專利名稱：一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌及其用途。
背景技術(shù)：
有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus pesticides，OPs)由于具有低殘留、高效和使用成本低等特點(diǎn)，是目前品種多、產(chǎn)量高和應(yīng)用廣泛的農(nóng)用藥劑。有機(jī)磷農(nóng)藥的使用在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)和疾病媒介害蟲防治方面產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，但由于其對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性高和某些有機(jī)磷農(nóng)藥有潛在遲發(fā)性神經(jīng)毒性和對(duì)生態(tài)環(huán)境的負(fù)效應(yīng)。有證據(jù)表明，OPs具有誘變性和致畸胎性，哺乳動(dòng)物的神經(jīng)和免疫系統(tǒng)疾病大多都與OPs相關(guān)，這些疾病包括瘋牛病、海灣戰(zhàn)爭(zhēng)綜合癥、帕金森綜合癥等。因此，如何消除有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類的危害，已成為事關(guān)人類健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的問題。
減少農(nóng)藥的使用是解決農(nóng)藥危害的根本出路，殘留農(nóng)藥的去除也是減少農(nóng)藥危害的有效途徑。有機(jī)磷農(nóng)藥消除方法有許多，包括物理的、化學(xué)的、和生物的。傳統(tǒng)的物理方法(包裹、焚燒和掩埋)和化學(xué)方法(包括氧化、還原和水解)成本高，可能產(chǎn)生新的污染物，且作用相對(duì)較慢。利用生物或生物產(chǎn)品來(lái)降解污染物的生物修復(fù)方法具有無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是消除和解毒高濃度的農(nóng)藥殘留的一種安全、有效、廉價(jià)的方法。微生物具有種類多、變異快和基因容易操作等特點(diǎn)，是環(huán)境生物修復(fù)的重要生物資源。用微生物或無(wú)細(xì)胞酶制品來(lái)消減農(nóng)藥污染的生物修復(fù)技術(shù)顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌，該降解菌從山東高密市受有機(jī)磷農(nóng)藥長(zhǎng)期污染的土樣中分離出，具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥及含氮芳香烴類物質(zhì)的能力。
本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的用途，其用途是降解有機(jī)磷農(nóng)藥及含氮芳香烴類物質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌，其特征在于，該降解菌的分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)，于2004年09月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1221。
該降解菌(稱B2株)經(jīng)形態(tài)、生理生化特性分析和16s rRNA基因序列同源性分析，鑒定為變形細(xì)菌α-亞群中的根瘤菌科蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)，。B2株在pH8～9、溫度30℃左右生長(zhǎng)良好，能以甲基對(duì)硫磷為唯一碳源或磷源生長(zhǎng)。菌株B2表現(xiàn)對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素的抗性，但對(duì)利富霉素、氯霉素敏感。
采用薄板層析(TLC)、紫外光譜(UV)、氣譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)分析了菌株B2降解甲基對(duì)硫磷(MP)的中間產(chǎn)物，結(jié)果表明菌株B2水解甲基對(duì)硫磷產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(PNP)，PNP的進(jìn)一步代謝通過(guò)產(chǎn)生4-硝基鄰苯二酚(4-nitrocatechol，4-NC)和1，2，4-三羥基苯(1，2，4-trihydroxybenzene，THB)的途徑。采用氣相色譜法測(cè)定菌株B2對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解率，在起始菌的OD600為0.02時(shí)，B2在3小時(shí)內(nèi)可將100mg/L的甲基對(duì)硫磷降解99.2％。菌株B2可以以PNP為碳源生長(zhǎng)，在48小時(shí)內(nèi)，將50mg/kg的PNP完全降解；也可以以4-NC為碳源生長(zhǎng)，在60小時(shí)內(nèi)，將30mg/L4-NC完全降解。
本發(fā)明的可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的篩選1、土樣采自山東省高密市長(zhǎng)期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤；2、菌體的富集和分離將受有機(jī)磷污染的土樣混勻，稱取1g加入到含有50mg/L MP的富集培養(yǎng)基中，28℃，150r/min，搖床培養(yǎng)一周，按10％的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)過(guò)程中，MP的富集培養(yǎng)基中MP的濃度從50mg/L逐步提高到500mg/L；然后再轉(zhuǎn)入到含50mg/L MP的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，馴化傳6代，其間MP的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中MP的濃度從50mg/L逐步提高到300mg/L；用平板稀釋法將其涂布在含有100mg/L的MP的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，劃線純化，將純化后的單菌落再接入到含有100mg/L MP的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，選取生長(zhǎng)速度最快的一株菌株；該降解菌的分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)，于2004年09月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1221；所述的富集培養(yǎng)基的組分及配比為蛋白胨10g，葡萄糖1.0g，KH2PO41.0g，NaCl1.0g，重蒸水定容至1L，pH7.2，121℃高壓滅菌30min。
所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組分及配比為K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，NH4Cl 1g，KCl 0.5g，MgSO40.1g，F(xiàn)eCl220μg，對(duì)氨基苯甲酸0.9mg，煙酸0.9mg，微量元素溶液10ml，重蒸水定容至1.0L，pH7.0，121℃高壓滅菌30min。其中，微量元素溶液(L-1)(NH4)6Mo7O24·4H2O 20mg，H3BO350mg，ZnCl230mg，CoCl2·6H2O3mg，MnCl2·4H2O 10mg，(CH3COO)2Cu 10mg。
本發(fā)明提供的可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的鑒定與屬性1、形態(tài)與生理生化特征菌株B2在LB固體平板上菌落顏色為乳白色至乳黃色，圓形，邊緣整齊，低凸，臘狀，濕潤(rùn)，菌體呈桿狀，極生鞭毛，革蘭氏染色陰性，觸酶和氧化酶陽(yáng)性，在King’s培養(yǎng)基上不產(chǎn)生熒光色素，不產(chǎn)生果聚糖和膿青素，不水解七葉靈和明膠，能進(jìn)行反硝化作用，能利用葡萄糖產(chǎn)酸，能廣泛利用碳水化合物、有機(jī)酸、氨基酸為碳源，具體特征見表一。
表1.菌株B2的生理生化特征Tablel.Physiologicai and biochemical characteristics of strain B2


2、菌株B2的16s rRNA基因序列(AY661464116S rRNA for Ochrobactrum sp.B2(AY661464)AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCAGGC TTAACACATGCAAGTCGAGC GCCCCGCAAG GGGAGCGGCA GACGGGTGAG TAACGCGTGGGAACGTACCT TTTGCTACGG AATAACTCAG GGAAACTTGT GCTAATACCGTATGTGCCCT TCGGGGGAAA GATTTATCGG CAAAGGATCG GCCCGCGTTGGATTAGCTAG TTGGTGAGGT AAAGGCTCAC CAAGGCGACG ATCCATAGCTGGTCTGAGAG GATGATCAGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGGA CAATGGGCGC AAGCCTGATCCAGCCATGCC GCGTGAGTGA TGAAGGCCCT AGGGTTGTAA AGCTCTTTCACCGGTGAAGA TAATGACGGT AACCGGAGAA GAAGCCCCGG CTAACTTCGTGCCAGCAGCC GCGGTAATAC GAAGGGGGCT AGCGTTGTTC GGATTTACTGGGCGTAAAGC GCACGTAGGC GGACTTTTAA GTCAGGGGTG AAATCCCGGGGCTCAACCCC GGAACTGCCT TTGATACTGG AAGTCTTGAG TATGGTAGAGGTGAGTGGAA TTCCGAGTGT AGAGGTGAAA TTCGTAGATA TTCGGAGGAACACCAGTGGC GAAGGCGGCT CACTGGACCA TTACTGACGC TGAGGTGCGAAAGCGTGGGG AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAACGATGAATGT TAGCCGTTGG GGAGTTTACT CTTCGGTGGC GCAGCTAACG
CATTAAACAT TCCGCCTGGG GAGTACGGTC GCAAGATTAA AACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGCAGA ACCTTACCAG CCCTTGACAT ACCGGTCGCG GACACAGAGATGTGTCTTTC AGTTCGGCTG GACCGGATAC AGGTGCTGCA TGGCTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGT TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCTCGCCCTTAGT TGCCAGCATT TAGTTGGGCA CTCTAAGGGG ACTGCCGGTGATAAGCCGAG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCCTCAT GGCCCTTACGGGCTGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGTGG TGACAGTGGG CAGCGAGCACGCGAGTGTGA GCTAATCTCC AAAAGCCATC TCAGTTCGGA TTGCACTCTGCAACTCGAGT GCATGAAGTT GGAATCGCTA GTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGGGAGTTGGTTT TACCCGAAGG CGCTGTGCTA ACCGCAAGGA GGCAGGCGACCACGGTAGGG TCAGCGACTG GGGTGAAGTC GTAACAAGGT AACCGTA用BLAST軟件對(duì)菌株B2的16s rRNA的基因序列和Genbank中已經(jīng)登錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B2菌與多株蒼白桿菌屬的16s rRNA基因序列同源性高度相似(見表2)，說(shuō)明該菌在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上屬于蒼白桿菌。經(jīng)16S rRNA的測(cè)序并比較同源性后，依據(jù)同源性在系統(tǒng)發(fā)育中的分類原則并結(jié)合形態(tài)、生理生化特征，參考《Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology》第九版，最終將菌株B2歸類于變形細(xì)菌(Proteobacteria)，a-亞群(α-subdivision)根瘤菌科(Rhizobiaceae)蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)。
表2B2菌的16S rRNA基因序列的BLAST分析


3、抗生素抗性檢測(cè)菌株B2在含不同濃度的幾種抗生素的生長(zhǎng)情況見表3，可以看到，菌株B2表現(xiàn)對(duì)多種抗生素的抗性，對(duì)氨芐青霉素Ampicillin的抗性大于200μg/ml，對(duì)卡那霉素Kanamycin的抗性大于150μg/ml，對(duì)鏈霉素Streptomycin的抗性大于50μg/ml，對(duì)氯霉素chloramphenicol較敏感，抗性小于25μg/ml，而對(duì)利富霉素Rifampicin很敏感，在10μg/ml濃度下，該菌不能生長(zhǎng)。
表3B2在不同抗生素濃度下的生長(zhǎng)

+生長(zhǎng)良好，-不生長(zhǎng)本發(fā)明的可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的用途該菌株可降解有機(jī)磷農(nóng)藥中的有機(jī)磷物質(zhì)及含氮芳香烴類物質(zhì)。該菌株可用于受這些物質(zhì)污染的水體、土壤或農(nóng)產(chǎn)品的生物凈化。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1使用菌株B2降解甲基對(duì)硫磷利用氣相色譜法測(cè)定了菌株B2對(duì)MP的降解率，并用分光光度計(jì)測(cè)定了中間產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的產(chǎn)生和降解的量，以及菌株利用MP為碳源的生長(zhǎng)情況(見

圖1)。
在培養(yǎng)過(guò)程中，菌株B2可將MP快速降解，在培養(yǎng)3h后，MP的濃度已由起始的100mg/L降到0.805mg/L，而在此期間菌濃度幾乎沒有增加。在甲基對(duì)硫磷減少的同時(shí)伴隨其降解中間產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚濃度的增加，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，對(duì)硝基苯酚的濃度開始降低，32小時(shí)后全部降解。
實(shí)施例2菌株B2以對(duì)硝基酚(PNP)為碳源生長(zhǎng)及其對(duì)PNP的降解作用菌株B2先在50mg/L的PNP誘導(dǎo)培養(yǎng)，再接入到以50mg/L的PNP為碳源的無(wú)機(jī)鹽中檢測(cè)其生長(zhǎng)以及PNP的降解情況。從圖2中可以看出，菌株B2能以PNP為碳源生長(zhǎng)，同時(shí)將PNP降解，當(dāng)PNP的濃度為50mg/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)的延滯期小于4小時(shí)，培養(yǎng)24小時(shí)后菌株B2達(dá)到生長(zhǎng)高峰，隨著菌密度的增加，PNP的量在減少，在48小時(shí)內(nèi)，菌株B2將50mg/L的PNP完全降解。在培養(yǎng)的前8個(gè)小時(shí)，PNP的濃度降低比較緩慢，隨后降解速度加快，這可能是由于培養(yǎng)一段時(shí)間后，降解PNP的酶系被誘導(dǎo)，從而加速PNP的降解產(chǎn)生。
實(shí)施例3菌株B2以對(duì)硝基鄰苯二酚(4-NC)為碳源生長(zhǎng)及其對(duì)4-NC的降解作用將1ml的B2種子液接入到含不同濃度的4-NC的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，濃度分別為10、20、30、40、50mg/L，測(cè)定棕褐色的4-NC的消失情況。培養(yǎng)3天發(fā)現(xiàn)10、20、30mg/L的4-NC培養(yǎng)液中變?yōu)闊o(wú)色，而40、50mg/L 4-NC的培養(yǎng)液中，4-NC的濃度沒有改變。因此，我們選用不抑制菌株代謝4-NC的最高濃度，即30mg/L作為試驗(yàn)濃度，測(cè)定菌株B2在以30mg/L 4-NC為碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況以及菌株降解4-NC的情況，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，菌株B2的生長(zhǎng)經(jīng)歷一段時(shí)間的延滯期(12h)，可能在此期間，降解所需的中間酶系(如苯環(huán)類化合物羥化開環(huán)的單加氧酶、雙加氧酶)被誘導(dǎo)生成，經(jīng)過(guò)這段時(shí)間后，菌體才能分解并利用4-NC作為生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而快速生長(zhǎng)，在60小時(shí)內(nèi)，30mg/L的4-NC幾乎完全被降解。
<110>中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所<120>一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌及其用途<130>FPI04221<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1447<212>DNA<213>Ochrobactrum sp.B2<400>1agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc 60gccccgcaag gggagcggca gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtacct tttgctacgg120aataactcag ggaaacttgt gctaataccg tatgtgccct tcgggggaaa gatttatcgg180caaaggatcg gcccgcgttg gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg240atccatagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc300ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc360gcgtgagtga tgaaggccct agggttgtaa agctctttca ccggtgaaga taatgacggt420aaccggagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct480agcgttgttc ggatttactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggacttttaa gtcaggggtg540aaatcccggg gctcaacccc ggaactgcct ttgatactgg aagtcttgag tatggtagag600gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc660gaaggcggct cactggacca ttactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg720attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgt tagccgttgg ggagtttact780cttcggtggc gcagctaacg cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa840aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc900aacgcgcaga accttaccag cccttgacat accggtcgcg gacacagaga tgtgtctttc960agttcggctg gaccggatac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgcccttagt tgccagcatt tagttgggca 1080ctctaagggg actgccggtg ataagccgag aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat 1140ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg cagcgagcac 1200gcgagtgtga gctaatctcc aaaagccatc tcagttcgga ttgcactctg caactcgagt 1260gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1320gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggttt tacccgaagg cgctgtgcta 1380
accgcaagga ggcaggcgac cacggtaggg tcagcgactg gggtgaagtc gtaacaaggt 1440aaccgta 144權(quán)利要求
1.一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌，其特征在于，該降解菌的分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)，于2004年09月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1221。
2.一種權(quán)利要求所述可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的用途該菌株用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥及含氮芳香烴類物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌，該降解菌的分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)，于2004年09月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1221。用途為該菌株用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥及含氮芳香烴類物質(zhì)；可用于受這些物質(zhì)污染的水體、土壤或農(nóng)產(chǎn)品的生物凈化。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1754958SQ200410081019
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者邱星輝, 柏文琴, 李梅, 何風(fēng)琴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所