專利名稱：白菜育性相關基因bcmf2及其分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，特別地，涉及一種白菜育性相關基因BCMF2及其分離的方法。
背景技術：
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表達上的差異，獲得與重要農藝性狀相關的標記探針。結合文庫篩選、染色體步移、RACE技術等實驗手段，能夠得到與重要農藝性狀相關的全長基因序列。本發(fā)明采用cDNA-AFLP技術對‘矮腳黃’白菜(Brasscia campestris L.ssp.chinensis Makino var.commumis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育兩用系(A/B line)表達差異分析，發(fā)現可育株系與不育株系的表達差異主要存在于花藥。配合RACE技術分離獲得與花藥發(fā)育相關基因BCMF2，為進一步搞清楚花藥發(fā)育過程中導致不育株系花粉敗育的原因，以及闡明植物雄性不育發(fā)生的分子機制提供研究基礎，進而為人工創(chuàng)建不育材料提供物質條件。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種白菜育性相關基因BCMF2及其分離方法。
本發(fā)明提供的白菜育性相關基因BCMF2具有SEQ ID No.1的序列。BCMF2的最大ORF從第67號堿基開始，1329號堿基終止，1263個堿基編碼420個氨基酸。
本發(fā)明提供的白菜育性相關基因BCMF2的分離方法，包括以下步驟1、經過cDNA-AFLP對‘矮腳黃’白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育株系的表達差異進行分析，在A18和T16引物組合中獲得可育株系特異基因片段BCMF-A18T16-1。
2、將差異片段BCMF-A18T16-1進行回收、克隆和測序。
3、根據BCMF-A18T16-1片段的序列，設計兩條特異引物(SP1和SP2)與3’RACE錨定引物進行配合，獲得與BCMF-A18T16-1片段相關的基因的cDNA的3’末端序列。
4、回收SP2與5’RACE錨定引物的擴增條帶，克隆并進行測序，獲得與BCMF-A18T16-1片段相關基因的cDNA的5’末端序列。
5、將三次測序結果拼接，得到與白菜育性相關基因BCMF2的cDNA全長序列，基因全長為1263bp。
6、應用BLAST和DNAStar軟件對BCMF2序列進行分析比較以及ORF及其氨基酸序列的確定。
本發(fā)明采用cDNA-AFLP技術對‘矮腳黃’白菜核不育兩用系表達差異分析，同時配合RACE技術分離獲得與花藥發(fā)育相關基因BCMF2，為進一步搞清楚花藥發(fā)育過程中導致不育株系花粉敗育的原因，以及闡明植物雄性不育發(fā)生的分子機制提供研究基礎，進而為人工創(chuàng)建不育材料提供物質條件。


圖1是BCMF2基因在不同發(fā)育時期、不同器官的表達分析圖。
具體實施例方式
下面以白菜育性相關基因BCMF2的克隆為例詳細說明本發(fā)明。
1.cDNA-AFLP技術預擴增和選擇性擴增體系的優(yōu)化(1)預擴增退火溫度的選擇cDNA酶切連接產物進行預擴增，預擴增中退火溫度分別設定變50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃5個溫度梯。測序膠電泳結果表明，52～56℃條帶穩(wěn)定。
(2)預擴增循環(huán)次數的選擇cDNA酶切連接產物進行預擴增，預擴增分別進行15、18、21和24不同的循環(huán)次數，PCR產物取5μL，在1.8％瓊脂糖膠上電泳，四種不同循環(huán)次數的PCR結果都能看到一條彌散的帶，但是帶的強弱不同。隨著循環(huán)次數的增加，電泳條帶的亮度提高。
預擴增主物稀釋20倍作為模板進行選擇性擴增，產物經測序膠電泳結果顯示，隨著循環(huán)次數的增加，電泳帶的顏色加深。綜合分析電泳結果，預擴增循環(huán)次數為15～21較好，均可獲得穩(wěn)定的電泳結果。
(3)cDNA-AFLP技術預擴增和選擇性擴增體系中Mg2+濃度的選擇試驗結果表明，Mg2+濃度2.0～2.8mM范圍內，測序膠電泳結果都比較好。
綜上所述，在以后的試驗中，cDNA-AFLP預擴增退火溫度確定為53℃，預擴增循環(huán)次為20個循環(huán)，預擴增和選擇性擴增的PCR體系中Mg2+濃度為2.3mM。
2.與BCMF-A18T16-1片段相關的基因在不同發(fā)育時期、不同器官的表達分析以cDNA-AFLP分析得到的差異表達BCMF-A18T16-1片段為探針，與‘矮腳黃’白菜兩用系可育株系和不育株系的蓮座葉、花莖葉、花莖和小蕾、中蕾、大蕾總RNA進行Northern雜交。結果表明，該片段相關基因只在可育中蕾和可育大蕾中有較強的雜交信號，大蕾的雜交信號強于中蕾，其它不同時期和不同部位未發(fā)現雜交信號；不育株系不同發(fā)育時期、不同發(fā)育器官未發(fā)現雜交信號。說明與BCMF-A18T16-1片段相關的基因只在可育株系中蕾和大蕾花藥中特異表達。
3.與BCMF-A18T16-1片段相關的基因的cDNA全長的獲得(1)BCMF-A18T16-1的克隆測序 將BCMF-A18T16-1片段克隆至T載體(pGEM-T Easy Vector，購自Promega公司)，隨后把重組質粒p BCMF-A18T16-1克隆送上海博亞生物技術有限公司進行測序，測序結果表明，其長度為303bp，去掉劃橫線的cDNA-AFLP引物部分，實際測得序列長度為268bp。
(2)與BCMF-A18T16-1片段相關的基因的cDNA的3’末端的獲得 根據測序結果及網上同源比較結果，設計了3’RACE特異引物SP1和SP2，其序列為SP15’-CAT GGC TCC AAG TGT GTG CCA GTC C-3’；SP25’-CCCTAA AGG AGA TTT CTT GGC T-3’。其中，SP1引物最后一個堿基與SP2引物的第一個堿基相差20個堿基。以可育大蕾雙鏈BCMF-A18T16-1cDNA為模板，與3’RACE錨定引物(5’-AGG CCG AGG CGG CCG ACA TGT TTT-3’，雙鏈cDNA合成試劑盒)進行嵌套式PCR擴增，電泳結果表明，第二次產物分子量略小于第一，第二次PCR產物的長度約為1200bp?；厥?’RACE第二次PCR的電泳條帶，克隆到T載體，送上海博亞生物技術有限公司測序。測序結果如圖3。與BCMF-A18T16-1片段相關的基因3’端序列的長度是1177bp，去掉引物序列，實際擴增到1157bp，符合電泳結果；末尾有27個A的寡聚核苷酸序列。由此證明擴增的3’末端是正確的。
(3)與BCMF-A18T16-1片段相關的基因的cDNA的5’末端的獲得 根據BCMF-A18T16-1片段設計5’RACE的特異引物SP3和SP4，其序列如下SP35’-CAC ACT TGG AGC CAT GTG TTT AGA A-3’；SP45’-CAC CGA GATATT CAC CAT TAG C-3’。其中，SP3引物最后一個堿基與SP4第一個堿基相差105個堿基。與5’RACE錨定引物(5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3’，雙鏈cDNA合成試劑盒)進行嵌套式PCR擴增。將擴增的長片段回收連接到T載體上，送上海博亞生物技術有限公司測序。測序結果表明，與BCMF-A18T16-1相關基因的5’端長度為193bp。減去特異引物，測序的實際長度為173bp。
(4)與BCMF-A18T16-1片段相關的基因(BCMF2)的cDNA的全長序列的拼接 對上述三測序結果的測序結果拼接，與BCMF-A18T16-1片段相關的基因的cDNA的全長序列為1485bp，我們將其命名為BCMF2基因。
4.BCMF2基因的cDNA全長序列的分析經國際互聯(lián)網搜索，BCMF2基因cDNA全序列與擬南芥多聚半乳糖醛酸酶mRNA序列相似性最高，為83％。
利用DNA Star軟件對BCMF2基因ORF進行分析，發(fā)現該基因最大ORF為1263bp，起始密碼子ATG位于第67位，終止密碼子為TAA，位于第1329位。ATG上游-3、-2和-1位核苷酸分別為A、C和C，+4位為核苷酸為G，這是一個典型的Kozak結構。這一結構對于蛋白質合成的40S起始復合物正確識別啟始密碼子具有很重要的作用。將ORF翻譯成氨基酸，編碼420個氨基酸且具有SEQ ID No.5的序列。經國際互聯(lián)網比較，BCMF2基因編碼的蛋白質的氨基酸序列與擬南芥多聚半乳糖醛酸酶mRNA編碼的蛋白質的氨基酸序列的相似性最高，為79％。
按照上述的操作步驟，即可以獲得白菜育性相關基因BCMF2的全長序列。
圖1示出了BCMF2基因在不同發(fā)育時期、不同器官的表達分析。1、3、5、7、9和11泳道分別為不育株系的蓮座葉、花莖葉、花莖和小蕾、中蕾、大蕾；2、4、6、8、10和12泳道分別為可育株系的蓮座葉、花莖葉、花莖和小蕾、中蕾、大蕾。
根據附圖1可見，BCMF2基因只在可育株系中蕾和大蕾花藥中特異表達，由此確定該基因是與花藥發(fā)育相關的基因。本發(fā)明將為人工創(chuàng)建不育材料提供物質條件。
白菜育性相關基因BCMF2的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5的序列表<110>浙江大學<120>白菜育性相關基因BCMF2及其分離方法<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1485<212>DNA<213>Brassica sp.
<400>1gacttttaaa tttgtcaaca catctttaaa agaagaaaaa agcaaaaata aaaagatatt 60atcaccatgg ctggcgcaag aagtttggtc aaggcaaatc atactaatgt aggctcatta 120attttaatgg ccttggtgtt tggttcttgc gtagctaatg gtgaatatct cggtggccgc 180cgtggccttg ccgctgttgc cggcaaccct acggtctttg atattactaa gaatggagca 240gtgggaaatg gtgccaccga ttcttccaag gcgtttctaa acacatggct ccaagtgtgt 300gccagtcctg taccagcaac gctactagtc cctaaaggag atttcttggc tggtccagta 360atttttgctg gtccatgcaa gagcaaagtg accgtcgaag ttcagggcac aatcatcgct 420ccaccaagcg gatacccgac tcctgaatgg ttcttattcg aacatgtcga taatgtcgtc 480
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<400>2gactgcgtac ctaatcttaa tggccttggt gttaggttct tgcgtagcta atggtgaata 60tctcggtggc cgccgtggcc ttgccgctgt tgccggcaac cctacggtct ttgatattac 120taagaatgga gcagtgggaa atggtgccac cgattcttcc aaggcgtttc taaacacatg 180
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<400>3ccctaaagga gatttcttgg ctggtcccag taatttttgc tggtccatgc aagagcaaag 60tgaccgtcga agttcagggc acaatcatcg ctccaccaag cggatacccg actcctgaat 120ggttcttatt cgaacatgtc gataatgtcg tcctcaccgg acccggcaca ttccacggca 180aaggtgaagc cgtttggaaa gcagatggct gtggtaaaaa gttgaactgc aatcttcctc 240caacgtctct aaaattcaga aacattttaa accttgacat ttccggcatt agctcggtca 300acgcaaaggc cttccacatg ttcttggtaa aaactacaaa tgtcaacgtc caaaacatta 360agattattgc ccctgctgaa agtcccaaca ccgatggcat ccatttgagc aatgcggtca 420acgttcatat cgctgacagt ttaatagcta caggagacga ttgtatctca gtcggtcgtg 480gttccaccaa tgtaaccgtc gaacgcgtga cttgtggccc aggacacggc ctaagtgtcg 540gtagtcttgg taagtacccg aacgaggaga atgttgccgg cattcacttt aggaattgca 600ccatgaaaga taccgacaat ggtcttagaa tcaagagttg gggtggttcg tctccaagca 660cggctgtgga catcacctat gaagatatta tgatgacaaa cgtcaagaac ccaatcatca 720ttgaccaaaa ctacggctca agaggcggag attcaaaagt tgcgataagc aatgtgctgt 780tcaagaacgt aagaggaaca acaattacaa aagatgaagt tcagttcatg tgcagcaaat 840cagtaccgtg caaaggagtc agcgtcgttg acgtggaatt gaacttcgta ggtgacaaag 900gaggacaccc ctcgtcgtca ggaggtttgg tcggagctct ttgtaccaac gccaatgtta 960tcttcggtgg aaaacttagc ttccctctgt gtcccaaata agcttttttg gtatacataa1020
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<400>5
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Val Thr Cys Gly Pro Gly His Gly Leu Ser Val Gly Ser Leu Gly Lys260 265 270Thr Pro Asn Glu Glu Asn Val Ala Gly Ile His Phe Arg Asn Cys Thr275 280 285Met Lys Asp Thr Asp Asn Gly Leu Arg Ile Lys Ser Trp Gly Gly Ser290 295 300Ser Pro Ser Thr Ala Val Asp Ile Thr Thr Glu Asp Ile Met Met Thr305 310 315 320Asn Val Lys Asn Pro Ile Ile Ile Asp Gln Asn Thr Gly Ser Arg Gly325 330 335Gly Asp Ser Lys Val Ala Ile Ser Asn Val Leu Phe Lys Asn Val Arg340 345 350Gly Thr Thr Ile Thr Lys Asp Glu Val Gln Phe Met Cys Ser Lys Ser355 360 365Val Pro Cys Lys Gly Val Ser Val Val Asp Val Glu Leu Asn Phe Val370 375 380Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Ser Ser Ser Gly Gly Leu Val Gly Ala385 390 395 400Leu Cys Thr Asn Ala Asn Val Ile Phe Gly Gly Lys Leu Ser Phe Pro405 410 415Leu Cys Pro Lys420
權利要求
1.一種白菜育性相關基因BCMF2，其特征在于，它具有SEQ ID No.1的序列。
2.一種白菜育性相關基因BCMF2的分離方法，其特征在于，包括以下步驟1)可育株系特異BCMF-A18T16-1基因片段的獲得用A18/T16引物對‘矮腳黃’白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育株系的表達差異進行cDNA-AFLP分析，發(fā)現可育株系的中蕾和大蕾中特異表達的一條帶在不育株系的中蕾和大蕾中中未表達，而且在可育株系和不育株系的其它時期也未表達；將該基因片段命名為BCMF-A18T16-1。2)BCMF-A18T16-1基因片段的回收、克隆與測序用針尖將上述BCMF-A18T16特異條帶挑一點作為模板進行PCR擴增，引物為A18和T16；PCR產物電泳檢測表明，該片段長度大約為300bp；克隆到T載體，將該重組質粒命名為pBCMF-A18T16-1；提取質粒，經酶切鑒定，結果表明，BCMF-A18T16-1片段已重組到T載體上，測序得出該片段為303bp，具有SEQ ID No.2的序列。3)與BCMF-A18T16-1片段相關的基因的cDNA的3’末端的獲得設計3’RACE特異引物SP1和SP2。SP1引物最后一個堿基與SP2引物的第一個堿基相差20個堿基。以可育大蕾雙鏈cDNA為模板，以3’RACE錨定引物分別與SP1和SP2組合進行嵌套式PCR擴增，電泳結果表明，第二次產物分子量略小于第一，第二次PCR產物的長度約為1200bp?；厥?’RACE第二次PCR的電泳條帶，克隆到T載體，送上海博亞生物技術有限公司測序。與BCMF-A18T16-1片段相關的基因3’端序列的長度是1177bp，去掉引物序列，實際擴增到1157bp，符合電泳結果；末尾有27個A的寡聚核苷酸序列。具體序列見SEQ ID.3。4)與BCMF-A18T16-1片段相關基因的cDNA的5’末端的獲得設計5’RACE的特異引物SP3和SP4，SP3引物最后一個堿基與SP4第一個堿基相差105個堿基。與5’RACE錨定引物通過嵌套式PCR進行擴增，測序獲得與BCMF-A18T16片段相關基因的5’末端的具有SEQ ID No.4的序列。5)與BCMF-A18T16-1片段相關的基因BCMF2的cDNA的全長序列的拼接將三次測序結果拼接，得到與BCMF-A18T16-1片段相關基因的全長序列，基因全長為1485bp，我們將其命名為BCMF2基因，該基因具有SEQ ID No.1的序列。6)BCMF2的ORF及其氨基酸序列的確定通過BLAST分析比較，BCMF2基因cDNA全序列與擬南芥多聚半乳糖醛酸酶mRNA序列相似性高達83％，將得到的BCMF2全長cDNA序列利用DNAStar軟件進行了ORF的分析和氨基酸序列的確定。發(fā)現該基因最大的ORF為1263bp，起始密碼子ATG位于第67位，終止密碼子為TAA，位于第1329位。ATG上游-3、-2和-1位核苷酸分別為A、C和C，+4位為核苷酸為G，這是一個典型的Kozak結構，這一結構對于蛋白質合成的40S起始復合物正確識別啟始密碼子具有很重要的作用。該ORF可以編碼420個氨基酸且具有SEQ ID No.5的序列。
3.根據權利要求2所述的白菜育性相關基因BCMF2的分離方法，其特征在于，所述用DNAStar軟件進行氨基酸序列的確定中，BCMF2的最大ORF從第67號堿基開始，1329號堿基終止，1263堿基編碼420個氨基酸且具有SEQ IDNo.5的序列。
4.根據權利要求2所述的白菜育性相關基因BCMF2的分離方法，其特征在于，所設計的兩條3’RACE嵌套式特異引物為SP15’-CAT GGC TCC AAG TGTGTG CCA GTC C-3’和SP25’-CCC TAA AGG AGA TTT CTT GGC T-3’。
5.根據權利要求2所述的白菜育性相關基因BCMF2的分離方法，其特征在于，所設計的兩條5’RACE嵌套式特異引物SP35’-CAC ACT TGG AGC CATGTG TTT AGA A-3’和SP45’-CAC CGA GAT ATT CAC CAT TAG C-3’。
全文摘要
本發(fā)明以“矮腳黃”白菜隱性雄性不育兩用系為材料，采用cDNA－AFLP方法對白菜可育株系和不育株系的時空表達特征進行分析，分離與育性基因相關的差異表達基因，Northern雜交進一步驗證其空間表達特征；通過RACE技術獲得BCMF2的cDNA全長序列，并對全長序列進行生物信息學分析。該方法適用于所有等基因系或近等基因系的植物群體，將為人工創(chuàng)建不育材料提供物質條件。
文檔編號C12Q1/68GK1587413SQ20041005285
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月12日 優(yōu)先權日2004年7月12日
發(fā)明者曹家樹, 王永勤, 余小林, 葉紈芝, 向珣, 盧鋼 申請人:浙江大學