專利名稱：人血清蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化學技術領域。具體涉及一種人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白。
背景技術：
血清蛋白是血漿的重要成分，也是許多內源因子和外源藥物的載體，正常情況下不易透過腎小球。人血清蛋白(HSA，序列1)是一種585個氨基酸組成的蛋白質(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，1982，7971-75)，其分子量約為66.5KD，血漿半衰期長達2周以上。HSA在細胞中是以一種含18個氨基酸殘基的信號肽和6個前肽的原肽形式合成的，信號肽和前肽在轉運和分泌過程被切除。HSA已成功地在多種宿主中表達(EP330451和EP361991)。
促紅細胞生成素(EPO)是30.4千道爾頓的糖蛋白細胞因子，其促進紅細胞祖細胞的增生并維持它們分化成成熟的紅細胞(Kranta，Blood，77419-434，1991)。EPO在成年人的腎和胎兒的肝中產(chǎn)生。在成年人中，EPO主要是腎細胞應答缺氧或貧血而產(chǎn)生的，并在血液中循環(huán)。EPO幾乎只與骨髓祖細胞表面上的66KDa的特異性受體(EPO-Rc)結合。EPO-Rc與EPO結合后，受體被激活，并發(fā)生同源二聚化，之后，發(fā)生酪氨酸磷酸化。隨后，又發(fā)生一系列細胞內的信號轉導，從而增加祖細胞的數(shù)量，并促進祖細胞分化成成熟紅細胞(Lodish et al.，Cold Spring Harbor Syamp.Bio.，6093-104，1995)。
重組人EPO(rHuEPO)已廣泛應用于治療腎臟疾病引起的貧血，腫瘤病人化療后引起的貧血，外傷引起的大出血，以及骨髓發(fā)育不良綜合癥所引起的貧血，即可以刺激患者自身的造血功能，彌補各種原因引起的紅細胞減少。因EPO只是造血因子的一種，另有其他造血因子能刺激血細胞的生長發(fā)育(如粒細胞和淋巴細胞等)，因此，世界上已有幾種構建復合性刺激因子的例子，如IL3-EPO，EPO-GM-CSF(Antonio M et al，US Patent 5916773)。復合因子的構建是根據(jù)其自身功能，同時又具有雙重協(xié)調作用。
正常人血清中的EPO濃度約為0.01-0.03U/ml。補充EPO是一種理想的對EPO產(chǎn)生減少的腎衰竭的治療方法。靜脈內注射的rHuEPO的血清清除半衰期約為4到13小時。皮下注射rHuEPO的血清最高濃度為注射后的5到25小時，清除半衰期為17小時。因此，相同劑量皮下注射比靜脈注射在血液中具有更長的保留時間。
盡管利用生物工程技術生產(chǎn)的EPO已廣泛應用于臨床，但仍有不足之處。EPO產(chǎn)生于腎臟，作用于骨髓，然而它的分子量較低，由腎臟產(chǎn)生進入血液循環(huán)后，可很快由腎臟經(jīng)尿液排除，半衰期比較短，需要比較頻繁用藥。這種長期頻繁用藥不久增加了病人的痛苦和治療費用，而且易產(chǎn)生毒副反應。為了提高EPO分子的半衰期，增長其在血液中的停留時間以發(fā)揮更長功效，研究人員進行了各方面的實驗，如用聚乙二醇修飾蛋白，用化學方法將蛋白連接成二聚體及多聚體，用基因工程方法生產(chǎn)二聚體及三聚體等，其結果均是為增大分子量，延長其體內循環(huán)時間。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計能延長EPO的半衰期的融合蛋白。
本發(fā)明提供了一種編碼人血清蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白HSA-L-EPO的DNA序列，該序列包括與人血清蛋白HSA氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與促紅細胞生成素EPO氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)的融合蛋白的DNA序列，中間含有連接肽Linker的DNA。
序列1是HSA-L-EPO DNA序列序列2是HSA DNA序列序列3是EPO DNA序列序列4是Linker DNA序列序列1、2、3、4都是從5’端至3’端本發(fā)明還提供了一種人血清蛋白HSA與促紅細胞生成素EPO的融合蛋白，該融合蛋白包括與HSA 85％～95％序列同源的第一區(qū)和與EPO 85％～95％序列同源的第二區(qū)。其中優(yōu)選的是包括與HSA至少95％序列同源的第一區(qū)與EPO至少95％序列同源的第二區(qū)。最優(yōu)選的是包括與HSA序列相同的第一區(qū)和與EPO序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸的取代、缺失或加入得到的多肽。
在本發(fā)明的融合蛋白中，可以是HSA位于融合蛋白的N末端，EPO位于融合蛋白的C末端；也可以是EPO位于融合蛋白的N末端，HSA位于融合蛋白的C末端。其中主要以前者進行闡述。
為了使融合蛋白兩部分有較大的間隔，EPO區(qū)域有最大的柔性，最大可能地與其受體結合，在HSA與EPO之間設有連接肽，所述的連接肽是具有10-20個相同或不同的氨基酸連接順序，主要由甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸組成。
本發(fā)明利用HSA半衰期長的特點，用基因工程方法制造出人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白。經(jīng)過初步實驗證明，該融合蛋白具有和EPO一樣的生物功效，而且延長了EPO的半衰期，進而減少了用藥次數(shù)。
本發(fā)明的又一目的是提供攜帶編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列的重組表達載體。該重組表達載體包括pcDNA3。
本發(fā)明的再一個目的是提供表達本發(fā)明融合蛋白編碼基因的宿主，該宿主可以是被重組表達載體或表達載體的一部分轉化，含有本發(fā)明融合蛋白編碼基因的細菌、酵母、動物細胞或植物細胞，其中優(yōu)選的是動物細胞。
本發(fā)明將血清白蛋白分子，或至少85％序列同源的類似物與EPO，或其至少85％序列同源的類似物融合，所形成的融合蛋白既保留了與EPO受體結合的活性，同時與EPO相比，又延長了其血漿半衰期。
編碼HSA的多聚核苷酸和編碼EPO的多聚核苷酸可以用本領域周知的方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法、人工合成的方法和構建篩選cDNA文庫的方法等獲得。用作PCR模板和用于構建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應mRNA或cDNA的組織、細胞及文庫等。也可以用人工合成的方法獲得，人工合成時，可以選擇宿主偏愛的密碼子，這樣往往可以提高產(chǎn)物的表達。
HSA基因和EPO基因的融合，在保持各自閱讀框架不變的前提下，可以用本領域周知的方法，如通過PCR方法，在編碼序列的兩側引入限制性內切酶識別位點，通過酶切產(chǎn)生粘性末端，HSA基因和EPO基因的粘性末端用DNA連接酶連接，從而獲得編碼融合蛋白的基因。
本發(fā)明還有一個目的是提供了用基因工程方法生產(chǎn)HSA-L-EPO融合蛋白的制備方法。該方法包括下列步驟1、獲得HSA基因從肝臟組織中提取信使核糖核酸(mRNA)利用RT-PCR方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸(cDNA)，經(jīng)過分離純化后，將HSA cDNA克隆到載體上，獲得HSA基因重組子(圖1)。
2、獲得EPO基因從工程菌中提取DNA，利用PCR方法獲得EPO基因(圖2)。
3、獲得連接肽(Linker)編碼基因用固相合成法合成Linker編碼基因。
4、獲得Linker-EPO編碼基因設計引物，利用PCR搭橋的方式將Linker和EPO編碼基因連接成一個完整的編碼基因，并克隆到載體上獲得重組子(圖2)。
5、獲得HSA-L-EPO編碼基因通過限制性內切酶分別酶切HSA重組子和Linker-EPO基因，然后再連接成HSA-L-EPO融合基因。
6、獲得重組質粒，并將該質粒轉化進入動物細胞株如中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)或猴的腎細胞(COS)細胞株(圖3)。
以下詳細描述制備方法，其中所使用的材料包括一、細胞株包括CHO細胞株、COS細胞株。
菌株包括大腸桿菌菌株DH5α、TOP10；質粒pBlueScript(PBS)、pUC18、真核細胞表達質粒pcDNA3二、酶類(TaKaRa公司)限制性內切酶、DAN聚合酶、T4DAN連接酶、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒。
三、主要生化試劑和材料EPO標準品(地奧)、dNTP(TaKaRa)、瓊脂糖(TaKaRa)、氨卞青霉素(Sigma)、G418(Sigma)、蛋白質分子量標準(Sigma)、DNA分子量標準(TaKaRa)、EPO ELISAKit(R&D)


圖1是HSA cDNA的合成及重組質粒的構建。
圖2是Linker-EPO cDNA的合成及重組質粒的構建。
圖3是獲得HSA-L-EPO編碼基因圖4是構建融合基因的DNA電泳示意5是純化的融合蛋白電泳6是HSA-L-EPO融合蛋白與EPO血清清除時間圖
具體實施例方式實施例1 HSA cDNA的克隆取正常人肝臟組織，用RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)分離總RNA，用通用RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)一步法合成HSA的cDNA。所用的引物為hsa15’-GACAAGCTTATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC-3’hsa25’-GAAGGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3’引物hsa1 5’端含有HindIII位點，hsa2 3’端含有BamHI位點。
RT-PCR一步法為100μl反應體系中加入2μl逆轉錄酶、2μlTaq酶，10μmol/L的hsa1和hsa2引物各4μl，2.5mmol/LdNTP 10μl，25mmol/LMgcl220μl，10x反應緩沖液10μl，RNA2μl。用Eppendorf Mastercycler PersonalPCR儀，RT-PCR條件為50℃逆轉錄30分鐘；94℃預變性2分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘；30個循環(huán)后，再72℃延伸10分鐘。通過凝膠電泳分析反應物顯示出預期大小(1.8KB)的條帶，PCR產(chǎn)物電泳純化，用DNA片段膠回收試劑盒(OMIGA公司)回收純化約1.8KB的目標帶。用HindIII和BamHI酶切純化的HSA cDNA，以試劑盒純化后，克隆到HindIII/BamHI酶切的PBS質粒上。采用常規(guī)的堿裂解方法提取質粒對重組子進行鑒定，并測序進一步確認。
實施例2 連接肽cDNA和EPO cDNA的融合取本公司的EPO工程菌，用DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提取DNA，PCR擴增EPO的cDNA。所用的引物為epo15’-GCCCCACCACGCCTCATCTG-3’epo25’-GTTGCGGCCGCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAAG-3’引物epo2 5’端含有NotI位點，便于克隆到表達載體中。
PCR反應100μl反應體系中加入0.5μl pfu酶，10μmol/L的epo1和epo2引物各4μl，2.5mmol/LdNTP 8μl，10x反應緩沖液10μl，DNA 2μl，H2O補足100μl。用Eppendorf Mastercycler Personal，RT-PCR條件為94℃預變性2分鐘；94℃變性45秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后，再72℃延伸5分鐘。通過凝膠電泳分析反應物顯示出一預期大小(約500bp)的條帶，PCR產(chǎn)物電泳純化，用DNA片段膠回收試劑盒(OMIGA公司)回收純化約500bp的目標帶。
采用固相合成法合成一段DNA序列，其中5’端設計為BamHI酶切位點，并帶有三個酶切位點保護堿基，便于和HSA基因融合；3’端和EPO編碼基因的5’端有20bp的互補區(qū)，便于通過PCR搭橋方式和EPO基因進行融合。中間是Linler的序列，以下橫線標出。合成的DNA序列為
GAAGGATCCGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGTGGAGGCTCCGGAGGCGGAGGTTCAGCCCCACCACGCCTCATCTG以EPO和合成的DNA片段為混合模板，用引物lin1和epo2進行搭橋PCR擴增Linker-EPO DNA片段lin15’-GAAGGATCCGGCGGAGGTG-3’搭橋PCR反應100μl反應體系中加入0.5μl pfμ酶，10μmol/L的lin1和epo2引物各4μl，2.5mmol/L dNTP 8μl，10x反應緩沖液10μl，合成DNA片段1μl，EPO cDNA片段1μl。用Eppendorf Mastercycler Personal，PCR條件為94℃預變性2分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后，再72℃延伸10分鐘。通過凝膠電泳分析反應物顯示出一預期大小(約600bp)的條帶，PCR產(chǎn)物電泳純化，用DNA片段膠回收試劑盒(OMIGA公司)回收純化約600bp的目標帶，BamHI/NotI酶切后，克隆到pBlueScript質粒上。采用常規(guī)的堿裂解方法提取質粒對重組子進行鑒定，并測序進一步確認。重組子命名為pBS-LEPO實施例3 HSA cDNA與EPO cDNA的融合采用常規(guī)的DNA重組法將HSA基因和帶有Linker的EPO基因進行融合以BamHI和NotI雙酶切pBS-LEPO質粒，切下Linker-EPO片段，酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳，切割下600bp的片段，用DNA片段膠回收試劑盒(OMIGA公司)回收純化，然后克隆到pBS-HSA質粒中，這樣HSA基因和Linker以及EPO基因融合成了一個完整的基因。采用常規(guī)的堿裂解方法提取質粒對重組子進行鑒定，得到的重組子命名為pBS-HLE。然后將編碼HSA-L-EPO融合蛋白的完整基因插入到哺乳動物表達載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和NotI位點。最終的表達質粒(稱為pcDNA3-HLE)含有在哺乳動物細胞高水平表達所需要的巨細胞病毒早期基因啟動子-增強子。該質粒還含有可選擇性標記基因，從而在細菌中具有氨芐青霉素抗性，而在哺乳動物細胞中具有G418抗性。另外，當宿主細胞DHFR基因表達缺陷時，pcDNA3-HLE表達載體含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，從而能在氨甲蝶呤(MTX)存在下共擴增HSA-L-EPO融合基因和DHFR基因(美國專利No.4399216)。
實施例4 在轉染的細胞系中融合蛋白的表達將重組pcDNA3-HLE表達質粒轉入哺乳動物宿主細胞系，以表達HSA-L-EPO融合蛋白。為了穩(wěn)定高水平的表達，優(yōu)選的宿主細胞系是DHFR酶缺陷的CHO細胞(美國專利No.4818679)。轉染的方法可以是電轉化、脂質體轉化、原生質融合等方法。本發(fā)明采用脂質體(GeneTherapy Systems，Inc.)轉染，8μg線性化的DNA加入200μl DNA稀釋液，混勻后，室溫靜置5分鐘，再加入無血清培養(yǎng)基稀釋的脂質體200μl，混勻后再室溫靜置5分鐘，然后滴加到細胞覆蓋度為50-70％的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染2天后，將培養(yǎng)基改成含0.4mg/mlG418的生長培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)，對重組細胞進行富集培養(yǎng)。用人EPO抗體進行ELISA檢測，判斷富集后的重組子是否分泌融合蛋白。同時取部分細胞，提取DNA進行PCR檢測，判斷融合基因是否重組入CHO細胞基因組中。通過ELISA和PCR檢測證明，融合基因成功轉入CHO細胞中。
為了實現(xiàn)融合蛋白較高水平的表達，用受MTX藥物抑制的DHFR基因進行共擴增。在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，轉染的融合蛋白基因與DHFA基因共擴增。能在高達1μg/ml MTX培養(yǎng)基中生長的轉染子，再次通過極限稀釋法進行亞克隆。通過測定分泌率，對亞克隆的細胞系進行進一步的分析。分泌率超過10(較佳遞約30)μg/106(即百萬個)細胞/24小時的細胞系，適合使用無血清培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)。然后用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。
糖側鏈結構對于EPO的體內活性是關鍵的。Asn-連接的碳水化合物的末端糖鏈含有唾液酸，重復的聚-N-乙酰乳糖酰胺和半乳糖。已知在一些哺乳動物細胞，例如NSO細胞中表達的重組EPO，得到的是具有低唾液酸含量的蛋白質。除去唾液酸會導致暴露次末的半乳糖殘基，這提高了肝唾液酸糖蛋白質結合性凝集素的親活力。該捕獲途徑導致在整個動物內測量的體內生物活性下降。在CHO細胞中產(chǎn)生的重組EPO顯示與天然EPO中發(fā)現(xiàn)的非常相似的糖基化模式(PNAS，867812-22，1989)。根據(jù)本發(fā)明表達和生產(chǎn)的HSA-L-EPO融合蛋白，當與EPO基于摩爾比較時，顯示出更長的半衰期。
實施例5 融合蛋白的純化和定性將培養(yǎng)的細胞上清液進行超濾，然后將超濾濃縮的樣品以DEAESepharose Fast Flow進行純化，以PBS(pH7.0)進行洗脫，收集樣品峰，再以反相柱(Source15)進行純化，收集乙醇濃度在50％-80％之間的樣品峰，再上一次DEAE SepharoseFast Flow柱，去掉乙醇，濃縮樣品體積后，以分子篩Superdex 200進行層析，最后得到純品。
圖6為純化后融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
實施例6 體外生物活性分析可測定轉染子的上清夜或純化蛋白刺激TF-1細胞的增殖能力(Kitamura等，J.Cell.Physiol.，140323-334，1989)。TF-1細胞在細胞表面表達EPO-Rc，并對EPO反應。將細胞維持在生長培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10％FCS和1-5ng/ml人IL-5)。收集對數(shù)期的TF-1細胞，并用分析培養(yǎng)基洗滌(不含IL-5的生長培養(yǎng)基)。將每份共1×104個細胞的TF-1樣品(50μl)加到96孔組織培育板的各孔中，用50μl含有0.01-100nM各種HSA-L-EPO融合蛋白或EPO對照的分析培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。在37℃、5％CO2濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)該平板4天，然后在各孔中添加10μlMTT(用PBS配制成2.5mg/ml)。4小時后，在每孔中加入100μl 10％SDS的0.01M HCl，以融解細胞和Formazan。然后在550對該平板進行讀數(shù)，其中參考光束設為690nm。OD讀數(shù)相對于EPO或融合蛋白作圖。因此可以定量地比較融合蛋白相對于EPO的生物活性。較佳地按摩爾計，重組融合蛋白的活性應不低于EPO的活性。在本發(fā)明的一實施例中，HSA-L-EPO融合蛋白的比活力約為4-5×104U/umol，而EPO約為3-4×104U/umol。
實施例7 大鼠內體內生物活性動力學研究通過尾靜脈進行靜脈注射或通過皮下注射，將100單位的EPO或HSA-L-EPO融合蛋白注射入小鼠。注射相同體積的PBS作為對照。分別在用藥前和用藥后不同時間點(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9天)取小鼠尾靜脈血，常規(guī)測定每日的網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)，直到網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)低于用藥前水平。將網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)對時間點作圖(圖6)，以計算循環(huán)時間。融合蛋白HSA-L-EPO在小鼠血漿中的代謝速度明顯比EPO對照慢，表明小鼠中融合蛋白的半衰期更長。
序列1是HSA-L-EPO DNA序列aagcttatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc 60aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg 120ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 180ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 240gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 300tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 360gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 420ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 480ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 540cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 600gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggt ttcgtctgcc 660aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 720gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 780gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 840gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 900ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 960aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1020
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gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa 1830序列3是EP0DNA序列gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gttctggaga ggtacctctt ggaggccaag 60gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 120gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 180gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 240ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 300ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag cccagaagga agccatctcc 360cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 420ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 480tgcaggacag gggacagatg a501序列4是Linker DNA序列ggatccggcg gaggtggaag cggcggtgga ggctccggag gcggaggttc a5權利要求
1.一種編碼人血清蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白HSA-L-EPO的DNA序列，其特征在于該融合蛋白的DNA序列如下，該序列包括與人血清蛋白HSA氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與促紅細胞生成素EPO氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)的融合蛋白的DNA序列，中間含有連接肽Linker的DNA。aagcttatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc 60aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg 120ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 180ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 240gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 300tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 360gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 420ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 480ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 540cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 600gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggt ttcgtctgcc 660aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 720gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 780gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 840gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 900ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 960aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1020gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1080gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1140accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1200gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt 1260tttgagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa 1320gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc 1380agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc 1440gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcacc 1500aaatgctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat 1560gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc 1620acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gcttgtgaaa 1680cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt 1740gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa 1800cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttaggatccg gcggaggtgg aagcggcggt 1860ggaggctccg gaggcggagg ttcagcccca ccacgcctca tctgtgacag ccgagttctg 1920gagaggtacc tcttggaggc caaggaggcc gagaatatca cgacgggctg tgctgaacac 1980tgcagcttga atgagaatat cactgtccca gacaccaaag ttaatttcta tgcctggaag 2040aggatggagg tcgggcagca ggccgtagaa gtctggcagg gcctggccct gctgtcggaa 2100gctgtcctgc ggggccaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga gcccctgcag 2160ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg 2220ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca 2280atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag 2340ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatgagcggc cgc 2393
2.根據(jù)權利要求1所述的人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白，它包括與人血清白蛋白85％～95％序列同源的第一區(qū)和與人促紅細胞生成素至少85％～95％序列同源的第二區(qū)。
3.根據(jù)權利要求2所述的人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人血清白蛋白95％序列同源的第一區(qū)和與人促紅細胞生成素95％同源的第二區(qū)。
4.根據(jù)權利要求3所述的人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基相同的第一區(qū)和與人促紅細胞生成素氨基酸殘基相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
5.根據(jù)權利要求4所述的人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白，其特征在于所述的功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6.根據(jù)權利要求1所述的人血清白蛋白與人促紅細胞生成素的融合蛋白，其特征在于所述的與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N-端，所述與人促紅細胞生成素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C-端。
7.根據(jù)權利要求1所述的人血清白蛋白與人促紅細胞生成素的融合蛋白，其特征在于所述的與人促紅細胞生成素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N-端，所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C-端。
8.根據(jù)權利要求書1-7中任一項所述的人血清白蛋白與人促紅細胞生成素的融合蛋白，其特征在于所述第一區(qū)和第二區(qū)之間設有連接肽，連接肽是具有10-20個相同或不同的氨基酸連接順序，主要由甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸組成，連接肽的DNA序列如下。ggatccggcg gaggtggaag cggcggtgga ggctccggag gcggaggttc a51
9.根據(jù)權利要求1所述的一種生產(chǎn)人血清白蛋白與人促紅細胞生成素的融合蛋白HSA-L-EPO的制備方法，該方法包括下列步驟①獲得HSA基因從肝臟組織中提取信使核糖核酸mRNA利用RT-PCR方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸cDNA，經(jīng)過分離純化后，將HSA cDNA克隆到載體上，獲得HSA基因重組子；②獲得EPO基因從工程菌中提取DNA，利用PCR方法獲得EPO基因；③獲得連接肽Linker編碼基因用固相合成法合成Linker編碼基因；④獲得Linker-EPO編碼基因設計引物，利用PCR搭橋的方式將Linker和EPO編碼基因連接成一個完整的編碼基因，并克隆到載體上獲得重組子；⑤獲得HSA-L-EPO編碼基因通過限制性內切酶分別酶切HSA重組子和Linker-EPO基因，然后再連接成HSA-L-EPO融合基因；⑥獲得重組質粒，并將該質粒轉化進入動物細胞株如中國倉鼠卵巢癌細胞CHO或猴的腎細胞COS細胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人血清白蛋白與促紅細胞生成素的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA序列，攜帶該DNA序列的細菌、動物細胞等。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人促紅細胞生成素至少85％序列同源的第二區(qū)，并且在第一區(qū)和第二區(qū)之間設有連接肽。連接肽是具有10－20個相同或不同的氨基酸連接順序，主要由甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸組成。本發(fā)明的融合蛋白既具有人促紅細胞生成素的活性，并且延長了半衰期，有較好的應用價值。
文檔編號C12N15/85GK1727488SQ200410053319
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月30日 優(yōu)先權日2004年7月30日
發(fā)明者茍興華, 黃迎春, 韓雷, 李德華, 趙蘭英, 吳洽慶, 陳守春, 劉忠榮, 李伯剛 申請人:成都地奧制藥集團有限公司