2結(jié)合的單克隆抗體，利用該單克隆抗體與腸毒素SEC2的特異性結(jié)合，可以有效檢測腸毒素SEC2。
本發(fā)明提供一種免疫球蛋白，它是特異性抗腸毒素SEC2的單克隆抗體。
本發(fā)明提供一種產(chǎn)生特異性抗腸毒素SEC2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明的單克隆抗體識別腸毒素SEC2作為抗原，可通過本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生。
本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生識別腸毒素SEC2作為抗原的單克隆抗體，可通過經(jīng)腸毒素SEC2免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得。
本發(fā)明的雜交瘤可以用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生?？梢杂媚c毒素SEC2作為免疫原，免疫除了人以外的動(dòng)物，將該動(dòng)物的脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤，從其中選出產(chǎn)生識別腸毒素SEC2的單克隆抗體的雜交瘤，即可得到本發(fā)明的雜交瘤。
所述免疫原可以是腸毒素SEC2或任何含有腸毒素SEC2的免疫原，例如含有腸毒素SEC2的金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物原液，即金黃色葡萄球菌經(jīng)培養(yǎng)、除菌、過濾所得的代謝產(chǎn)物原液，也可以是金黃色葡萄球菌株CGMCC0165的代謝產(chǎn)物原液，或是從金黃色葡萄球菌經(jīng)培養(yǎng)、除菌、過濾所得的代謝產(chǎn)物原液中分離出的腸毒素SEC2。
所述的免疫可用本領(lǐng)域已知或常規(guī)的任何方法來免疫。所述動(dòng)物可以是山羊，綿羊，豚鼠、小鼠、大鼠和家兔，優(yōu)選小鼠。
所述脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞的分離可以按照已知或常規(guī)的方法進(jìn)行。所述的融合可以是本領(lǐng)域已知或常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù)。雜交瘤的篩選可以按照已知或常規(guī)的方法進(jìn)行。
本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞也可以按照以下方法得到將小鼠，用含有SEC2的免疫原，在四腳掌和皮下常規(guī)免疫，3至4周后重復(fù)免疫，2周后尾靜脈加強(qiáng)免疫一次，3至4天后取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法融合雜交瘤細(xì)胞以有限稀釋法克隆化；挑選出高滴度雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的單克隆抗體可通過本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生。從本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法，例如可以從培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤的組織培養(yǎng)液中獲得，也可以通過接種到小鼠體內(nèi)繁殖、從收集的腹水或血清中獲得。所述培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤可以按照本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行。所述接種、收集腹水或血清、從腹水或血清中分離本發(fā)明的單克隆抗體的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法。
本發(fā)明提供的檢測腸毒素SEC2的方法是免疫測定法，其使用本發(fā)明的單克隆抗體，通過本發(fā)明單克隆抗體特異性地與腸毒素SEC2結(jié)合，來達(dá)到有效檢測腸毒素SEC2的目的。
本發(fā)明的免疫測定法包括本領(lǐng)域已知的免疫測定方法，例如酶免疫測定法(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、熒光免疫測定法(FIA)等。
用于所述免疫酶技術(shù)中的酶可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的酶，例如過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶等。所述酶可與本發(fā)明的單克隆抗體或腸毒素SEC2結(jié)合形成酶標(biāo)物。在所述免疫酶技術(shù)中與酶標(biāo)物作用并顯色的底物可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的底物。所述放免法中的標(biāo)記放射核素可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的放射核素，例如131I、125I、14C、3H等。所述熒光免疫法中的熒光物質(zhì)是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的熒光物質(zhì)。
單克隆的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體只針對抗原的一個(gè)表位，選擇針對不同表位的單克隆抗體運(yùn)用“雙抗夾心法”建立定量測定抗原含量的ELISA法，是本發(fā)明優(yōu)選的酶聯(lián)定量檢測法。
本發(fā)明提供一種檢測腸毒素SEC2的試劑盒，其含有本發(fā)明單克隆抗體免疫球蛋白或其活性片段。
所述試劑盒還可含有標(biāo)記腸毒素SEC2或本發(fā)明單克隆抗體的標(biāo)記物。所述標(biāo)記物可含有可標(biāo)記腸毒素SEC2或本發(fā)明單克隆抗體的酶、放射核素、熒光物質(zhì)或其他物質(zhì)。可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)或已知方法形成含腸毒素SEC2或本發(fā)明單克隆抗體的標(biāo)記物。所述含有腸毒素SEC2的標(biāo)記物可與本發(fā)明的免疫球蛋白單克隆抗體特異性地結(jié)合。所述含有本發(fā)明單克隆抗體的標(biāo)記物可與腸毒素SEC2特異性地結(jié)合。
所述試劑盒還可包括有固定腸毒素SEC2或本發(fā)明單克隆抗體的固相。所述固相可以是本領(lǐng)域通常使用的或已知的、適用于本發(fā)明方法的固相，例如聚合物，如聚苯乙烯，微量滴定板，免疫層析用濾紙等。
所述試劑盒還可包括為實(shí)施本發(fā)明的免疫測定法所需的其他常規(guī)物質(zhì)和/或器具。
本發(fā)明的方法可有效檢測腸毒素C2，并有很好的特異性和靈敏度。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的單抗ELISA法，與多抗法相比，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诋a(chǎn)品的質(zhì)量控制試驗(yàn)。


圖1是純化后本發(fā)明單克隆抗體的電泳圖，其中帶1是標(biāo)記Marker，帶a、b、c、及d分別是本發(fā)明單克隆抗體a、b、c、d。
圖2～5是采用競爭結(jié)合法進(jìn)行本發(fā)明單抗表位測定結(jié)果的示意圖，橫坐標(biāo)是未標(biāo)記抗體的濃度，縱坐標(biāo)是OD值。
圖6、7是不同含量SEC2的ELISA測定結(jié)果，橫坐標(biāo)是SEC2的濃度，縱坐標(biāo)是OD值。
圖8、9顯示了本發(fā)明單抗ELISA方法的靈敏度。
圖10是本發(fā)明單抗法與多抗法對比的散點(diǎn)對應(yīng)趨勢圖。
具體實(shí)施例方式
下面將通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是要對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對本發(fā)明內(nèi)容的技術(shù)特征所做的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1抗SEC2雜交瘤細(xì)胞的建立免疫8-12周齡的雌性BALB/c小鼠，以每只20μg SEC2(沈陽協(xié)合生物制藥公司生產(chǎn))的量，在四腳掌和皮下常規(guī)免疫，3～4周后重復(fù)免疫，2周后尾靜脈加強(qiáng)免疫一次。
融合從最后一次加強(qiáng)免疫3天后的小鼠取脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞(本所細(xì)胞室提供)以5∶1的比例混合，用50％PEG液融合。在HAT培養(yǎng)液中37℃5％CO2培養(yǎng)。
雜交瘤細(xì)胞的檢測與選擇性培養(yǎng)培養(yǎng)3-4天后用HAT培養(yǎng)液半量換液，直到細(xì)胞生長至1/3-1/2孔時(shí)進(jìn)行檢測，包被抗原SEC2，取雜交瘤上清(一抗)與抗原共同孵育，洗滌去除未結(jié)合的抗體，加酶標(biāo)羊抗鼠二抗，顯色反應(yīng)陽性(OD值，即吸光度值，與陰性對照比大于2)為待選克隆。第一次克隆后換HT培養(yǎng)液，第二次克隆后換DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。
雜交瘤細(xì)胞以有限稀釋法克隆化將96孔板中待克隆的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液洗下，計(jì)數(shù)并稀釋至20個(gè)細(xì)胞/ml，每孔0.1ml接種96孔板，經(jīng)3次對倍稀釋即每孔含0.5個(gè)細(xì)胞，37℃5％CO2培養(yǎng)。3-5天后有細(xì)胞生長的孔補(bǔ)加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，肉眼可見細(xì)胞克隆時(shí)，進(jìn)行抗體檢測，此時(shí)克隆為100％陽性，可建株。
共挑選出4株高滴度雜交瘤細(xì)胞3B7、4F7、4D7、4F6。
實(shí)施例2單克隆抗體的制備和純化接種取8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射無菌石蠟油0.5ml/只，5天后分別接種2×107/ml由實(shí)施例1所得雜交瘤細(xì)胞3B7、4F7、4D7、4F6。出現(xiàn)較多腹水后收集，可多次收集。
正辛酸沉淀法提純單抗用4倍體積的醋酸緩沖液(冰醋酸1.8ml+500ml蒸餾水)稀釋收集到的腹水，用0.1N NaOH調(diào)pH 4.5。攪拌下，每ml稀釋后的樣品緩慢加入25μl正辛酸。放置30分鐘后，室溫10000rpm離心30分鐘。過濾上清，除去細(xì)渣。加10倍濃縮的PBS(9份樣品+1份10×PBS)，用5N NaOH調(diào)pH 7.4。上清冷卻至4℃，45％飽和硫酸銨沉淀(0.277g/ml)，攪拌30分鐘，4℃，5000rpm離心15分鐘。用少量PBS溶解沉淀，用50～100倍體積的PBS透析過夜，4℃。透析后樣品加0.1％硫柳汞，4℃保存，即分別得到單克隆抗體a、b、c、和d。
標(biāo)記HRP(辣根過氧化物酶)將上述步驟所得純化抗體8-10mg裝入透析袋，用0.01M pH 9.6的碳酸鹽緩沖液4℃透析過夜。取HRP 4mg，溶于1ml的純水中，緩慢加入0.1M NaIO40.1ml，室溫下避光攪拌20分鐘，裝入透析袋，用0.001M pH 4.4的醋酸鹽緩沖液4℃透析過夜。向HRP中加入0.2M的Na2CO30.05ml調(diào)pH至9.6，然后與抗體混合，避光攪拌2小時(shí)。加入4mg/ml的NaBH40.1ml，4℃靜置2小時(shí)，4℃PBS透析過夜。加入等體積的飽和硫酸銨，攪拌30分鐘，4℃靜置2小時(shí)，3000rpm離心20分鐘，棄上清。所得沉淀再用50％的飽和硫酸銨重復(fù)前述操作一遍。所得沉淀溶于1ml PBS中，4℃PBS透析48小時(shí)。得酶標(biāo)單克隆抗體A、B、C、及D。
檢測酶標(biāo)抗體在280、403nm處的OD值，計(jì)算克分子比分別為A3.7，B2.1，C2.8，D3.9。
酶標(biāo)抗體效價(jià)的測定已包被純化抗原的反應(yīng)板，將酶標(biāo)抗體做10倍系列稀釋共10個(gè)稀釋度，37℃反應(yīng)1小時(shí)后顯色，判定酶標(biāo)抗體效價(jià)，其結(jié)果為A1∶1000，B1∶600，C1∶800，D1∶2000。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳配制12％分離膠和5％濃縮膠，灌制凝膠，另配制電泳緩沖液(25mM Tris-Cl，250mM甘氨酸，0.1％SDS)。將樣品懸于SDS-PAGE加樣緩沖液，煮沸5min，12000rpm離心1min后上樣，上樣體積為20μl/孔。電泳時(shí)，樣品位于濃縮膠時(shí)電壓設(shè)為80V，樣品進(jìn)入分離膠后電壓設(shè)為120V，待溴酚蘭到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)R-250染液中染色2-3小時(shí)后，用含20％乙醇和10％冰醋酸的脫色液脫色直至背景無色后觀察。
根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出四株單抗的分子量，通過凝膠成像分析得出單抗的純度，結(jié)果見下表，單抗電泳圖譜見圖1。結(jié)果表明本發(fā)明單克隆抗體的純度可用于制備體外診斷試劑。
表1單抗的純度

注上樣重20μg實(shí)施例3單克隆抗體的特性鑒定將幾種其他腸毒素SEA，SEB，SEC1，SED抗原分別與酶標(biāo)單克隆抗體A、B、C和D進(jìn)行直接反應(yīng)，觀察單抗與其他腸毒素的交叉反應(yīng)。
包被SEA，SEB，SEC1和SED四種腸毒素，抗原濃度分別加入四株酶標(biāo)記的單抗，37℃反應(yīng)1小時(shí)后顯色，測OD值，結(jié)果見表2。當(dāng)抗原濃度＜133.6ng/ml各單抗與抗原無明顯交叉反應(yīng).單抗A在SEC1抗原高濃度時(shí)(＞1μg/ml)與SEC1有微弱交叉這是由于SEC1和SEC2同屬C型腸毒素，兩者氨基酸組成和空間構(gòu)型十分相似(同源性高達(dá)95％以上)。結(jié)果表明本發(fā)明的四株單抗尤其是B和C的特異性好。
表2本發(fā)明單抗與其他腸毒素的交叉反應(yīng)

注OD值0.1；實(shí)施例4單克隆抗體表位測定采用競爭結(jié)合法進(jìn)行本發(fā)明單抗的表位測定。
100μl/孔包被抗原SEC2(5μg/ml)；首先加入未標(biāo)記抗體100μl/孔(10倍系列稀釋為200，20，2，0.2μg/ml)；結(jié)合抗原。1小時(shí)后每一種未標(biāo)記抗體加入四種不同的酶標(biāo)抗體(1∶800)，競爭結(jié)合抗原；ELISA法顯色測OD值。如果兩單抗間的抗原結(jié)合表位相同，則抗原先被未標(biāo)記抗體封閉，加酶標(biāo)抗體后不顯色，反之，兩單抗間的抗原結(jié)合表位不同，加酶標(biāo)抗體后會(huì)顯色。結(jié)果見圖2至圖5。結(jié)果表明四株單抗均與自身競爭，即各單抗的結(jié)合表位相同；單抗b與c有相同或很相似的結(jié)合位點(diǎn)；其余單抗間無競爭結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例5單克隆抗體Ig亞類測定包被純化的SEC2抗原，加入克隆培養(yǎng)的細(xì)胞上清，加Ig亞類標(biāo)準(zhǔn)抗血清，加抗鼠抗體的酶標(biāo)抗體，顯色測OD值。OD值最高孔(＞0.8)為陽性孔。結(jié)果見下表。結(jié)果表明本發(fā)明的四株單抗均為IgG1亞類的免疫球蛋白。
表3本發(fā)明單抗的Ig亞類測定

實(shí)施6單抗的ELISA方法建立根據(jù)實(shí)施例4競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇抗體表位不同的兩株單抗配伍，來建立一種本發(fā)明的測定方法之一“雙抗夾心”法。
用雙抗夾心ELISA法挑選抗體以濃度為10ng/ml的SEC2為檢測抗原，包被不同抗體和酶標(biāo)抗體，選擇出c-A配對。包被抗體5-2.5μg/ml，酶標(biāo)抗體1∶500濃度。
用本發(fā)明單克隆抗體c和酶標(biāo)本發(fā)明單克隆抗體A建立了雙抗夾心ELISA法。
包被液為pH9.6碳酸鹽緩沖液)，洗滌液為pH 7.4 PBS-Tween20，酶標(biāo)抗體稀釋液為1％牛血清白蛋白、pH7.4 PBS-Tween20，底物溶解液為檸檬酸0.47g和磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)1.8g的100ml水溶液。底物溶液為鄰苯二胺2mg溶于底物溶解液5ml并加30％過氧化氫3μl的溶液。終止液為2mol/硫酸。
(1)將包被實(shí)施2所得本發(fā)明抗體c稀釋至5μg/ml后，每孔100μl包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，4℃過夜，洗滌液洗滌，拍干?；蛉“缓玫姆磻?yīng)板，用洗滌液洗滌3遍，拍干。
(2)腸毒素C2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不同濃度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(取腸毒素標(biāo)準(zhǔn)品用0.9％氯化鈉溶液稀釋為下列濃度20ng/ml、16ng/ml、12ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml)，每孔100μl加入反應(yīng)板；待測樣品也加入不同的孔中，以同批次樣品的培養(yǎng)基為陰性對照，37℃2小時(shí)，洗滌液洗滌3遍，拍干。
(3)各孔加實(shí)施例2所得酶標(biāo)抗體A 100μl，37℃1.5小時(shí)，洗滌液洗滌3遍，拍干。
(4)加入底物溶液每孔100μl，37℃顯色10～15min，加2mol/L硫酸每孔50ul終止反應(yīng)。
(5)3分鐘后490nm測OD值。
根據(jù)測得樣品的OD值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線回歸方程。代入待測樣品的OD值即可得到腸毒素C2的含量。
實(shí)施7ELISA方法及其試劑盒的性能根據(jù)前面本發(fā)明的方法制得的本發(fā)明試劑盒，由金黃色葡萄球菌濾液制劑中提取的腸毒素C2免疫動(dòng)物獲得本發(fā)明單克隆抗體制成的包被抗體和酶標(biāo)抗體及其他試劑制成，供本發(fā)明的ELISA法測定金黃色葡萄球菌濾液制劑腸毒素C2含量。
按照距陣法測定本發(fā)明的ELISA方法的最佳包被和酶標(biāo)抗體濃度，結(jié)果如下表4距陣法測最佳包被和酶標(biāo)抗體濃度

由上述結(jié)果可看出，包被抗體SEC2最佳濃度為5-1.25μg/ml，酶標(biāo)抗體最佳稀釋度1∶500。
檢測范圍按前述實(shí)驗(yàn)確定的試劑及濃度做不同含量SEC2的ELISA測定，結(jié)果見圖6、7。
從圖中結(jié)果可見，當(dāng)SEC2含量在0-16ng/ml的范圍內(nèi)，濃度與OD值呈正相關(guān)(R＝0.992)，可以直接用于檢測。圖6中20ng以上的范圍可用擬和曲線法來進(jìn)行檢測。
特異性按前述實(shí)驗(yàn)確定的雙抗夾心法測定與幾種其他腸毒素SEA，SEB，SEC1，SED的反應(yīng)，觀察反應(yīng)特異性。包被抗體C 4μg/ml，腸毒素含量稀釋為10ng/ml，酶標(biāo)抗體稀釋度1∶500。陰性對照為生理鹽水，以SEC2做標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的雙抗夾心法有很好的特異性。
表5

靈敏度根據(jù)前述確立的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行參考品的檢測，結(jié)果見圖8、9。由圖可見，檢出低限為0.5ng/ml，其OD值＞空白對照OD值的3倍SD。說明本發(fā)明的方法有很好的靈敏度。
重復(fù)性對沈陽協(xié)合的金葡菌濾液制劑1007S進(jìn)行多次檢測，結(jié)果如表7。
表6

由表可見，按照本發(fā)明方法的試劑盒測定腸毒素C2重復(fù)性較好。
實(shí)施例8本發(fā)明單抗法與多抗法比較兩種方法分別測定40批含SEC2的樣品(沈陽協(xié)合的金葡菌濾液制劑)。多抗法采用上海醫(yī)學(xué)院微生物教研室研制的試劑。多抗1和2是用前述多抗法分別做了兩次測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表及圖10。
表7

表8

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(1)單抗與多抗法符合率好，高值均高，低值均低，(2)多抗法結(jié)果稍高于單抗法，高4.5％，是因?yàn)槎嗫箍贵w純度差別所致，(3)SEC2含量范圍基本在8-16ng/ml。因此，與多抗法比較，本發(fā)明的方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制試驗(yàn)。
實(shí)施例9本發(fā)明單抗法測出的SEC2對本發(fā)明單抗法檢測出的物質(zhì)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其等電點(diǎn)為5.00～7.44，分子量為26000～34000，紫外最大吸收波長為277～278nm，N末端15個(gè)氨基酸序列為ESQPDPTPDELHKSS。證明本發(fā)明方法檢測出的物質(zhì)是腸毒素C2。
實(shí)施例10本發(fā)明單抗法測定培養(yǎng)基SEC2含量按本發(fā)明的單抗的ELISA法測定金葡液培養(yǎng)基的SEC2含量，見下表。
表9

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)基未檢出腸毒素。表明運(yùn)用本發(fā)明的單抗檢測金葡液腸毒素含量，不受制品生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基所含物質(zhì)的影響。培養(yǎng)基可用做實(shí)驗(yàn)中的陰性對照。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體識別抗腸毒素SEC2作為抗原。
2.一種雜交瘤細(xì)胞系，其產(chǎn)生特異性抗腸毒素SEC2的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
4.一種免疫測定法，其特征在于，該方法是用至少一種權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求4所述的免疫測定法在測定抗腸毒素SEC2中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫測定法，其特征在于，所述測定法用ELISA技術(shù)進(jìn)行。
7.一種試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有至少一種權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用ELISA技術(shù)。
9.權(quán)利要求7所述的試劑盒在測定抗腸毒素SEC2中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或3所述單克隆抗體在檢測抗腸毒素SEC2中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腸毒素C
文檔編號C12N5/12GK1757652SQ20041008117
公開日2006年4月12日 申請日期2004年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月10日
發(fā)明者張庶民, 駱鵬, 呂惠賢 申請人:中國藥品生物制品檢定所