專利名稱：人新基因irtks及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種與人胰島素受體酪氨酸激酶底物P53(IRSP53)同源的新基因IRTKS(Insulin Receptor Tyrosine Kinase Substrate)及其編碼蛋白。本發(fā)明還涉及該基因和其編碼蛋白的制備方法，含有該基因的載體和轉(zhuǎn)化體，以及其編碼蛋白的抗體。
背景技術(shù)：
人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project，HGP)的主要目標(biāo)是完成人類基因組中3×109個堿基測序，從中剖譯人類的全部遺傳密碼。在基因組中起編碼基因的序列僅約占3％，基因間有大量非編碼區(qū)，且每個基因內(nèi)部又有內(nèi)含子序列間隔，故通過基因組測序策略發(fā)現(xiàn)新基因的速度受到限制。表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，簡稱ESTs)是指基因組中能轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列，且從構(gòu)建的某組織cDNA文庫中，隨機(jī)挑選克隆所測序的cDNA序列片段，它在人類基因組研究中具有舉足輕重的作用。大規(guī)模ESTs是一種有效了解組織表達(dá)譜的手段，隨著高通量、大規(guī)模測序技術(shù)的進(jìn)步與完善?？梢韵嘈磐ㄟ^EST測序，結(jié)合生物信息學(xué)的手段，將使人們繪制基因組的轉(zhuǎn)錄圖譜成為現(xiàn)實(shí)。同時(shí)，亦將提供一種快速有效發(fā)現(xiàn)新基因的手段。對不同組織或同一組織不同狀態(tài)基因表達(dá)譜的比較，可對特定組織或細(xì)胞的功能作深入的了解。因而，ESTs計(jì)劃可使人類基因組計(jì)劃提前進(jìn)入功能基因組學(xué)的研究，當(dāng)人類基因組測序全部完成后，可將ESTs與其相比較，這將大大增強(qiáng)從基因組序列中識別基因的能力。此外，ESTs在分析基因組復(fù)雜基因的結(jié)構(gòu)中起重要作用，如內(nèi)含子過大、不同的剪切方式及不同基因共用同一外顯子等。因此大規(guī)模ESTs測序和基因組測序同時(shí)進(jìn)行，將有助于理解基因組序列的結(jié)構(gòu)和功能。
腎上腺作為下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary adrenal，HPA)軸的重要組成部分，在機(jī)體應(yīng)激防御、環(huán)境適應(yīng)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、免疫調(diào)控及生殖中具有重要的功能，且在糖、脂肪、水、電解質(zhì)代謝中亦有重要作用。目前，已有用ESTs對一些組織細(xì)胞，如心臟、骨骼肌及CD+造血干細(xì)胞作了基因表達(dá)研究。通過公共數(shù)據(jù)庫搜尋，僅有少量ESTs來自正常腎上腺組織，不足以描繪出基因表達(dá)譜。
本研究旨在利用大規(guī)模ESTs策略，建立正常腎上腺組織的基因表達(dá)目錄，通過對正常人腎上腺組織表達(dá)基因的進(jìn)一步分析，可更好地理解基因的已知功能、闡明未知功能、澄清調(diào)控機(jī)制及新的反饋通路，為腎上腺的生理功能及病理生理過程研究打下基礎(chǔ)。
人類基因組計(jì)劃(HGP)將使下世紀(jì)或更長時(shí)間的生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的探索方式發(fā)生革命性的變化，全基因組測序的迅速進(jìn)展，人們將在全基因組范圍闡明DNA的功能，目前已從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)逐漸進(jìn)入功能基因組學(xué)的研究階段，對基因組功能的理解亦有賴于在蛋白組范圍對蛋白功能的理解，同時(shí)有助于澄清非編碼序列的作用。大規(guī)模確定基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白產(chǎn)物的特性，將加快對基因組功能的認(rèn)識，因而克隆人類全部基因的全長cDNA必須作為優(yōu)先考慮?？梢婋S著大量新基因的克隆，將會加深對人體重要生理功能的理解，為揭示生命的奧秘奠定基礎(chǔ)。進(jìn)入90年代以來，隨著大量EST的產(chǎn)生以及生物信息學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)新基因的速度日見加快，截止2000年3月GenBank中人類全長cDNA數(shù)量已達(dá)4.5萬條。此外，全長cDNA克隆將有助于了解基因在轉(zhuǎn)錄后復(fù)雜的變異形式，如同一基因的不同剪切方式或不同基因外顯子的共用。
腎上腺作為重要的內(nèi)分泌器官，在人體的生長、發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生殖等過程中發(fā)揮重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近幾年已從腎上腺組織中克隆到一些新的重要功能蛋白。Kitamura于1993年從嗜鉻細(xì)胞瘤組織中分離一種新的降血壓肽，稱為腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin)。DAX-1作為核受體超家族中的特殊成員，主要表達(dá)在腎上腺和睪丸，DNA結(jié)合功能域與其它核受體成員不同。類固醇生成因子(Steroidogenic factor 1，SF1)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，選擇性表達(dá)類固醇激素分泌細(xì)胞，可調(diào)節(jié)多種參與類固醇生成的基因表達(dá)。因此對腎上腺組織作大規(guī)模EST測序，結(jié)合生物信息學(xué)手段，可能克隆許多新的基因，其中可能包括一些具有重要功能的基因。
新全長cDNA克隆的策略主要包括以下幾種直接測序或引物步移通過DNA Strider 1.2軟件對AD、Cu及嗜鉻細(xì)胞瘤(PC)cDNA文庫中的已知ESTs和新ESTs的序列作進(jìn)一步分析，若克隆中可能含完全的開放閱讀框架(Open reading frame，ORF)，克隆用3′端引物(T75′-TAATACGACTCACTATAGGG)測序。如不能測通，再設(shè)計(jì)引物向中間延伸測序，全部測通即可獲得新的全長eDNA。
芯片拼接芯片拼接也稱電子克隆(In silico cloning)，若文庫中的克隆不含全部的ORF，將已知ESTs序列在dbEST數(shù)據(jù)庫中作同源搜尋，通過不斷與dbEST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，從中找出部分重疊的人ESTs，經(jīng)Autoassemler軟件將其組裝成Contig序列，可能得到一個完整的ORF。如果所得的Contig序列中某些堿基不能肯定，則用RT-PCR和測序證實(shí)。
cDNA末端快速擴(kuò)增對那些僅有部分ORF的序列，芯片拼接仍不能獲得全部閱讀框架，則根據(jù)同源性分析及蛋白基序(motifs)的比較，對可能有重要功能者，則用cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapidamplification of cDNA ends，RACE)克隆全長。方法如下先以測序的EST序列設(shè)計(jì)兩個同方向的巢式引物(長度為27-34bp，Tm為65-72℃)，用人腎上腺M(fèi)arathon-Ready cDNA kit(Clontech)為模板，以試劑盒提供的接頭引物(AP1和AP2)與特異引物進(jìn)行3′或5′端巢式PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物亞克隆測序，以獲得某個基因的5′或3′端序列，再經(jīng)Autoassemler軟件組裝成Contigs序列。
本發(fā)明人利用上述方法克隆到一個與人胰島素受體酪氨酸激酶底物P53(IRSP53)同源的新基因IRTKS(Insulin Receptor Tyrosine Kinase Substrate)。該基因可為更好地理解腎上腺的功能、澄清調(diào)控機(jī)制及深入了解腎上腺腫瘤的發(fā)病機(jī)理提供重要的參考價(jià)值，亦將為生物制藥開發(fā)及研制提供可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的人基因IRTKS，該基因是人IRTKS蛋白基因。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的人IRTKS蛋白多肽。
本發(fā)明的再一目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人IRTKS蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包括編碼具有人IRTKS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列雜交的序列。優(yōu)選的，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更優(yōu)的，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人IRTKS蛋白多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。優(yōu)選的，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種載體，所述載體含有上述分離的多核苷酸。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有IRTKS蛋白活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟(a)將編碼具有IRTKS蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成IRTKS蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成IRTKS蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)IRTKS蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有IRTKS蛋白活性的多肽。
優(yōu)選的，步驟(a)中所述的核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種抗體，所述抗體是能與上述IRTKS蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還提供了一種探針分子，所述的探針分子含有上述多核苷酸中約8-100個連續(xù)的核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA，或人工化學(xué)合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，“分離的”多核苷酸是指，該多核苷酸或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該多核苷酸或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
本發(fā)明中，術(shù)語“IRTKS蛋白(或多肽)編碼序列”是指編碼具有IRTKS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中267-1802位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框267-1802位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中267-1802位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人IRTKS相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常位1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常位60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“IRTKS蛋白多肽”是指具有IRTKS蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人IRTKS蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括IRTKS蛋白的活性片斷和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與IRTKS DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗IRTKS多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含IRTKS多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了IRTKS多肽的可溶性片段。通常，該片段具有IRTKS多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供IRTKS蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然IRTKS多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明還包括對IRTKS DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這里“特異性”是指抗體能結(jié)合于IRTKS基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與IRTKS基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制IRTKS蛋白的分子，也包括那些并不影響IRTKS蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的IRTKS基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利NO.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的IRTKS基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)IRTKS或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷IRTKS功能的抗體以及不影響IRTKS功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用IRTKS基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與IRTKS基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的IRTKS核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列，這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。當(dāng)然，也可通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與人胰島素受體酪氨酸激酶底物P53(IRSP53)蛋白的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有人IRSP53蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的人IRTKS是人IRSP53蛋白基因的一個同源基因而具有相似的功能。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的同源蛋白的比較圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的同源蛋白功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的電泳結(jié)果；圖4是本發(fā)明實(shí)施例5的體外翻譯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A超螺旋pCDNA3.1-IRTKS，B經(jīng)BglII酶切的線狀pCBNA3.1-IRTKS，C體外翻譯盒提供的陽性對照質(zhì)粒；圖5是本發(fā)明實(shí)施例6的融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1Factor X酶切去掉GST蛋白，2IRTKS-GST融合蛋白；圖6是本發(fā)明實(shí)施例7的純化后抗體蛋白電泳(上圖)，多抗敏感性及特異性的檢驗(yàn)(下圖)；圖7是本發(fā)明實(shí)施例8的外源性IRTKS基因在Hela細(xì)胞內(nèi)的定位圖，所顯示出的均為細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)看不見；圖8是本發(fā)明實(shí)施例8的內(nèi)源性IRTKS基因在Hela細(xì)胞中的定位圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例8的內(nèi)源性IRTKS基因在Cos-7細(xì)胞中的定位圖；圖10是本發(fā)明實(shí)施例9的IRTKS蛋白的酪氨酸磷酸化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖11是本發(fā)明實(shí)施例10的核抽提液中蛋白IRTKS含量的鑒定，A按照經(jīng)典方法抽提5個100mm的培養(yǎng)皿的Hela細(xì)胞核，取10ul核抽提液跑蛋白電泳，用純化的多抗anti-IRTKS檢驗(yàn)蛋白IRTKS的含量，B蛋白電泳樣品量是A的兩倍；圖12是本發(fā)明實(shí)施例10的免疫共沉淀的蛋白電泳圖(考馬斯亮蘭染色)；圖13是本發(fā)明實(shí)施例11的偶聯(lián)效率的蛋白電泳鑒定圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1生物信息學(xué)分析(1)IRTKS的核酸及蛋白序列本發(fā)明的IRTKS的核酸及蛋白序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
(2)染色體定位信息用基因的全長(從起始密碼子到終止密碼子)去和GENEBANK的人全長序列進(jìn)行比較，所用軟件的Internet鏈接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/?；騃RTKS定位在7號染色體長臂21-22之間，即7q21-22，有14個外顯子。
(3)同源蛋白的比較以新基因IRTKS的蛋白序列去和網(wǎng)上的蛋白數(shù)據(jù)庫比對，選取一些同源性高于30％的蛋白序列，所用軟件的Internet鏈接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。然后在UNIX系統(tǒng)下用GGG軟件包中的Pileup功能將所有的同源蛋白序列之間進(jìn)行分析比較，產(chǎn)生一文件irtks-pileup.msf，然后用GENEDOC軟件打開，如圖1所示。同源蛋白之間N端同源性比較高，而C端則較低。IRTKS的同源蛋白IRSP53有幾個Isoform，不同點(diǎn)位于C端，N端基本相同，不同種屬的IRSP53基因其不同點(diǎn)也幾乎位于C端。
(4)蛋白功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測根據(jù)蛋白序列利用網(wǎng)上軟件來預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域，所用軟件的Internet地址為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi，各同源蛋白預(yù)測的結(jié)果如圖2所示。
(5)亞細(xì)胞定位的生物軟件預(yù)測以IRTKS蛋白序列用網(wǎng)上生物軟件預(yù)測其在細(xì)胞中的位置，預(yù)測軟件的internet鏈接為http://psort.nibb.ac.jp/form.html，預(yù)測結(jié)果如下軟件名稱P-sort IIResults of the k-NN Predictionk＝9/2365.2％nuclear13.0％mitochondrial13.0％cytoplasmic4.3％cytoskeletal4.3％vacuolar>>prediction for QUERY is nuc(k＝23)實(shí)施例2全長基因序列的獲得根據(jù)電子拼接的IRTKS全長cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，在引物的5′和3′端加上BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)，分別以腎上腺和胎肝cDNA庫為模板用PCR方法擴(kuò)增所需片段，PCR反應(yīng)體系如下10×pfu酶Buffer 5μldNTP(2.5mM) 1μlprimer 1(5μM)1μlprimer 2(5μM)1μl模板 2μlpfu酶(5u/μl) 1μldd H2O39μl50μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒鐘，50℃復(fù)性30秒鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次，最后72℃反應(yīng)7分鐘。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測，結(jié)果見圖3。用QIAGEN公司的膠回收試劑盒回收純化約1500bp的PCR片段條帶，按QIAGEN公司的MinElute Gel Extraction Kit操作說明書進(jìn)行。
實(shí)施例3pCDNA3.1-IRTKS重組質(zhì)粒的構(gòu)建(1)雙酶切割膠回收的片段及載體pCDNA3.1用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI酶切實(shí)施例2得到的純化后的1500bp的PCR產(chǎn)物，酶切體系如下IRTKS的PCR片段 載體pCDNA3.1DNA 20μl 510×Buffer 3μl3μlBamHI2μl2μlXbaI 2μl2μldd H2O 3μl18μl30μl 30μl酶切反應(yīng)條件37℃水浴，4小時(shí)
(2)用QIAGEN公司的柱回收試劑盒回收酶切的PCR片段和載體片段。
(3)連接PCR產(chǎn)物和載體將酶切并純化后的片段與相應(yīng)的酶切載體按以下體系進(jìn)行連接IRTKS酶切片段 10酶切后的pCDNA3.1載體410×T4連接酶Buffer 2T4連接酶(3u/μl)220μl連接反應(yīng)條件16℃，過夜(4)轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌DH5-α按下列步驟轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)菌2-5μl的連接產(chǎn)物與200μl感受態(tài)菌(DH5-α)混勻，冰浴30分鐘，之后于42℃水浴熱休克60-90秒鐘，再冰浴5分鐘，之后加LB培養(yǎng)基800μl，37℃搖床300rpm搖1小時(shí)，3000rpm離心5分鐘，去上清800μl左右，混勻沉淀，涂LB+Amp平板，置37℃溫箱過夜。
(5)PCR鑒定陽性克隆在平板中挑取5-10個單克隆用PCR方法鑒定陽性克隆。取1個陽性克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基(+相應(yīng)的抗生素)，37℃搖床培養(yǎng)過夜。用Viogene公司的Mini-MTMPlasmid Miniprep試劑盒抽提質(zhì)粒，按操作說明書進(jìn)行。所構(gòu)建的質(zhì)粒均進(jìn)行酶切和/或測序鑒定，經(jīng)分析證實(shí)電子拼接的序列是正確的。
實(shí)施例4pGEX 5X-2-IRTKS-C重組質(zhì)粒的構(gòu)建(1)PCR擴(kuò)增IRTKS基因C端約750bp的片段根據(jù)IRTKS全長cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增IRTKS基因C端約750bp的片段，在引物的5′和3′端加上BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，以實(shí)施例3獲得的pCDNA3.1-IRTKS重組質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴(kuò)增所需片段，PCR反應(yīng)體系如下10×pfu酶Buffer5μldNTP(2.5mM)1μlprimer 1(5μM) 1μlprimer 2(5μM) 1μl
模板 2μlpfu酶(5u/μl)1μldd H20 39μl50μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒鐘，50℃復(fù)性30秒鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次，最后72℃反應(yīng)7分鐘。
(2)雙酶切割膠回收的片段及載體pGEX 5X-2用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切純化后的PCR產(chǎn)物，酶切體系如下IRTKS-C的PCR片段載體pGEX 5X-2DNA 20μl 510×Buffer 3μl3μlBamHI2μl2μlXhoI 2μl2μldd H2O 3μl18μl30μl 30μl酶切反應(yīng)條件37℃水浴，4小時(shí)。
(3)用QIAGEN公司的割膠回收試劑盒回收酶切的PCR片段和載體片段(4)連接PCR產(chǎn)物和載體將酶切并純化后的片段與相應(yīng)的酶切載體按以下體系進(jìn)行連接IRTKS-C酶切片段 10μl酶切后的pGEX 5X-2載體 4μl10×T4連接酶Buffer 2μlT4連接酶(3u/μl)2μl20μl連接反應(yīng)條件16℃，過夜。
(5)轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌DH5-α轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)菌步驟同上。
(6)PCR鑒定陽性克隆在平板中挑取5-10個單克隆用PCR方法鑒定陽性克隆。取1個陽性克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基(+相應(yīng)的抗生素)，37℃搖床培養(yǎng)過夜。用Viogene公司的Mini-MTMPlasmid Miniprep試劑盒抽提質(zhì)粒，按操作說明書進(jìn)行。所構(gòu)建的質(zhì)粒均進(jìn)行酶切和/或測序鑒定。
實(shí)施例5體外翻譯(In vitro translation)以實(shí)施例3獲得的pCDNA3.1-IRTKS質(zhì)粒為模板，用Promega公司提供的TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯試劑盒進(jìn)行體外翻譯。
反應(yīng)體系如下pcDNA3-IRTKS control plasmid質(zhì)粒模板(0.2μg/μl) 2μl 2μlTNTQuick Martermix20μl20μl[35S]-蛋氨酸(1175 Ci/mmol) 1μl 1μlddH2O(RNase free)2μl 2μlTotal25μl25μl反應(yīng)條件30℃水浴90min。
取2~3μl翻譯產(chǎn)物用10％SDS-PAGE電泳，電泳條件為60V/20min，160V/1hr，干膠機(jī)將膠抽干(70℃/2hr)，將膠放在磷屏盒中曝光3-5小時(shí)，然后在磷屏儀(Molecular Dynimics)中掃屏?；?80℃壓片過夜。
其結(jié)果如圖4所示，結(jié)果是可靠的，翻譯出的蛋白大小與預(yù)測的十分吻合。
實(shí)施例6GST-IRTKS-C融合蛋白的表達(dá)與純化(1)融合蛋白的大量表達(dá)將上述已構(gòu)建好的pGEX 5X-2-IRTKS-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21菌株，挑單克隆菌落接種于5mlLB(Amp)培養(yǎng)基中，37℃搖床300rpm培養(yǎng)過夜；取200μl菌液接種到20ml 2×YT(Amp)中，37℃300rpm培養(yǎng)8小時(shí)；取20ml菌液接種到1000ml(分倆個搖瓶)2×YT(Amp)中，37℃300rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6-0.8；加入400μl(每100ml菌液)0.1M IPTG，30℃300rpm繼續(xù)培養(yǎng)3hr；8000rpm 4℃離心10min，去上清，加4ml(每100ml菌液)預(yù)冷的1×PBS，混懸細(xì)胞；加入20μl(每100ml菌液)1M DTT至最終濃度為5mM，加入40μl(每100ml菌液)10mg/mlPMSF至最終濃度為100μg/ml；冰浴超聲裂解細(xì)胞成勻漿(60s-5s-1s，第3檔)；加200μl(每100ml菌液)20％Triton X-100至終濃度1％，冰浴30min；12000rpm離心10min，分裝上清，-80℃儲存。
(2)蛋白的純化50％谷胱甘肽瓊脂糖顆粒勻漿(Slurry)制備將試劑盒中75％谷胱甘肽瓊脂糖顆?；鞈乙簱u勻，取1.33ml，500×g離心5min，去上清。用預(yù)冷的1×PBS 10ml混懸，500×g離心5min，去上清。重復(fù)洗倆次，加入1×PBS 1ml混懸，即為50％ Slurry，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 取-80℃凍存細(xì)胞裂解液，解凍，再13000rpm，4℃離心10min，取上清；加入2ml 50％Slurry，常溫下?lián)u動混勻30min-60min；4℃ 700g離心5min，去上清，加20ml PBS 4℃振搖5min；4℃ 500g離心5min，去上清后，再重復(fù)用20mlPBS洗一次；再加20mlPBS，混勻后轉(zhuǎn)移到純化用的柱子中，繼續(xù)用PBS洗；用紫外分光光度計(jì)測量流出液的OD280值，以PBS作對照，直至倆者相差不大；加1ml洗脫液(Glutathione Elution Buffer)，蓋住上蓋，室溫振蕩混勻30分鐘；用1.5ml的管收集洗脫液，繼續(xù)加洗脫液，繼續(xù)收集，用紫外分光光度計(jì)測量流出液的OD280值，以洗脫液作對照，直至倆者相差不大，停止洗脫。
純化蛋白柱子的再生用＞4倍的Glutathione Elution Buffer洗脫至無蛋白后，用0.1MTris HCI+0.5M NaCI，pH8.5和0.1M Sodium Acetate+0.5M NaCI，pH4.5溶液交替沖洗柱子，再用PBS緩沖液平衡，加入疊氮鈉4℃保存?zhèn)溆谩?br> 將洗脫液轉(zhuǎn)移到處理好的透析袋中(透析袋處理方法見分子克隆)，用PBS透析液在4℃冰箱透析24小時(shí)。透析液用磁力攪拌器緩慢攪拌，其間換2-3次透析液(特別是在剛開始透析的幾個小時(shí)內(nèi))。
透析后的收集液即為純化好的GST-IRTKS-C融合蛋白，用紫外分光光度計(jì)測量融合蛋白的含量，并用10％SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的純度。表達(dá)及純化結(jié)果如圖5。
實(shí)施例7兔多克隆抗體的制備(1)動物免疫用純化好的上述融合蛋白按常規(guī)方法免疫兔子，動物免疫由中國科學(xué)院上海生物工程基地協(xié)助完成。免疫2個月后，取血清用ELISA方法監(jiān)測IgG抗體的滴度，并用Western blot檢測抗體的敏感性和特異性。
(2)多克隆抗血清的純化兔抗血清IgG的純化
敏感性和特異性達(dá)到要求后，處死兔子，收集血液并置室溫凝固1小時(shí)，然后放4℃冰箱過夜，使血塊收縮；4℃ 5000rpm離心15分鐘，取上清，再于4℃ 5000rmp離心15分鐘，分裝保存于-20℃。
Sepharose 4B Protein G的制備取1ml protein G于4℃ 700g離心5分鐘，去上清，加10ml Wash/Binding Buffer(20mM磷酸鈉，150mM NaCl，Ph7.4)，混勻，700g于4℃離心5分鐘，用10倍柱床體積的Wash/Binding Buffer平衡protein G親和柱；取1ml血清用等體積的Wash/Binding Buffer稀釋，上柱，流出液再重新上柱2次，然后用10倍以上柱床體積的Wash/Binding Buffer洗至流出液的OD280接近Wash/Binding Buffer的OD280；加入1mlElution Buffer(100mM甘氨酸-HCl，pH3.0)洗脫抗體，收集流出液。收集管中每管加20μl10倍稀釋的Neutralization Buffer(1M Tris-HCl，pH9.0)，每管收集約300μl。洗脫完后再加入1ml Elution Buffer洗脫，直至流出液的蛋白含量接近本底水平。用紫外分光光度計(jì)測量抗體的含量，并用12％SDS-PAGE電泳檢測抗體的純度，即獲得純的抗血清。
柱子的再生用＞4倍柱床體積的Elution Buffer洗脫后，再用Wash/Binding Buffer洗至無抗體，加入疊氮鈉4℃保存?zhèn)溆谩?br> 兔抗血清IgG中去除抗GST部分抗體取純化好的GST蛋白0.5-1.0mg，溶于1ml的PBS中；加入30-50μl的50％ Slurry，GST beads，常溫1-2小時(shí)；700g離心5分鐘，取上清即為純化好的抗血清，加入疊氮鈉2/10000，4℃?zhèn)溆谩?br> 純化后蛋白電泳圖及檢驗(yàn)抗體anti-IRTKS敏感性及特異性的Western blot圖如圖6所示。
實(shí)施例8亞細(xì)胞定位(1)外源性IRTKS基因在Hela細(xì)胞內(nèi)的定位轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCDNA3.1-IRTKS于Hela細(xì)胞，用純化的兔多抗和單抗anti-myc來做免疫組化標(biāo)記所表達(dá)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7，IRTKS基因表達(dá)后位于細(xì)胞核內(nèi)，與軟件預(yù)測的相符。
(2)內(nèi)源性IRTKS基因在Hela細(xì)胞中的定位不用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，培養(yǎng)Hela細(xì)胞后用純化的多抗血清anti-IRTKS來標(biāo)記內(nèi)源性表達(dá)的目標(biāo)蛋白(紅色)，用Dapi染料顯示細(xì)胞核。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，內(nèi)源性的蛋白主要也定位于細(xì)胞核內(nèi)，與Dapi染料染出的核位置相符，但胞漿內(nèi)也有一些信號，可能是雜信號。結(jié)果如圖8所示。
(3)內(nèi)源性IRTKS基因在Cos-7細(xì)胞中的定位不用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，培養(yǎng)Cos-7細(xì)胞后用純化的多抗血清anti-IRTKS來標(biāo)記內(nèi)源性表達(dá)的目標(biāo)蛋白(紅色)，用Dapi染料顯示細(xì)胞核。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，內(nèi)源性的蛋白主要也定位于細(xì)胞核內(nèi)，與Dapi染料染出的核位置相符。結(jié)果如圖9所示。
實(shí)施例9蛋白酪氨酸殘基磷酸化(Tyr phosphatization)準(zhǔn)備7個中盤(dish)，培養(yǎng)Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCDNA3.1-IRTKS做外源性表達(dá)蛋白酪氨酸磷酸化實(shí)驗(yàn)?？瞻踪|(zhì)粒作為陰性對照，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48小時(shí)后一部分用無糖DMEM培養(yǎng)基饑餓4小時(shí)后，換成各種培養(yǎng)基(如無糖，高糖，DMEM+10％FBS)等，然后一部分用胰島素刺激1小時(shí)，裂解細(xì)胞，用Talon beads純化試劑盒純化帶his tag的目標(biāo)蛋白，然后走10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，之后轉(zhuǎn)膜，用特異的抗酪氨酸磷酸化的抗體(anti-tyr)和抗融合蛋白中myc tag的抗體(anti-myc)標(biāo)記顯色(Western blot)。結(jié)果如圖10所示，用低糖培養(yǎng)基處理及胰島素的刺激后，目標(biāo)蛋白的酪氨酸磷酸化加強(qiáng)了一點(diǎn)(3，4之間的比較)。圖10中上半部分為anti-tyr抗體標(biāo)記的結(jié)果，然后strip膜，再用anti-myc抗體標(biāo)記，得下半部分結(jié)果。初步可以得出結(jié)論，目標(biāo)蛋白的酪氨酸磷酸化和胰島素刺激有點(diǎn)關(guān)系。
實(shí)施例10免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)(1)核抽提液中蛋白IRTKS含量的鑒定經(jīng)前面軟件分析，及后續(xù)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白IRTKS主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，因而抽提細(xì)胞核準(zhǔn)備做免疫共沉淀。
培養(yǎng)5盤100mmDish的Hela細(xì)胞。用PBS洗細(xì)胞2次，刮下細(xì)胞，用10ml PBS將細(xì)胞收集到15ml離心管中。3000rpm離心10min，去上清，估計(jì)壓縮后的細(xì)胞體積pcv?？焖儆?倍pcv的Hypotonic buffer重懸細(xì)胞，3000rpm離心5min，去上清。用3倍pcv的Hypotonicbuffer重懸細(xì)胞，混勻，置冰上膨脹細(xì)胞10min。用玻璃勻漿器上下勻漿10次，下時(shí)要緩慢(操作在4℃進(jìn)行)。勻漿轉(zhuǎn)移至離心管4000rpm離心15min，去上清。估計(jì)細(xì)胞核體積pnv，用1/2倍pnv體積的Low-Salt buffer重懸細(xì)胞。緩慢滴加1/2倍pnv體積的High-Saltbuffer，邊加邊搖動。置冰中在水平搖床上緩慢搖動30min。15000rpm離心30min，將上清(即核抽提物)保存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 圖11為核抽提液中蛋白IRTKS含量的Western blot鑒定的結(jié)果。
(2)免疫共沉淀用單抗或自制多抗來做免疫共沉淀，然后將獲得的可能是相互作用的蛋白條帶割下，送去做蛋白質(zhì)肽譜分析，得到新的相互作用蛋白信息。這一方法是國際通行的一種獲得相互作用蛋白的捷徑，在此我們也采用這一方法。收獲5個dish的Hela細(xì)胞核抽提液，在一定的緩沖液條件下與自備的兔多抗反應(yīng)，與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物會結(jié)合到抗體上，然后用Protein G純化該抗體，然后走一個SDS-PAGE，在此實(shí)驗(yàn)中用陰性抗體(免疫前的兔抗血清)做對照。
實(shí)驗(yàn)過程如下核抽提液200-400μl，加300-600μl的300mM KCI(0.1％NP-40)；加20μl的50％ Sepharose protein A(或)G，4℃ 3小時(shí)；4℃ 700g離心5分鐘，取上清；加8-10μl兔多抗血清Anti-IRTKS或陰性抗血清，4℃反應(yīng)過夜；再加20μl的50％ Sepharose proteinA(或)G，4℃ 3小時(shí)；4℃ 700g離心5分鐘，NETN(0.2％NP-40)洗滌，400μl×4次；加3μl6×SDS Loading Buffer，100℃，5分鐘；蛋白電泳，跑12％的PAGE；考馬斯亮蘭染色，脫色，割膠，送去蛋白鑒定(質(zhì)譜)。
如此，可以獲得可能是相互作用蛋白的條帶，做質(zhì)譜可以鑒定出是何種蛋白，然后用GST-pulldown，Yeast Two-hybrid，etc.來驗(yàn)證其真實(shí)性。免疫共沉淀的結(jié)果如圖12所示。
實(shí)施例11蛋白偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)(Protein coupling)偶聯(lián)樣品的準(zhǔn)備5mg目標(biāo)蛋白溶于3ml偶聯(lián)緩沖液中，配成Ligand Solution；取1mlNHS-activated Sepharose 4 Fast Flow，裝柱；用予冷的1mM HCl洗3次，每次2ml(2×柱體積)；加入Ligand Solution，4小時(shí)，4℃；3×2ml封閉緩沖液，再3×2ml沖洗緩沖液3×2ml封閉緩沖液，讓溶液停留15-30分鐘；3×2ml沖洗緩沖液，3×2ml封閉緩沖液；3×2ml沖洗緩沖液；用2-5ml中性緩沖液(PBS etc.)；保存于含有0.05％ NaN3pH7.2的中性緩沖液中，4℃。
蛋白偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖13。從圖13可以看出，蛋白電泳中有兩條抗體帶(重鏈和輕鏈)，如果有相互作用蛋白其大小正好與抗體重輕鏈相符，則從電泳結(jié)果不能看出其條帶。因而我們?nèi)绻麑⒖贵w偶聯(lián)在Sepharose介質(zhì)上，在做免疫共沉淀，抗體片段就不會出現(xiàn)在電泳圖上，因而可以獲得更多的信息。
我們?nèi)ST蛋白做偶聯(lián)予實(shí)驗(yàn)，偶聯(lián)前的蛋白樣品取20ul，偶聯(lián)后流出液取20ul，跑蛋白電泳如圖13，可以看出，偶聯(lián)效率很高，近95％。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人新基因IRTKS及其編碼蛋白<130>NP-1372<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2577<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(267)..(1802)<400>1ggtggggccg cccggcccgc ccagcttcct ctggcggcgt ccggccgctt ctcctctgct 60cctcgaagaa ggccagggcg gcgctgccgc aagttttgac attttcgcag cggagacgcg120cgcgggcact ctcgggccga cggctgcggc ggcggccgac cctccagagc cccttagtcg180cgccccggcc ctcccgctgc ccggagtccg gcggccacga ggcccagccg cgtcctcccg240cgcttgctcg cccggcggcc gcagcc atg tcc cgg ggg ccc gag gag gtg aac 293Met Ser Arg Gly Pro Glu Glu Val Asn1 5cgg ctc acg gag agc acc tac cgg aat gtt atg gaa cag ttc aat cct 341Arg Leu Thr Glu Ser Thr Tyr Arg Asn Val Met Glu Gln Phe Asn Pro10 15 20 25gtg ctg cga aat tta ata aac ctg ggg aaa aat tat gag aaa gct gta 389Val Leu Arg Asn Leu Ile Asn Leu Gly Lys Asn Tyr Glu Lys Ala Val30 35 40aac gct atg atc ctg gca gga aaa gcc tac tac gat gga gtg gcc aag 437Asn Ala Met Ile Leu Ala Gly Lys Ala Tyr Tyr Asp Gly Val Ala Lys
45 50 55atc ggt gag att gcc act ggg tcc ccc gtg tca act gaa ctg gga cat485Ile Gly Glu Ile Ala Thr Gly Ser Pro Val Ser Thr Glu Leu Gly His60 65 70gtc ctc ata gag att tca agt acc cac aag aaa ctc aac gag agt ctt533Val Leu Ile Glu Ile Ser Ser Thr His Lys Lys Leu Asn Glu Ser Leu75 80 85gat gaa aat ttt aaa aaa ttc cac aaa gag att atc cat gag ctg gag581Asp Glu Asn Phe Lys Lys Phe His Lys Glu Ile Ile His Glu Leu Glu90 95 100 105aag aag ata gaa ctt gac gtg aaa tat atg aac gca act cta aaa aga629Lys Lys Ile Glu Leu Asp Val Lys Tyr Met Asn Ala Thr Leu Lys Arg110 115 120tac caa aca gaa cac aag aat aaa tta gag tct ttg gag aaa tcc caa677Tyr Gln Thr Glu His Lys Asn Lys Leu Glu Ser Leu Glu Lys Ser Gln125 130 135gct gag ttg aag aag atc aga agg aaa agc caa gga agc cga aac gca725Ala Glu Leu Lys Lys Ile Arg Arg Lys Ser Gln Gly Ser Arg Asn Ala140 145 150ctc aaa tat gaa cac aaa gaa att gag tat gtg gag acc gtt act tct773Leu Lys Tyr Glu His Lys Glu Ile Glu Tyr Val Glu Thr Val Thr Ser155 160 165cgt cag agt gaa atc cag aaa ttc att gca gat ggt tgc aaa gag gct821Arg Gln Ser Glu Ile Gln Lys Phe Ile Ala Asp Gly Cys Lys Glu Ala170 175 180 185ctg ctt gaa gag aag agg cgc ttc tgc ttt ctg gtt gat aag cac tgt869Leu Leu Glu Glu Lys Arg Arg Phe Cys Phe Leu Val Asp Lys His Cys190 195 200ggc ttt gca aac cac ata cat tat tat cac tta cag tct gca gaa cta917Gly Phe Ala Asn His Ile His Tyr Tyr His Leu Gln Ser Ala Glu Leu205 210 215ctg aat tcc aag ctg cct cgg tgg cag gag acc tgt gtt gat gcc atc965Leu Asn Ser Lys Leu Pro Arg Trp Gln Glu Thr Cys Val Asp Ala Ile220 225 230
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115 120 125Lys Leu Glu Ser Leu Glu Lys Ser Gln Ala Glu Leu Lys Lys Ile Arg130 135 140Arg Lys Ser Gln Gly Ser Arg Asn Ala Leu Lys Tyr Glu His Lys Glu145 150 155 160Ile Glu Tyr Val Glu Thr Val Thr Ser Arg Gln Ser Glu Ile Gln Lys165 170 175Phe Ile Ala Asp Gly Cys Lys Glu Ala Leu Leu Glu Glu Lys Arg Arg180 185 190Phe Cys Phe Leu Val Asp Lys His Cys Gly Phe Ala Asn His Ile His195 200 205Tyr Tyr His Leu Gln Ser Ala Glu Leu Leu Asn Ser Lys Leu Pro Arg210 215 220Trp Gln Glu Thr Cys Val Asp Ala Ile Lys Val Pro Glu Lys Ile Met225 230 235 240Asn Met Ile Glu Glu Ile Lys Thr Pro Ala Ser Thr Pro Val Ser Gly245 250 255Thr Pro Gln Ala Ser Pro Met Ile Glu Arg Ser Asn Val Val Arg Lys260 265 270Asp Tyr Asp Thr Leu Ser Lys Cys Ser Pro Lys Met Pro Pro Ala Pro275 280 285Ser Gly Arg Ala Tyr Thr Ser Pro Leu Ile Asp Met Phe Asn Asn Pro290 295 300
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Leu Arg Pro Thr Val Thr Asn Asp Arg Ser Ala Pro Ile Ile Arg500 505 510
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包括編碼具有人IRTKS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列雜交的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ IDNO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列。
4.一種分離的人IRTKS蛋白多肽，其特征在于，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
5.如權(quán)利要求4所述的一種分離的人IRTKS蛋白多肽，其特征在于，所述多肽是具有SEQID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有IRTKS蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(a)將編碼具有IRTKS蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成IRTKS蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸267-1802位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成IRTKS蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)IRTKS蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有IRTKS蛋白活性的多肽。
9.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求4所述的IRTKS蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，所述的探針分子含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸中約8-100個連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與人胰島素受體酪氨酸激酶底物P53(IRSP53)同源的新基因IRTKS(Insulin Receptor Tyrosine Kinase Substrate)。本發(fā)明還提供了該新基因編碼的蛋白多肽、含有該基因核苷酸序列的載體和轉(zhuǎn)化體、該基因所編碼蛋白的抗體等。該新基因及蛋白可為更好地理解腎上腺的功能、澄清調(diào)控機(jī)制及深入了解腎上腺腫瘤的發(fā)病機(jī)理提供重要的參考價(jià)值，亦將為生物制藥開發(fā)及研制提供可能。
文檔編號C12P21/02GK1724665SQ20041005305
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者張新, 黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心