專利名稱：一種蜈蚣草abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因，與該基因在治理砷污染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤是人類賴以生存的自然資源，但是，由于生活污水排放、污水灌溉、大氣沉降、采礦冶煉、農(nóng)藥化肥大量施用等原因，加上土壤對于污染物的累積富集作用，土壤污染，尤其是重金屬污染狀況日趨嚴(yán)重。
傳統(tǒng)的土壤污染治理方法主要有基于機(jī)械物理或物理化學(xué)原理的工程措施，包括客土換土法、隔離法、清洗法、熱處理法、電化學(xué)法等；基于污染物土壤地球化學(xué)行為的改良措施，如添加改良劑、抑制劑降低土壤污染物的水溶性、擴(kuò)散性和生物有效性，以減輕污染物對生態(tài)環(huán)境的危害。土壤污染治理的工程學(xué)方法往往需要將污染土壤挖運(yùn)后處理，不僅耗資巨大，而且破壞了土壤微生物及土壤結(jié)構(gòu)，對于大規(guī)模、中強(qiáng)度的污染治理幾乎無法實(shí)現(xiàn)。
近十年來，植物修復(fù)(Phytoremediation)技術(shù)成為土壤污染修復(fù)研究的熱點(diǎn)。植物修復(fù)是利用可超富集重金屬的植物吸收、積累環(huán)境中的污染物，并降低其毒害的環(huán)保生物技術(shù)。它具有傳統(tǒng)環(huán)境修復(fù)技術(shù)所不具備的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)為治理效果的永久性、治理過程的原位性(對土壤環(huán)境擾動小)、治理成本的低廉性、環(huán)境美學(xué)的兼容性、后期處理的簡易性等特點(diǎn)，而且修復(fù)過程一般無二次污染，某些金屬元素甚至可回收利用。植物修復(fù)所獨(dú)有的技術(shù)及經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，預(yù)示該項(xiàng)技術(shù)將發(fā)展成為污染治理領(lǐng)域的朝陽產(chǎn)業(yè)。
植物修復(fù)為從根本上解決土壤和水體金屬污染提供了一種重要途徑，因而植物修復(fù)在土壤金屬污染治理中具有獨(dú)特的作用和意義。然而，植物修復(fù)技術(shù)目前尚存在著一些不足其一是重金屬超富集植物是在重金屬脅迫環(huán)境下長期誘導(dǎo)、馴化的一種適應(yīng)性突變體，往往生長緩慢、生物量低，且常常受到雜草的競爭性威脅；其二是這些超富集植物多為野生型稀有植物，對生物氣候條件的要求比較嚴(yán)格，區(qū)域性分布較強(qiáng)，嚴(yán)格的適生性使成功引種受到嚴(yán)重限制；其三是超富集植物的專一性很強(qiáng)，往往只對某種特定的重金屬表現(xiàn)出超富集能力，且大部分仍處于試驗(yàn)階段，到實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。從而嚴(yán)重制約了植物修復(fù)的效率及應(yīng)用。體積較小或呈蓮座形生長的植物往往影響機(jī)械收獲，使得年收獲的費(fèi)用增加。
植物修復(fù)的長遠(yuǎn)發(fā)展依賴于超富集植物分子機(jī)制的闡明和新型超富集工程植物的研發(fā)。分子生物學(xué)在植物修復(fù)研究和應(yīng)用領(lǐng)域扮演著越來越重要的角色。在闡明超富集植物分子機(jī)制的基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)，將自然界中超累積植物的耐重金屬、超累積基因移殖到生物量大、生長速率快的植物中去，培育出具有實(shí)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物，以克服天然超累積植物的缺點(diǎn)，提高植物修復(fù)的實(shí)用性。到目前為止，在Se、Hg、Cd、Zn等重金屬元素轉(zhuǎn)基因植物研究領(lǐng)域已取得了較大的成果。隨著分子生物技術(shù)的突飛猛進(jìn)，預(yù)期這方面研究一定會取得突破性的進(jìn)展。
砷是一種致癌的化學(xué)元素。砷污染物主要是以砷化物的形式存在，它可從呼吸道、食物或皮膚進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人類健康。砷化物通過抑制體內(nèi)酶的活性，干擾人體正常新陳代謝，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生紊亂，毛細(xì)血管擴(kuò)張。人們?nèi)糸L時(shí)間暴露在含砷環(huán)境中，則會大大增加患肝癌、皮膚癌或膀胱癌等惡性疾病的機(jī)率。現(xiàn)在越來越多的皮膚癌、腎癌、肺癌或膀胱癌等癌癥患者與長期飲用含砷量高的水有關(guān)。飲用水中砷的長期慢性作用可導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生嚴(yán)重的色素沉著現(xiàn)象并且手、腳生成角質(zhì)物質(zhì)，進(jìn)一步惡化則變?yōu)槠つw癌。長期飲用含砷量高的水，患肺癌、膀胱癌或其它癌癥的幾率高達(dá)10％。另外土壤和水體的砷污染還可導(dǎo)致糧食減產(chǎn)，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。天然水中僅含微量的砷，水中含砷量高，除了地質(zhì)因素外，主要是工業(yè)廢水和農(nóng)藥污染所致。面對全球砷污染的嚴(yán)重狀況，亟需闡明超富集植物對砷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒的機(jī)理，研發(fā)出修復(fù)砷污染環(huán)境的生物技術(shù)，以盡快地消除土壤及水體的砷污染對人類健康的威脅。
然而，很久以來砷污染的植物修復(fù)技術(shù)一直是一個(gè)空白。直到2001年，Nature報(bào)道發(fā)現(xiàn)了世界上第一種能夠大量富集砷的鳳尾蕨屬植物—蜈蚣草Pteris vittata L.，人們才開始對砷污染的植物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行研究。次年，陳同斌等在我國境內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了這種砷超富集植物。經(jīng)研究表明，蜈蚣草具有典型的超富集植物的三大特征高效的根部吸收、根到莖的高效轉(zhuǎn)運(yùn)，及植物細(xì)胞對砷的高抗性。蜈蚣草的地上部分可以富集22,630mg kg-1砷，比土壤中砷濃度的10倍還高。
蜈蚣草屬蕨類植物門、鳳尾蕨科鳳尾蕨屬。這種植物的適應(yīng)能力強(qiáng)，喜陽，多生長在堿性環(huán)境中。Ma等在佛羅里達(dá)州中部一個(gè)鉻酸銅和砷酸鹽污染的地區(qū)發(fā)現(xiàn)了這種蕨類植物。他們的研究表明在砷濃度高達(dá)1,500ppm(mg/kg)的土地上蜈蚣草仍然可以正常生長，蜈蚣草地上部在兩周內(nèi)富集的砷濃度可以從29.4ppm(mg/kg)增加到15,861ppm(mg/kg)，生長在含砷6ppm(mg/kg)土地上的蜈蚣草可以富集755ppm(mg/kg)砷，其地上部富集的砷是土壤中的126倍。
Ma等在研究蜈蚣草中砷的形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，生長20周的蜈蚣草植株中大部分砷都以強(qiáng)毒性的無機(jī)形態(tài)存在，幾乎檢測不到有機(jī)砷。地上部(47-80％)As(III)的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根部(8.3％)，該結(jié)果表明當(dāng)從根部運(yùn)送到地上部時(shí)，砷從五價(jià)轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)。他們的研究還表明蜈蚣草不僅可以從不同濃度的土壤中清除砷，而且可以從土壤中清除不同形態(tài)的砷。此外，對于不能溶解的FeAsO4和AlAsO4，蜈蚣草地上部仍然可以富集136-315ppm(mg/L)砷，該濃度是土壤中砷濃度的3-6倍。Tu的研究結(jié)果也與之類似，在土壤中加入同一濃度不同形態(tài)的砷，包括砷酸鹽(AsO43-)、亞砷酸鹽(AsO21-)、二甲基砷酸(DMA)以及一甲基砷酸(MMA)，18周后檢測結(jié)果表明土壤中可溶性的砷只有砷酸鹽，而蜈蚣草植株中94％的砷都是亞砷酸鹽。但在老葉和離體葉片中，亞砷酸鹽又被氧化成砷酸鹽。
在許多植物中，含低分子量巰基的化合物(如PCs)在重金屬的解毒和積累方面都起重要的作用。Zhao等的研究結(jié)果表明砷超富集植物蜈蚣草中只有1-3％的砷形成As(III)-(PC2)2復(fù)合物。這說明PCs在砷的解毒和積累方面起很有限的作用。
1982年，在Giovanna Ames的實(shí)驗(yàn)室克隆到了第一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-bindingcassette(ABC)transporter)—組氨酸透性酶(histidine permease)。至此以后，不同的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)，并成為生物體中最大的蛋白家族之一。大多數(shù)ABC蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)伴隨著ATP水解，其轉(zhuǎn)運(yùn)底物很多，包括脂質(zhì)、無機(jī)離子、有機(jī)復(fù)合物、氨基酸、小肽、糖、次級代謝產(chǎn)物及蛋白等。
根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生途徑及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又分為多個(gè)亞家族。研究較多的三個(gè)亞家族分別是多效抗藥性亞家族(pleiotropic drug resistance，PDR)、廣譜抗藥性亞家族(multidrug resistance，MDR)以及廣譜抗藥性相關(guān)蛋白亞家族(multidrug resistance-associated protein，MRP)。
雖然ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物種類繁多，但在結(jié)構(gòu)和機(jī)理上有很多共性，即它們都是通過以ATP為能量來源的泵或通道來執(zhí)行功能。一個(gè)完整的有功能的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括兩個(gè)核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding domains，NBDs或ABC結(jié)構(gòu)域)和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domains，TMDs)。NBD通常存在于細(xì)胞質(zhì)中，具有與ATP結(jié)合的區(qū)域，TMD通常含有6個(gè)α螺旋跨膜區(qū)。了解ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)對于研究ATP水解與底物轉(zhuǎn)運(yùn)的協(xié)同工作機(jī)理具有重要意義。
擬南芥的基因組研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因組中共包含131個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中有54個(gè)全長ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(即包含兩個(gè)疏水區(qū)和兩個(gè)親水區(qū))。水稻基因組測序結(jié)果表明含有45個(gè)全長ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。1993年，Martinoia等研究了大麥液泡對谷胱甘肽的吸收，此吸收過程是由一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的。但大多數(shù)植物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能尚不清楚。
目前為止，人們對植物砷抗性和超富集機(jī)理的了解還非常有限。蜈蚣草能夠超富集砷是近年的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)。但目前僅對蜈蚣草中砷的吸收、形態(tài)、分布有一些初步的了解，關(guān)于蜈蚣草對砷的超富集機(jī)理以及解毒機(jī)制還不清楚，也沒有任何相關(guān)分子機(jī)制的報(bào)道。
酵母的基因組較為簡單，酵母中重金屬抗性基因的研究相對較為清楚。ACR3基因定位于酵母細(xì)胞質(zhì)膜上，可以將酵母細(xì)胞內(nèi)的亞砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，對酵母亞砷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)起重要的作用。FD236-6A即是缺失ACR3基因的突變菌株，該菌株對亞砷酸鹽的敏感度是野生型菌株的5倍，在含超過0.3mM亞砷酸鹽的YPD固體培養(yǎng)基中便不能生長。利用FD236-6A酵母菌株，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證其它生物來源的基因在砷抗性中的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，名稱為PvABCT1，來源于蜈蚣草(Pterisvittata L.)是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有砷吸收作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列2由597個(gè)氨基酸殘基組成。
編碼上述蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為PvABCT1，可具有以下核苷酸序列之一1)序列表中序列1的多核苷酸序列；2)與序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同活性的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的序列1由2165個(gè)堿基組成，其編碼序列為自序列1的5’端第163-1956位核苷酸。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系，如pESPM/PvABCT1，pGFP-2/PvABCT1和含有pESPM/PvABCT1的FD236-6A酵母菌株均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增上述蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
PvABCT1具有兩個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域——ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于自N端第105-112位氨基酸殘基和417-424位氨基酸殘基；兩個(gè)很小的跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于序列表中序列2的自N端第252-257位氨基酸殘基和自N端第515-519位氨基酸殘基；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的信號區(qū)，位于序列表中序列2的自N端第217-231位氨基酸殘基；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征結(jié)構(gòu)域，位于自N端第73-313位氨基酸殘基。表明PvABCT1是一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。同時(shí)對PvABCT1蛋白進(jìn)行疏水性分析，表明該蛋白具有很強(qiáng)的親水性，無明顯的疏水區(qū)域。
在實(shí)際應(yīng)用中，可通過將蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入其它生物量大、生長速率快的植物中，培育出具有富集砷特性的轉(zhuǎn)基因植物，以克服天然超累積植物的缺點(diǎn)，提高植物修復(fù)的實(shí)用性。
研究表明本發(fā)明的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在砷的吸收和積累中起重要作用，因而將在修復(fù)砷污染環(huán)境的生物技術(shù)中起到重要作用，以盡快消除土壤及水體的砷污染對人類健康的威脅，同時(shí)對其它重金屬環(huán)境污染的治理也具有重要的啟示意義，本發(fā)明具有較大的實(shí)際意義。


圖1為蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的同源序列檢索的結(jié)果圖2A為經(jīng)不同重金屬處理的蜈蚣草PvABCT1基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化柱狀2B為經(jīng)不同重金屬處理的蜈蚣草PvABCT1基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的電泳3為三種酵母菌株對砷吸收量的測定結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、PvABCT1及其編碼基因PvABCT1的獲得一、砷處理蜈蚣草的SSH文庫的構(gòu)建1、蜈蚣草的砷處理蜈蚣草(Pteris vittata L.)采自湖北省礦區(qū)，移栽在溫室培養(yǎng)。取未經(jīng)砷處理的蜈蚣草嫩葉(對照)和經(jīng)5mM NaAsO2處理4周后的蜈蚣草嫩葉(盆栽條件下，在土壤中加入NaAsO2溶液，使其終濃度為5mM，處理4周后取嫩葉)，用液氮速凍后保存于-70℃待用。
2、蜈蚣草RNA的提取用改進(jìn)的RNA提取方法分別提取步驟1中未經(jīng)處理的和用NaAsO2處理后的蜈蚣草的總RNA，具體步驟如下
1)將0.5ml提取緩沖液A(含100mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；500mmol/L EDTA，pH 8.3；500mmol/L NaCl，2％SDS，5mmol/L DTT)加入到1.5ml離心管中，加入1.5％體積的β-巰基乙醇；2)將100mg蜈蚣草葉片用液氮冷凍研磨后，迅速轉(zhuǎn)到溫浴的離心管中，劇烈震蕩離心管，使組織與提取緩沖液A充分混勻，70℃溫浴6min，迅速置于冰上；3)待混合物冷卻后，12000g離心10min，小心取出上清液；4)將上清液中加入0.1ml 5mol/L NaCl，混勻后，加入溶液1/2體積的水飽和酚和1/2體積的氯仿，置于震蕩器上劇烈震蕩2min，12000g離心10min，小心取出上清液；5)向上清液中加入1/4體積的2-丁氧乙醇和1.5％體積的β-巰基乙醇，混勻，冰浴10min；6)將混合物2000g離心10min，小心取出上清液；7)向上清液中加入等體積的2-丁氧乙醇和1.5％體積的β-巰基乙醇，充分混勻后靜置10min，12000g離心10min，棄上清，沉淀即為總RNA；8)將步驟7)中的沉淀用50％的2-丁氧乙醇洗滌兩次，加入適量的DEPC處理水溶解總RNA。
3、mRNA的純化及濃縮1)使用Oligotex mRNA Spin-Column Kit(Clontech公司)并參照其說明書分別對步驟1獲得的未經(jīng)砷處理和經(jīng)砷處理蜈蚣草的總RNA進(jìn)行純化，得到含有未經(jīng)砷處理和經(jīng)砷處理蜈蚣草mRNA的溶液；2)將含有經(jīng)砷處理的蜈蚣草mRNA的溶液中加入1/10體積的3M NaAc和2倍體積的乙醇。-20℃下放置1h；8000g離心15min，棄上清；向沉淀中加1ml 70％乙醇，混勻后8000g離心15min，棄上清；將沉淀在空氣中干燥10min，用不含核酸酶的蒸鎦水溶解，得到砷處理蜈蚣草mRNA的濃縮液；3)用與步驟2)相同的方法得到含有未經(jīng)砷處理蜈蚣草mRNA的濃縮液。
4、抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)文庫的構(gòu)建及同源序列的檢索與比較以步驟3獲得的砷處理蜈蚣草的mRNA為實(shí)驗(yàn)方(tester)、未經(jīng)砷處理蜈蚣草的mRNA為驅(qū)動方(driver)，使用Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)并參照其說明書按常規(guī)方法得到實(shí)驗(yàn)方和驅(qū)動方的SSH PCR產(chǎn)物。
將實(shí)驗(yàn)方和驅(qū)動方經(jīng)消減雜交后的抑制性PCR產(chǎn)物克隆至載體pGEM-Teasy(Promega公司)中，建立兩個(gè)差異SSH文庫，具體步驟如下
1)將實(shí)驗(yàn)方和驅(qū)動方消減雜交后的抑制性PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)分別與載體pGEM-Teasy連接，形成重組載體，將含有實(shí)驗(yàn)方抑制性PCR產(chǎn)物基因的重組載體命名為pGEM-Tester，將含有驅(qū)動方抑制性PCR產(chǎn)物基因的重組載體命名為pGEM-Driver。
2)將重組載體pGEM-Tester和pGEM-Driver分別用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將兩種重組菌接種于LB抗性培養(yǎng)平板(含氨芐青霉素100μg/ml，濃度為20mg/ml的X-Gal 40μl，濃度為200mg/ml的IPTG 4μl)進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取白色單菌落為模板，用菌落PCR的方法做進(jìn)一步篩選，PCR反應(yīng)體系如下滅菌水16.5μl10×PCR反應(yīng)緩沖液 2μldNTP(10mM)0.5μl(TaKaRa公司)SP6(20pmol/ml)0.25μl(TaKaRa公司)T7(20pmol/ml) 0.25μl(TaKaRa公司)rTaq DNA聚合酶0.5μl(TaKaRa公司)總共 20μlPCR反應(yīng)條件為94℃25sec；94℃10sec，55℃30sec，72℃1.5min，27個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，選取陽性克隆，用雙脫氧核糖核酸法進(jìn)行測序。測序完畢后，在NCBI(htttp//www.ncbi.hlm.nib.gov/BLAST)的蛋白數(shù)據(jù)庫(Blastp)中進(jìn)行蛋白序列的同源序列檢索，對其中一些序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果在以砷處理蜈蚣草為實(shí)驗(yàn)方、未經(jīng)砷處理蜈蚣草為驅(qū)動方的cDNA文庫中，篩選到的一條385bp的cDNA片段，該片段含有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-bindingcassette transporter)的核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且與楊樹、擬南芥、水稻的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的同源性都在80％以上。
二、RACE法克隆砷處理蜈蚣草PvABCT1及其編碼基因PvABCT1用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)參照說明書克隆出砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，具體步驟如下1、合成第一鏈cDNA1)取2個(gè)PCR管，分別用來合成5’-RACE-Ready cDNA和3’-RACE Ready cDNA，兩個(gè)反應(yīng)體系如下5’-RACE-Ready cDNA反應(yīng)體系1μg砷處理蜈蚣草mRNA1μl 5’-CDS引物(試劑盒中自帶)
1μl SMART II A oligo(試劑盒中自帶)；3’-RACE Ready cDNA反應(yīng)體系1μg砷處理蜈蚣草mRNA1μl 3’-CDS引物A(試劑盒中自帶)1μl SMART II A oligo(試劑盒中自帶)；兩個(gè)反應(yīng)體系均用滅菌水補(bǔ)至5μl，混勻后離心；2)用PCR儀70℃反應(yīng)2分鐘，冰浴2分鐘，短暫離心；3)將兩個(gè)反應(yīng)管中再分別加入以下試劑2μl 5×第一鏈緩沖液1μl DTT(20mM)1μl dNTP(10mM)1μl PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶(試劑盒中自帶)；混勻后離心；4)用PCR儀42℃反應(yīng)1.5個(gè)小時(shí)；5)用Tricine-EDTA(試劑盒中自帶)緩沖液將上述反應(yīng)液稀釋10倍；6)用PCR儀72℃加熱7分鐘，獲得第一鏈cDNA。
2、RACE反應(yīng)根據(jù)得到的砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因片段的序列，設(shè)計(jì)合成了基因特異引物(Gene Specific Primer，GSP)，分別為GSP15’-TATGTCCAAACCCGTGAAGAGCTGG-3’GSP25’-GGTTTCAACAAAAGCATGCAACAG-3’NGSP15’-CGGGATTTTTCAGGCGGCTGGAG-3’NGSP25’-GGGATTTTTCAGGCGGCTGGAGA-3’1)分別以GSP1和GSP2為引物進(jìn)行5’-RACE和3’-RACE反應(yīng)，均按說明書操作配置反應(yīng)體系；反應(yīng)條件如下5’-RACE反應(yīng)條件為95℃1min，64℃1min，72℃50sec，30個(gè)循環(huán)。
3’-RACE反應(yīng)條件為95℃1min，64℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)。
用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明5’RACE和3’RACE分別得到750bp和1500bp大小的條帶，再用引物NGSP1和NGSP2進(jìn)行驗(yàn)證，均得到預(yù)期長度的片段。然后對5’RACE和3’RACE片段進(jìn)行測序，并根據(jù)測序的結(jié)果，即根據(jù)cDNA的5’端和3’端序列再次設(shè)計(jì)引物(引物序列如下)，進(jìn)行砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA全長基因的克隆。
引物3’-15’CTACAAGAAGAAAGTGTTATAAATATTGATCAGA 3’引物5’-15’GCTTTTTAGTTTTCCCCAACCCTCA 3’砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA全長基因克隆的PCR反應(yīng)體系如下滅菌水 15μl蜈蚣草cDNA(1ng/μl)1μl10×LA PCR反應(yīng)緩沖液 2μl(TaKaRa公司)dNTP(10mM) 0.5μl(TaKaRa公司)引物3’-1(20pmol/ml) 0.5μl(上海博亞生物技術(shù)有限公司合成)引物5’-1(20pmol/ml) 0.5μl(上海博亞生物技術(shù)有限公司合成)LA Taq DNA聚合酶 0.5μl(TaKaRa公司)總共 20μlPCR循環(huán)條件為95℃30sec，62℃30sec，72℃2.5min，30個(gè)循環(huán)。
3、砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的cDNA的序列分析將步驟2克隆得到的砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA全長基因進(jìn)行測序，將測序結(jié)果用DNAMAN4.0軟件和NCBI的BLAST進(jìn)行序列比較、同源性分析、疏水性分析以及結(jié)構(gòu)域預(yù)測，并用PPSEARCH軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。
1)DNA測序結(jié)果表明砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA序列全長為2165bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，其編碼序列(開放閱讀框架)長度為1794bp，是自序列1的5’端的第163-1956位核苷酸，編碼具有序列表中序列2(597個(gè)氨基酸殘基)的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。5’端的非翻譯區(qū)長度為162bp，3’端的終止區(qū)長度為209bp，含一個(gè)長度為20bp的polyA尾。將該基因命名為PvABCT1，其編碼蛋白命名為PvABCT1。
2)PvABCT1的蛋白序列分析及同源性比較PvABCT1蛋白質(zhì)的分子量約為67284kD，等電點(diǎn)為6.38。PvABCT1在數(shù)據(jù)庫中與各種原核和真核生物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有較高的同源性。如圖1所示，PvABCT1氨基酸序列與楊樹、擬南芥以及水稻ABC Transporter氨基酸序列比較，其同源性達(dá)80-85％。
3)PvABCT1的保守結(jié)構(gòu)域分析對PvABCT1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明PvABCT1具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的特征。其中自N端第217-231位氨基酸殘基為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的信號區(qū)；自N端第105-112位氨基酸殘基和417-424均為ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域；自N端第73-313位氨基酸殘基為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征結(jié)構(gòu)域。表明PvABCT1是一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
PvABCT1氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中與各種原核和真核生物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有較高的同源性。如圖1所示，蜈蚣草PvABCT1氨基酸序列與楊樹、擬南芥以及水稻ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列比較，其同源性達(dá)80-85％。圖1中，右邊的數(shù)字表示每個(gè)氨基酸位置。黑色陰影部分表示相同的氨基酸殘基。擬南芥、水稻、楊樹轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在GenBank的序列號分別是NP 200887，BAC55994和AB041505.1。
4)PvABCT1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測通過PSORT軟件對PvABCT1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明PvABCT1具有兩個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域——ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于自N端第105-112位氨基酸殘基和417-424位氨基酸殘基；兩個(gè)很小的跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于序列表中序列2的自N端第252-257位氨基酸殘基和自N端第515-519位氨基酸殘基；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的信號區(qū)，位于序列表中序列2的自N端第217-231位氨基酸殘基；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征結(jié)構(gòu)域，位于自N端第73-313位氨基酸殘基。表明PvABCT1是一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。同時(shí)對PvABCT1蛋白進(jìn)行疏水性分析，表明該蛋白具有很強(qiáng)的親水性，無明顯的疏水區(qū)域。
實(shí)施例2、用RT-PCR的方法進(jìn)行PvABCT1表達(dá)模式的研究分別收集經(jīng)5mM NaAsO2、1mM CdCl2和1mM CuSO4處理蜈蚣草4周的蜈蚣草嫩葉(盆栽條件下，在土壤中加入NaAsO2(使其終濃度為5mM)、CdCl2(使其終濃度為1mM)或CuSO4(使其終濃度為1mM)處理溶液，處理4周后取嫩葉)，用液氮速凍后保存于-70℃，用于下述RT-PCR檢測。
1、蜈蚣草actin基因片段的克隆根據(jù)擬南芥等植物actin基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物，其序列為引物35’-TTTGCTGGAGATGATGCTCC-3’引物45’-GTGGTACGACCACTGGCATA-3’以蜈蚣草的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條400bp左右大小的條帶，經(jīng)測序并與其他植物的actin基因序列進(jìn)行比較，證明它是蜈蚣草的actin基因片段。因?yàn)閍ctin基因的表達(dá)比較穩(wěn)定，不因外界環(huán)境刺激或組織不同而變化，是很好的RT-PCR的內(nèi)參。
2、cDNA的合成應(yīng)用mRNA選擇性PCR試劑盒(mRNA Selective PCR Kit，購自TaKaRa)合成cDNA。其中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為2×mRNA選擇性PCR緩沖液(試劑盒中自帶) 25μlMgCl2(試劑盒中自帶)10μldNTP(試劑盒中自帶) 5μl
RNase抑制劑(試劑盒中自帶) 1μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶(試劑盒中自帶) 1μl下游特異引物(CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG)(20pmol/ml) 1μl不同重金屬處理的蜈蚣草RNA(1μg/μl)1μldH2O 6μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為30℃10min，45℃30min，5℃5min。合成不同處理的cDNA。
3、PCR反應(yīng)根據(jù)PvABCT1的序列，設(shè)計(jì)一對特異引物引物55’ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’引物65’CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG 3’以5mM NaAsO2、1mM CdCl2和1mM CuSO4處理的蜈蚣草cDNA為模板，按以下程序進(jìn)行95℃40秒，60℃50秒，72℃50秒，23個(gè)循環(huán)。
取等量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳條帶經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)Alphaimager(AlphaInnotech公司，型號LCS NO.00182)掃描并積分定量。同法測定對應(yīng)的actin基因表達(dá)量，所有數(shù)據(jù)均以actin的表達(dá)量取得一致，并將兩者進(jìn)行比較，得到不同處理的PvABCT1基因的表達(dá)差異。結(jié)果如圖2A和圖2B所示，表明在未經(jīng)重金屬處理的蜈蚣草葉片中，PvABCT1基因有較低水平的表達(dá)。蜈蚣草經(jīng)過5mM Na3AsO3、1mM CdCl2以及1mM CuSO4處理后，該基因表達(dá)量均有所提高。砷處理?xiàng)l件下該基因的表達(dá)量是未處理的7倍，而銅離子和鎘離子處理?xiàng)l件下其表達(dá)量是未處理的2倍左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該基因的表達(dá)受砷的誘導(dǎo)，但銅離子和鎘離子對其表達(dá)也有一定影響。圖2A和2B中，CK表示對照，As表示經(jīng)過5mM Na3AsO3處理，Cd表示經(jīng)1mM CdCl2處理，Cu表示經(jīng)1mM CuSO4處理。
實(shí)施例3、PvABCT1基因的亞細(xì)胞定位(基因瞬時(shí)表達(dá))1、瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建引物序列如下引物75’GCCTCGAGATGGCGTCAGATGCAA3’(劃線部分的核苷酸序列為XhoI)引物85’CCGGTACCAAGGCCTGCTTTTGCT3’(劃線部分的核苷酸序列為KpnI)以蜈蚣草PvABCT1基因的全長cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為滅菌水 15μl蜈蚣草cDNA(1ng/μl) 1μl10×LA PCR反應(yīng)緩沖液2μl(TaKaRa公司)dNTP(10mM) 0.5μl(TaKaRa公司)
引物7(20pmol/ml)0.5μl(上海博亞生物技術(shù)有限公司合成)引物8(20pmol/ml)0.5μl(上海博亞生物技術(shù)有限公司合成)LA Taq DNA聚合酶0.5μl(TaKaRa公司)總共20μlPCR循環(huán)條件為95℃30sec，62℃30sec，72℃2.5min，30個(gè)循環(huán)。
經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出了PvABCT1，并在PvABCT1兩端引入了XhoI和KpnI的酶切位點(diǎn)。將基因瞬時(shí)表達(dá)載體pGFP-2(M.J.Varagona，R.J.Schmidt and N.V.Raikhel，Nuclear localization signals required for nuclear targeting of the maizeregulatory protein Opaque-2.Plant Cell 4(1992)，1213-1227.)與引入了XhoI和KpnI位點(diǎn)的PvABCT1用XhoI和KpnI進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用玻璃奶回收試劑盒(博大泰克公司)回收后再用T4DNA連接酶連接，得到含有PvABCT1的重組載體pGFP-2/PvABCT1。將重組載體pGFP-2/PvABCT1用XhoI和KpnI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體pGFP-2/PvABCT1正確。
2、植物材料準(zhǔn)備剝?nèi)⊙笫[內(nèi)表皮于MS培養(yǎng)基中，室溫放置備用。
3、轉(zhuǎn)基因植物的制備及PvABCT1的亞細(xì)胞定位將步驟1構(gòu)建的含有PvABCT1的重組載體pGFP-2/PvABCT1及載體pGFP-2(對照)用基因槍轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入步驟2的洋蔥表皮細(xì)胞中，導(dǎo)入后將其在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，然后用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GFP熒光在用pGFP-2轟擊的洋蔥表皮的整個(gè)表皮細(xì)胞中均可觀察到。在用pGFP-2/PvABCT1轟擊的洋蔥表皮中，觀察到的GFP熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，從而證明PvABCT1是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
實(shí)施例4、酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)利用FD236-6A酵母菌株(Bobrowicz P，Wysocki R，Owsianik G，Goffeau A，Ulaszewski S.Isolation of three contiguous genes，ACR1，ACR2 and ACR3，involved in resistance to arsenic compounds in the yeast Saccharomycescerevisiae.Yeast，1997，13819-28.)，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其它生物來源的基因在砷抗性中的功能。將PvABCT1基因轉(zhuǎn)入對As敏感的酵母菌株FD236-6A中，分別檢測其對砷、銅、鎘三種重金屬的抗性，以驗(yàn)證其是否能夠互補(bǔ)ACR3基因的功能。
1、設(shè)計(jì)引物引物序列如下
引物95’GCCTCGAGATGGCGTCAGATGCAA3’(劃線部分的核苷酸序列為XhoI)引物105’ACGGATCCTCAAAGGCCTGCTTTT3’(劃線部分的核苷酸序列為BamHI)以蜈蚣草PvABCT1的全長cDNA為模板，在引物9和引物10的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系以及PCR循環(huán)條件同實(shí)施例1步驟二中的砷處理蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA全長基因克隆。經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出了PvABCT1，并在PvABCT1兩端引入了XhoI和BamHI的酶切位點(diǎn)。將酵母超表達(dá)載體pESPM(Xin Wang，Wen-Zhong Xu，Yun-YuanXu，Kang Chong，Zhi-Hong Xu and Gui-Xian Xia，Wheat RAN1，a nuclear small Gprotein，is involved in regulation of cell division in yeast.Plant Science，200467，6，1183-1190)與引入XhoI和BamHI位點(diǎn)的PvABCT1用XhoI和BamHI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用玻璃奶回收試劑盒(博大泰克公司)回收后再用T4DNA連接酶連接，得到含有PvABCT1的重組載體pESPM/PvABCT1。將重組載體pESPM/PvABCT1用XhoI和BamHI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體pESPM/PvABCT1正確。
2、轉(zhuǎn)化酵母將構(gòu)建的重組載體pESPM/PvABCT1轉(zhuǎn)化酵母(FD236-6A)，具體步驟如下1)將該酵母菌株接種于5ml液體YPD培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)；2)測定培養(yǎng)物的細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約5×106個(gè)/ml時(shí)，將其接種于100ml液體YPD培養(yǎng)基中，30℃，200轉(zhuǎn)/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；3)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約2×107個(gè)/ml時(shí)，停止培養(yǎng)，3000g離心5min，收獲細(xì)胞，棄培養(yǎng)液；4)將收獲的細(xì)胞懸浮于25ml無菌水中，3000g離心5min，收獲細(xì)胞；5)把收獲的細(xì)胞懸浮在1ml的100mmol/L的醋酸鋰中，將懸浮物轉(zhuǎn)到一個(gè)無菌1.5ml的離心管中，離心5sec沉淀細(xì)胞，吸出醋酸鋰；6)用100mmol/L醋酸鋰溶液懸浮細(xì)胞至終體積為500μl；7)將1ml單鏈單體DNA樣品(Clontech公司)煮沸5分鐘，快速在冰水中冷卻；8)振蕩步驟6)的細(xì)胞懸浮液，取50μl細(xì)胞懸浮液加到標(biāo)記的離心管中，離心沉淀細(xì)胞，除去醋酸鋰；9)配制“轉(zhuǎn)化混合液”，成分如下240μl PEG(50％)36μl1.0mol/L醋酸鋰25μl單鏈載體DNA(2.0mg/ml)(Clontech公司)50μl水和質(zhì)粒(含0.1-10μg的步驟1構(gòu)建的載體pESPM/PvABCT1)；
劇烈振蕩至每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的細(xì)胞完全混勻；10)將轉(zhuǎn)化混合液30℃保溫30min；11)將轉(zhuǎn)化混合液42℃熱激20-25min；12)將轉(zhuǎn)化混合液6000-8000g離心15秒，除去轉(zhuǎn)化混合液；13)將1-2ml的無菌水加到每個(gè)反應(yīng)管中，輕輕懸浮沉淀。
3、篩選轉(zhuǎn)化子將200μl含有轉(zhuǎn)化的酵母菌株FD236-6A的轉(zhuǎn)化混合液涂到去除亮氨酸的SD(購于Clontech公司)培養(yǎng)平板30℃培養(yǎng)72小時(shí)篩選轉(zhuǎn)化子。挑取陽性克隆，分別在含有300μmol/L As3+(用50mmol/L MES緩沖液配制)和500μmol/L As3+的1/2YPD培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行二次篩選。
以經(jīng)兩次篩選獲得的陽性克隆為模板，用PvABCT1的特異引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。
PvABCT1的特異引物序列為引物115’-ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT-3’引物125’-CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG-3’菌落PCR程序如下95℃2min；95℃30sec，60℃30sec，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。得到表達(dá)有PvABCT1基因的酵母菌株。
4、酵母抗性檢測利用酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分別檢測經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子對砷、銅、鎘三種重金屬的抗性，結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)D236-6A酵母菌株在添加0.25mM NaAsO2的1/2YPD培養(yǎng)基中可以正常生長。PvABCT1轉(zhuǎn)入到FD236-6A后，該酵母對砷的敏感性提高。在添加0.125mM NaAsO2的1/2YPD培養(yǎng)基中生長減慢，在0.25mM NaAsO2條件下該酵母就完全不能生長。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明PvABCT1不僅不能與ACR3基因的功能互補(bǔ)，反而使酵母對砷的敏感性增加，說明PcABCT1基因的功能與ACR3基因不同。
同時(shí)還檢測了把PvABCT1轉(zhuǎn)入到FD236-6A后該酵母對銅、鎘的抗性反應(yīng)。結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)D236-6A酵母菌株在添加4mM CuSO4的1/2YPD培養(yǎng)基中可以正常生長，在添加6mM CuSO4的1/2YPD培養(yǎng)基中，F(xiàn)D236-6A酵母菌株生長減慢，在8mM CuSO4條件下該酵母就完全不能生長。而PvABCT1轉(zhuǎn)入到FD236-6A后，在8mM CuSO4條件下該酵母還可以正常生長，說明PvABCT1基因的表達(dá)可以提高酵母細(xì)胞對銅的抗性，這可能是由于該基因與銅的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
該基因?qū)湍讣?xì)胞鎘的抗性無明顯作用。
實(shí)施例5、PvABCT1功能的進(jìn)一步驗(yàn)證1、液體培養(yǎng)基中酵母砷的抗性檢測為進(jìn)一步驗(yàn)證PvABCT1的功能，將對照菌株(FD236-6A酵母菌株)、插入空載體(pESPM)的菌株和表達(dá)PvABCT1基因的酵母菌株在1/2YPD液體培養(yǎng)基中30℃，200r/分鐘培養(yǎng)至OD600＝0.5，添加0.125mM砷于培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。分別測定它們的OD600值。測定結(jié)果表明，對照菌株、插入空載體的菌株和表達(dá)PvABCT1基因的酵母菌株在未添加砷的液體培養(yǎng)基中生長狀況幾乎一樣。在添加0.125mM砷的培養(yǎng)基中，三個(gè)菌株的生長都受到了抑制，而表達(dá)PvABCT1基因的酵母菌株比對照菌株和插入空載體的菌株的生長明顯緩慢，可見該基因的表達(dá)增加了酵母菌株的敏感性。
2、酵母對砷的吸收量測定挑取對照菌株(FD236-6A酵母菌株)、插入空載體的酵母菌株(pESPM)和經(jīng)上述菌落PCR鑒定表達(dá)有PvABCT1基因的酵母菌株分別接種于1/2YPD液體培養(yǎng)基中30℃，200r/分鐘培養(yǎng)至OD600＝0.5。添加0.125mM砷于培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。離心三種酵母細(xì)胞，收集上清，用10mM的EDTA將收集的酵母細(xì)胞洗滌三次，50℃烘干酵母細(xì)胞。消解礦化后用等離子體發(fā)射光譜儀(Induced coupled plasma，ICP)測定菌體中的砷含量。結(jié)果如圖3所示，表明表達(dá)PvABCT1基因的酵母菌株在As含量為0.125mM的1/2YPD液體培養(yǎng)基中的生長24小時(shí)后，吸收砷的量是對照菌株和插入空載體菌株的1.73倍。這表明在轉(zhuǎn)入該基因后，酵母細(xì)胞增強(qiáng)了對砷的吸收。FD236-A缺失了ACR3基因，向胞外運(yùn)輸砷能力減弱，PvABCT1基因的表達(dá)增加了酵母對砷的吸收，因而細(xì)胞更易受傷害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因的功能與ACR3基因的功能不同，因而證明該基因與砷的吸收有關(guān)。
序列表<160>2<210>1<211>2165<212>DNA<213>蜈蚣草(Pteris vittata L.)<400>1gctttttagt tttccccaac cctcaacgtt gtcgcggagg gaaaggccac cagttttgtt 60caatttcgca aatcctgttc ttcctttgcg ctgtcgtctc agttgccgcc cttctacttg 120caggaagaag ctcacgtaga agaaaatatt tagtgcagaa atatggcgtc agatgcaagc 180aagaagaagg cagctcaaaa gaaggcagct gctgcagcta agcgcggttc caaagccact 240gctactaatg caacctcgtc taaaactaat ggggtttcca attcatcccc aaatgaagtt 300gcagatgaga tggcctatat gcagataact gataggacat gtacaggaat ccttgcttcc 360catccacaat caagagatat tcatatcgaa agtctaacgg tgacatttca tggccatgat 420ctcattgtag attcgagcct cgaactcaac tatagaaggc gttatggatt gcttgggctg 480aatggttgtg gaaagtcgac tctcctgtca gccataggtt gccgtgagct acccattcca 540gagcatatgg atatttacca tttaactcgg gaaattgaag caactgactt gacctctctg 600caagccgttg taaacgtaga tgaagaaagg atcaagctag aaaaagaggc tgaaatgcta 660gctgctcagg atgatggtgg tggtgaggtt ctagaaagat tatatgagcg tttggaggct 720atggatgcag ctacagcaga gaagagggca gctgaaattt tgtatggtct gggtttcaac 780aaaagcatgc aacagaagaa gacccgggat ttttcaggcg gctggagaat gaggattgca 840ttagccagag cattgttcat gaacccaact attttactgc ttgatgaacc aacgaaccat 900cttgatctcg aagcctgtgt gtggcttgag gaaacattga agaagtttga ccgcattctt 960gtcgttgtat cacactctca ggattttctt aatggcatct gcacaaacat tatacatatg1020caaagtaaga agctgaagtt ctacacagga aattacgacc aatatgtcca aacccgtgaa1080gagctggaag aaaatcagat gaagcagtat aagtgggaac aagagcagat agcaaacatg1140aaagagtaca ttgccaggtt tgggcatggc tctgctaaac tagccaggca ggcacagagc1200aaggagaaga cattggcaaa gatggaaaga gggggtctca cagagagggt ggttaaggac1260
aaggtgcttg ttttccgatt tactgacgtt ggcaagttac ccccaccagt tctacaattt 1320gtggaggtgg actttggtta cactccagaa catatgatat acaagaaaat tgactttgga 1380gttgacctgg attcgaggat agctttggtt ggtcccaatg gagcaggtaa gagcactctt 1440ttgaagctta tgacgggcga attgtctccc attgatggca tggtgcggcg ccacaaccat 1500ttacggattg cgcagtttca ccagcatttg gcagataagc tgaatcttga tatgcctgcc 1560ctacagtaca tgatgtcgga atatcctggc ttagaagaag aaaagatgcg ggcagcgatt 1620ggaaggtttg ggctgactgg aaaggctcaa atcatgccca tgagaaatct atccgacggt 1680cagaggagtc gtgttatttt tgcttggtta gcttggcggt tacctcatat gctcctgctt 1740gatgaaccta cgaatcatct tgatattgag acaatagatg ctttggctga tgcattaaat 1800gaatgggatg gagggcttgt gcttgtgggt catgatttta ggcttatcaa ccaggtggcc 1860aaggagatct gggtttgtga gaaccaaaca gtgtcaaggt gggaaggtga cattatggac 1920ttcaaacagc acctaaaagc aaaagcaggc ctttgagatg gtgttgctta gaagattgaa 1980cttgagaggc catagccata tctactttta ataaagtagt aaagattttg cttttgatat 2040gaattattct caagatacga gaatgcctac ttggaagctc gtaatgaagc tttttatatt 2100gcttcatcat ttctgatcaa tatttataac actttcttct tgtagaaaaa aaaaaaaaaa 2160aaaaa 2165<210>2<211>597<212>PRT<213>蜈蚣草(Pteris vittata L.)<400>2Met Ala Ser Asp Ala Ser Lys Lys Lys Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Lys Arg Gly Ser Lys Ala Thr Ala Thr Asn Ala Thr Ser20 25 30Ser Lys Thr Asn Gly Val Ser Asn Ser Ser Pro Asn Glu Val Ala Asp
35 40 45Glu Met Ala Tyr Met Gln Ile Thr Asp Arg Thr Cys Thr Gly Ile Leu50 55 60Ala Ser His Pro Gln Ser Arg Asp Ile His Ile Glu Ser Leu Thr Val65 70 75 80Thr Phe His Gly His Asp Leu Ile Val Asp Ser Ser Leu Glu Leu Asn85 90 95Tyr Arg Arg Arg Tyr Gly Leu Leu Gly Leu Asn Gly Cys Gly Lys Ser100 105 110Thr Leu Leu Ser Ala Ile Gly Cys Arg Glu Leu Pro Ile Pro Glu His115 120 125Met Asp Ile Tyr His Leu Thr Arg Glu Ile Glu Ala Thr Asp Leu Thr130 135 140Ser Leu Gln Ala Val Val Asn Val Asp Glu Glu Arg Ile Lys Leu Glu145 150 155160Lys Glu Ala Glu Met Leu Ala Ala Gln Asp Asp Gly Gly Gly Glu Val165 170 175Leu Glu Arg Leu Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Met Asp Ala Ala Thr Ala180 185 190Glu Lys Arg Ala Ala Glu Ile Leu Tyr Gly Leu Gly Phe Asn Lys Ser195 200 205Met Gln Gln Lys Lys Thr Arg Asp Phe Ser Gly Gly Trp Arg Met Arg210 215 220Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Phe Met Asn Pro Thr Ile Leu Leu Leu225 230 235 240Asp Glu Pro Thr Asn His Leu Asp Leu Glu Ala Cys Val Trp Leu Glu245 250 255Glu Thr Leu Lys Lys Phe Asp Arg Ile Leu Val Val Val Ser His Ser
260 265 270Gln Asp Phe Leu Asn Gly Ile Cys Thr Asn Ile Ile His Met Gln Ser275 280 285Lys Lys Leu Lys Phe Tyr Thr Gly Asn Tyr Asp Gln Tyr Val Gln Thr290 295 300Arg Glu Glu Leu Glu Glu Asn Gln Met Lys Gln Tyr Lys Trp Glu Gln305 310 315 320Glu Gln Ile Ala Asn Met Lys Glu Tyr Ile Ala Arg Phe Gly His Gly325 330 335Ser Ala Lys Leu Ala Arg Gln Ala Gln Ser Lys Glu Lys Thr Leu Ala340 345 350Lys Met Glu Arg Gly Gly Leu Thr Glu Arg Val Val Lys Asp Lys Val355 360 365Leu Val Phe Arg Phe Thr Asp Val Gly Lys Leu Pro Pro Pro Val Leu370 375 380Gln Phe Val Glu Val Asp Phe Gly Tyr Thr Pro Glu His Met Ile Tyr385 390 395 400Lys Lys Ile Asp Phe Gly Val Asp Leu Asp Ser Arg Ile Ala Leu Val405 410 415Gly Pro Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Leu Met Thr Gly420 425 430Glu Leu Ser Pro Ile Asp Gly Met Val Arg Arg His Asn His Leu Arg435 440 445Ile Ala Gln Phe His Gln His Leu Ala Asp Lys Leu Asn Leu Asp Met450 455 460Pro Ala Leu Gln Tyr Met Met Ser Glu Tyr Pro Gly Leu Glu Glu Glu465 470 475 480Lys Met Arg Ala Ala Ile Gly Arg Phe Gly Leu Thr Gly Lys Ala Gln
485 490 495Ile Met Pro Met Arg Asn Leu Ser Asp Gly Gln Arg Ser Arg Val Ile500 505 510Phe Ala Trp Leu Ala Trp Arg Leu Pro His Met Leu Leu Leu Asp Glu515 520 525Pro Thr Asn His Leu Asp Ile Glu Thr Ile Asp Ala Leu Ala Asp Ala530 535 540Leu Asn Glu Trp Asp Gly Gly Leu Val Leu Val Gly His Asp Phe Arg545 550 555 560Leu Ile Asn Gln Val Ala Lys Glu Ile Trp Val Cys Glu Asn Gln Thr565 570 575Val Ser Arg Trp Glu Gly Asp Ile Met Asp Phe Lys Gln His Leu Lys580 585 590Ala Lys Ala Gly Leu59權(quán)利要求
1.蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有砷吸收作用的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述序列表中序列2具有兩個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域——ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于自N端第105-112位氨基酸殘基和417-424位氨基酸殘基；兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于序列表中序列2的自N端第252-257位氨基酸殘基和自N端第515-519位氨基酸殘基；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的信號區(qū)，位于序列表中序列2的自N端第217-231位氨基酸殘基；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征結(jié)構(gòu)域，位于自N端第73-313位氨基酸殘基。
3.編碼權(quán)利要求1所述蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，具有以下核苷酸序列之一1)序列表中序列1的多核苷酸序列；2)與序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同活性的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的編碼序列為自序列1的5’端第163-1956位核苷酸。
6.含有權(quán)利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的細(xì)胞系。
8.擴(kuò)增權(quán)利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中任一片段的引物。
9.權(quán)利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在治理砷污染中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有砷吸收作用的蛋白質(zhì)。其編碼基因具有以下核苷酸序列之一1)序列表中序列1的多核苷酸序列；2)與序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同活性的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的蜈蚣草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在砷的吸收和積累中起重要作用，將在修復(fù)砷污染環(huán)境的生物技術(shù)中起到重要作用。
文檔編號C12N15/29GK1760204SQ20041008085
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
發(fā)明者麻密, 何振艷, 徐文忠, 楊學(xué)習(xí) 申請人:中國科學(xué)院植物研究所