專利名稱：將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法。
背景技術(shù)：
利用天然或者合成材料模擬細(xì)胞外基質(zhì)，使其與細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)和誘導(dǎo)細(xì)胞生長形成組織或器官，以達(dá)到修復(fù)或重建人體器官缺損的目的，已成為組織工程研究中廣為認(rèn)同的方法。細(xì)胞支架的制備及其與細(xì)胞間的結(jié)合，是組織工程需要解決的重要問題。
根據(jù)組織再生支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)，目前大量使用的支架分為兩類多孔支架和水凝膠支架。多孔支架由材料和材料間的間隙組成，在干態(tài)情況下，該間隙通常為空氣；在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，該間隙通常為培養(yǎng)基。目前，已發(fā)展了多種方法制備各種結(jié)構(gòu)的多孔支架，如致孔劑法、熱致相分離法、纖維編織法、乳液凍干法、微球堆積法、3維-印刷法等。多孔支架具有較好的機械強度和易調(diào)控的降解速率；容易宏觀塑型，在組織再生期間也能夠保持良好的宏觀形狀。但是這類支架也存在明顯的缺點。在體外培養(yǎng)條件下，多數(shù)體細(xì)胞具有貼壁生長特性，但是細(xì)胞的貼壁生長與其體內(nèi)狀態(tài)下的被基質(zhì)包圍生長有明顯的區(qū)別，細(xì)胞更容易去分化而失去生物學(xué)功能。細(xì)胞在孔壁上長時間生長分裂后，由于受到生長空間的限制而發(fā)生接觸抑制，無法繼續(xù)分裂，導(dǎo)致多孔支架上能夠附著的細(xì)胞數(shù)較天然狀態(tài)的組織要小，而且分布不平均。此外，由于多數(shù)合成材料的生物惰性，還必須對支架進(jìn)行生物相容性的改進(jìn)，增加了制備工藝的復(fù)雜性。水凝膠支架也是由材料與間隙構(gòu)成，該材料通常為天然的或合成的親水性高分子。聚合物材料形成纖細(xì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，其間含有大量的水。但這些水不是自由的，因受周圍水化高分子的束縛而處于高度結(jié)合的狀態(tài)。因此，水凝膠類支架與細(xì)胞外基質(zhì)具有類似的結(jié)構(gòu)和性能，尤其是天然大分子水凝膠材料有著優(yōu)良的生物相容性，能夠為細(xì)胞的生長與分化提供更接近于體內(nèi)的生長環(huán)境。同時，細(xì)胞分散在水凝膠中，具有更大的生長空間。這類支架同樣存在明顯的缺點，即機械強度普遍較差，宏觀塑型困難，在組織再生期間也無法保持良好的宏觀形狀，因此不能有效控制再生器官的形狀；同時，可操作性相對較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作過程簡單、適用范圍廣的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，以獲得同時具有良好機械性能和細(xì)胞相容性的組織工程支架。
本發(fā)明的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法是在溶膠狀態(tài)下將水凝膠導(dǎo)入到多孔支架中，然后改變外部條件使溶膠凝膠化，獲得復(fù)合水凝膠的多孔支架。
本發(fā)明的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，有三種技術(shù)解決方案。
方案一、將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，具體包括以下步驟1)4℃～120℃下將瓊脂溶解于水中制備成水凝膠的溶膠，再與等體積的含細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液混合，得到的溶膠重量體積濃度為0.5～5％；2)將多孔支架進(jìn)行滅菌處理，再用磷酸緩沖液預(yù)先潤濕；3)將溶膠滴加到多孔支架的表面，在重力和毛細(xì)作用下，將溶膠導(dǎo)入支架內(nèi)部；或?qū)⒅Ъ芙氲剿z溶膠中，將水凝膠吸附到多孔支架內(nèi)部；4)將復(fù)合有溶膠的支架在15℃～40℃下放置至少10分鐘，即得到負(fù)載了水凝膠的多孔支架。
通常為了提高這種復(fù)合支架的生物學(xué)性能，可在瓊脂中混入明膠或/和細(xì)胞生長因子，明膠用量與瓊脂用量的比例是1∶1～1∶100，細(xì)胞生長因子用量與瓊脂用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。所說的細(xì)胞生長因子可以是堿性促成纖維細(xì)胞生長因子、酸性促成纖維細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白或轉(zhuǎn)化因子β。
方案二、將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，具體包括以下步驟1)在4℃～120℃下將海藻酸鈉溶解于水中制備成水凝膠的溶膠，再與等體積的含細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液混合，得到的溶膠重量體積濃度為0.5～5％；2)將多孔支架進(jìn)行滅菌處理，再用磷酸緩沖液預(yù)先潤濕；3)將溶膠滴加到多孔支架的表面，在重力和毛細(xì)作用下，將溶膠導(dǎo)入支架內(nèi)部；或?qū)⒅Ъ芙氲剿z溶膠中，將水凝膠吸附到多孔支架內(nèi)部；4)將復(fù)合有溶膠的支架置于0.1％～2％乳酸鈣溶液中至少5分鐘，即得到負(fù)載了水凝膠的多孔支架。
通常為了提高這種復(fù)合支架的生物學(xué)性能，可在海藻酸鈉中混入明膠或/和細(xì)胞生長因子，明膠用量與海藻酸鈉用量的比例是1∶1～1∶100，細(xì)胞生長因子用量與海藻酸鈉用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。所說的細(xì)胞生長因子可以是堿性促成纖維細(xì)胞生長因子、酸性促成纖維細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白或轉(zhuǎn)化因子β。
方案三、將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，具體包括以下步驟1)在4℃～120℃下將殼聚糖與1～5倍重量的磷酸甘油脂二鈉鹽混合物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，或聚異丙基丙烯酰胺溶解于水中制備成水凝膠的溶膠，再與等體積的含細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液混合，得到溶膠的重量體積濃度為0.5～5％；2)將多孔支架進(jìn)行滅菌處理，再用磷酸緩沖液預(yù)先潤濕；3)將溶膠滴加到多孔支架的表面，在重力和毛細(xì)作用下，將溶膠導(dǎo)入支架內(nèi)部；或?qū)⒅Ъ芙氲剿z溶膠中，將水凝膠吸附到多孔支架內(nèi)部；4)將復(fù)合有溶膠的支架置于30℃～40℃條件下至少5分鐘，即得到負(fù)載了水凝膠的多孔支架。
本發(fā)明的上述三種技術(shù)解決方案中所說的多孔支架可以是聚合物類多孔支架，包括聚乳酸、膠原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，也可以是陶瓷類多孔支架，包括多孔羥基磷灰石、磷酸三鈣或生物玻璃支架。
本發(fā)明的上述三種技術(shù)解決方案中所說的細(xì)胞包括但不限于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。
本發(fā)明結(jié)合了多孔支架和水凝膠支架的優(yōu)點，既保持了多孔支架的良好的機械性能、宏觀塑型性能和宏觀形狀保持能力，又具有了水凝膠支架的良好的仿細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物相容性能。通過改變?nèi)苣z的組分，對于不同的細(xì)胞，可以有針對性的加入各種促細(xì)胞生長和分化因子，從而更進(jìn)一步的改善支架的生物學(xué)性能，方法簡單有效。本發(fā)明適用范圍廣，適用于多種結(jié)構(gòu)和組成的多孔支架和水凝膠，以及多種細(xì)胞；制備工藝簡單，重復(fù)性好，所制備的支架可以廣泛地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明為組織工程研究中細(xì)胞與支架的最佳結(jié)合提供一種切實可行的方法。通過本發(fā)明制備的多孔支架可以廣泛地應(yīng)用于皮膚、軟骨、骨、肝臟、血管、氣管、食管、肌腱、心臟瓣膜等多種組織或器官的重建和再生。


圖1是軟骨細(xì)胞在海藻酸鈉凝膠復(fù)合聚乳酸支架中的分布情況；圖2是軟骨細(xì)胞在瓊脂凝膠復(fù)合聚乳酸支架中的分布情況；圖3是軟骨細(xì)胞在瓊脂和明膠凝膠復(fù)合聚乳酸支架中的分布情況；圖4是軟骨細(xì)胞在堿性成纖維細(xì)胞生長因子和瓊脂凝膠復(fù)合聚乳酸支架中的分布情況；
圖5是成骨細(xì)胞在酸性成纖維細(xì)胞生長因子和海藻酸鈉凝膠復(fù)合膠原支架中的分布情況；圖6a是100微米聚乳酸多孔支架(黑色部分)填充海藻酸鈉水凝膠(白色部分)的激光共聚焦顯微鏡照片；圖6b是300微米聚乳酸多孔支架(黑色部分)填充海藻酸鈉水凝膠(白色部分)的激光共聚焦顯微鏡照片；圖7a是膠原多孔支架的激光共聚焦顯微鏡照片(羅丹明染色)；圖7b是分布在膠原多孔支架中的海藻酸鈉的激光共聚焦顯微鏡照片(熒光素鈉染色)；圖7c是圖6a和圖6b的復(fù)合圖。
具體實施例方式
以下實例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實例并不用來限制本發(fā)明。
實施例1 聚乳酸多孔支架導(dǎo)入含軟骨細(xì)胞的海藻酸鈉水凝膠配置重量體積濃度為2％的海藻酸鈉溶膠，放入高壓釜中120℃高溫滅菌30分鐘，冷卻至室溫后，將海藻酸鈉與軟骨細(xì)胞懸液混合，使最終海藻酸鈉的濃度為1％。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將溶膠和細(xì)胞混合物滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架置于0.5％的乳酸鈣溶液中15分鐘，通過鈣離子的交聯(lián)使海藻酸鈉凝膠化。最后，將復(fù)合支架置于5％CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育7天，測試細(xì)胞的存活與細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況，并與未導(dǎo)入海藻酸鈉水凝膠的空白聚乳酸支架相對比，見表1。支架中細(xì)胞的形態(tài)和分布情況見圖1?？梢娷浌羌?xì)胞能夠均勻分布在復(fù)合有海藻酸鈉水凝膠的聚乳酸支架中，細(xì)胞的活性更高。
表1聚乳酸多孔支架中導(dǎo)入海藻酸鈉水凝膠對軟骨細(xì)胞性能的影響

MTT指的是(3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍(lán))，測量的細(xì)胞活性以空白聚乳酸支架為100進(jìn)行歸一化處理。GAG代表硫酸軟骨素。羥脯氨酸與GAG的單位為每克支架中細(xì)胞分泌的毫克數(shù)。
實施例2聚乳酸多孔支架導(dǎo)入含軟骨細(xì)胞的瓊脂水凝膠配置重量體積濃度為2％的瓊脂溶膠，放入高壓釜中120℃高溫滅菌30分鐘，冷卻至45℃左右后，將瓊脂溶膠與軟骨細(xì)胞懸液混合，使最終瓊脂的濃度為1％。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將溶膠與細(xì)胞的混合物滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架在25℃下放置15分鐘使瓊脂凝膠化。最后，將復(fù)合支架置于5％CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育7天，測試細(xì)胞的存活與細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況，并與未導(dǎo)入瓊脂水凝膠的空白聚乳酸支架相對比，見表2。支架中細(xì)胞的形態(tài)和分布情況見圖2?？梢娷浌羌?xì)胞能夠均勻分布在復(fù)合有瓊脂水凝膠的聚乳酸支架中，細(xì)胞的活性更高，羥脯氨酸和GAG的分泌量更大。
表2聚乳酸多孔支架中導(dǎo)入瓊脂水凝膠對軟骨細(xì)胞性能的影響

實施例3聚乳酸多孔支架導(dǎo)入含軟骨細(xì)胞的瓊脂和明膠水凝膠配置重量體積濃度各為2％的瓊脂、明膠混合溶膠，放入高壓釜中120℃高溫滅菌30分鐘，冷卻至45℃左右后，將瓊脂溶膠、明膠溶膠與軟骨細(xì)胞懸液混合，使得最終瓊脂和明膠的濃度各為1％。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將溶膠與細(xì)胞的混合物滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架在25℃下放置15分鐘使瓊脂凝膠化。最后，將復(fù)合支架置于5％CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育7天，測試細(xì)胞的存活與細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況，并與未導(dǎo)入瓊脂水凝膠的空白聚乳酸支架和單純導(dǎo)入瓊脂的聚乳酸支架相對比，見表3。支架中細(xì)胞的形態(tài)和分布情況見圖3。可見軟骨細(xì)胞能夠均勻分布在復(fù)合有瓊脂和明膠水凝膠的聚乳酸支架中，細(xì)胞的活性更高，羥脯氨酸和GAG的分泌量更大。
表3聚乳酸多孔支架中導(dǎo)入瓊脂和明膠水凝膠對軟骨細(xì)胞性能的影響

由于明膠分子含有大量的羥脯氨酸，因而添加明膠后無法區(qū)分羥脯氨酸是細(xì)胞分泌的還是明膠中的。
實施例4聚乳酸多孔支架導(dǎo)入含軟骨細(xì)胞和堿性促成纖維細(xì)胞生長因子的瓊脂水凝膠配置重量體積濃度為2％的瓊脂溶膠，放入高壓釜中120℃高溫滅菌30分鐘，冷卻至45℃左右后，將瓊脂溶膠和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)與軟骨細(xì)胞懸液混合，使最終瓊脂的濃度為1％，bFGF濃度為100μg/mL。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將溶膠與細(xì)胞的混合物滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架在25℃下放置15分鐘使瓊脂凝膠化。最后，將復(fù)合支架置于5％CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育7天，測試細(xì)胞的存活與細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況，并與空白聚乳酸支架和單純導(dǎo)入瓊脂水凝膠的聚乳酸支架相對比，見表4。支架中細(xì)胞的形態(tài)和分布情況見圖4?？梢娷浌羌?xì)胞能夠均勻分布在復(fù)合有瓊脂水凝膠的聚乳酸支架中，細(xì)胞的活性有非常顯著的提高，羥脯氨酸和GAG的分泌量與單純瓊脂填充無顯著區(qū)別。
表4 聚乳酸多孔支架中導(dǎo)入bFGF和瓊脂水凝膠對軟骨細(xì)胞性能的影響

實施例5膠原多孔支架導(dǎo)入含成骨細(xì)胞和酸性促成纖維細(xì)胞生長因子的瓊脂水凝膠配置重量體積濃度為2％的海藻酸鈉溶膠，放入高壓釜中120℃高溫滅菌30分鐘，冷卻至室溫后，將海藻酸鈉和酸性促成纖維細(xì)胞生長因子混合(aFGF)與成骨細(xì)胞懸液混合，使最終海藻酸鈉的濃度為1％，aFGF濃度為30μg/mL。將平均孔徑約為100微米，孔隙率為99.9％，厚約2毫米的膠原薄片支架，置于三蒸水中浸泡，使支架溶漲。之后將支架浸入溶膠與細(xì)胞的混合液中震蕩半小時，使海藻酸鈉和軟骨細(xì)胞進(jìn)入膠原支架內(nèi)部。然后將支架置于0.1％的乳酸鈣溶液中10分鐘，通過鈣離子的交聯(lián)使海藻酸鈉凝膠化。最后，將復(fù)合支架置于5％CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育7天，支架中細(xì)胞的形態(tài)和分布情況見圖5。
實施例6聚乳酸多孔支架導(dǎo)入海藻酸鈉水凝膠在室溫下預(yù)先配置重量體積濃度為1％，2％的海藻酸鈉溶膠。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將海藻酸鈉溶膠滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架置于0.5％的乳酸鈣溶液中60分鐘，通過鈣離子的交聯(lián)使海藻酸鈉凝膠化。支架表面用三蒸水清洗后，干燥稱重。利用下列公式計算導(dǎo)入率導(dǎo)入率＝實際支架增重/理論計算支架增重結(jié)果發(fā)現(xiàn)在海藻酸鈉水凝膠濃度分別為1％和2％時，導(dǎo)入率分別為92％和94％。
實施例7聚乳酸多孔支架導(dǎo)入瓊脂水凝膠在室溫下預(yù)先配置重量體積濃度為1％，2％的瓊脂溶膠。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將濃度為1％或2％的瓊脂溶膠滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架在10℃下放置60分鐘使瓊脂凝膠化。導(dǎo)入水凝膠的支架表面用三蒸水清洗后，干燥稱重，計算導(dǎo)入率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在瓊脂水凝膠濃度分別為1％和2％時，導(dǎo)入率分別為100％和83％。
實施例8聚乳酸多孔支架導(dǎo)入殼聚糖水凝膠將200mg殼聚糖(去乙酰度為91％)溶于9ml 0.1M鹽酸溶液中。將560mg磷酸甘油脂二鈉溶于1ml去離子水中，溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，形成均相的溶液。將平均孔徑為300微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將處理過的支架浸泡到殼聚糖水凝膠中，20分鐘后在37℃處理5分鐘，使殼聚糖凝膠化。導(dǎo)入水凝膠的支架表面用三蒸水清洗后，干燥稱重，測得導(dǎo)入率為84.6％。
實施9聚乳酸多孔支架孔徑對水凝膠導(dǎo)入率的影響在室溫下預(yù)先配置重量體積濃度為2％的海藻酸鈉溶膠。將平均孔徑為300微米和100微米，厚度為2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通過抽真空的辦法，將支架中的空氣除去，使乙醇溶液完全浸潤支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，將支架放入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡1天，期間換液3次，以完全置換出支架中的乙醇。將海藻酸鈉溶膠與熒光素鈉混合，使最終海藻酸鈉的濃度為1％，熒光素鈉的濃度為0.01％，并滴加在處理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛細(xì)作用下，溶膠進(jìn)入支架內(nèi)部。然后將支架置于2％的乳酸鈣溶液中5分鐘，通過鈣離子的交聯(lián)使海藻酸鈉凝膠化。采用激光共聚焦顯微鏡觀察水凝膠在其中的分布情況，見圖6a、圖6b。支架表面用三蒸水清洗后，干燥稱重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在聚乳酸多孔支架的孔徑為100微米和300微米時，導(dǎo)入率分別為82％和92％。說明大孔徑有利于水凝膠的導(dǎo)入。
實施例10膠原多孔支架導(dǎo)入海藻酸鈉水凝膠將平均孔徑約為100微米，孔隙率均為99.9％，厚約2毫米的羅丹明標(biāo)記膠原薄片支架，置于三蒸水中浸泡，使支架溶漲。再將支架浸入溶有0.01％熒光素鈉的濃度為1％或2％的海藻酸鈉溶膠中震蕩半小時，使海藻酸鈉溶膠進(jìn)入膠原支架內(nèi)部。然后將支架置于0.1％的乳酸鈣溶液中50分鐘，通過鈣離子的交聯(lián)使海藻酸鈉凝膠化。采用激光共聚焦顯微鏡觀察，見圖7a、圖7b、圖7c。支架表面用三蒸水清洗后，干燥稱重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在海藻酸鈉水凝膠濃度分別為1％和2％時，導(dǎo)入率分別為100％和84％。
權(quán)利要求
1.將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，該方法包括以下步驟1)4℃～120℃下將瓊脂溶解于水中制備成水凝膠的溶膠，再與等體積的含細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液混合，得到的溶膠重量體積濃度為0.5～5％；2)將多孔支架進(jìn)行滅菌處理，再用磷酸緩沖液預(yù)先潤濕；3)將溶膠滴加到多孔支架的表面，在重力和毛細(xì)作用下，將溶膠導(dǎo)入支架內(nèi)部；或?qū)⒅Ъ芙氲剿z溶膠中，將水凝膠吸附到多孔支架內(nèi)部；4)將復(fù)合有溶膠的支架在15℃～40℃下放置至少10分鐘，即得到負(fù)載了水凝膠的多孔支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是在步驟1)中，在瓊脂中混入明膠或/和細(xì)胞生長因子，明膠用量與瓊脂用量的比例是1∶1～1∶100，細(xì)胞生長因子用量與瓊脂用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是所說的細(xì)胞生長因子是堿性促成纖維細(xì)胞生長因子、酸性促成纖維細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白或轉(zhuǎn)化因子β。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是所說的多孔支架為聚合物類多孔支架，包括聚乳酸、膠原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，或為陶瓷類多孔支架，包括多孔羥基磷灰石、磷酸三鈣或生物玻璃支架；所說的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。
5.將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，該方法包括以下步驟1)在4℃～120℃下將海藻酸鈉溶解于水中制備成水凝膠的溶膠，再與等體積的含細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液混合，得到的溶膠重量體積濃度為0.5～5％；2)將多孔支架進(jìn)行滅菌處理，再用磷酸緩沖液預(yù)先潤濕；3)將溶膠滴加到多孔支架的表面，在重力和毛細(xì)作用下，將溶膠導(dǎo)入支架內(nèi)部；或?qū)⒅Ъ芙氲剿z溶膠中，將水凝膠吸附到多孔支架內(nèi)部；4)將復(fù)合有溶膠的支架置于0.1％～2％乳酸鈣溶液中至少5分鐘，即得到負(fù)載了水凝膠的多孔支架。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是在步驟1)中，在海藻酸鈉中混入明膠或/和細(xì)胞生長因子，明膠用量與海藻酸鈉用量的比例是1∶1～1∶100，細(xì)胞生長因子用量與海藻酸鈉用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是所述的細(xì)胞生長因子是堿性促成纖維細(xì)胞生長因子、酸性促成纖維細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白或轉(zhuǎn)化因子β。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是所說的多孔支架為聚合物類多孔支架，包括聚乳酸、膠原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，或為陶瓷類多孔支架，包括多孔羥基磷灰石、磷酸三鈣或生物玻璃支架；所說的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。
9.將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，該方法包括以下步驟1)在4℃～120℃下將殼聚糖與1～5倍重量的磷酸甘油脂二鈉鹽混合物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，或聚異丙基丙烯酰胺溶解于水中制備成水凝膠的溶膠，再與等體積的含細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液混合，得到溶膠的重量體積濃度為0.5～5％；2)將多孔支架進(jìn)行滅菌處理，再用磷酸緩沖液預(yù)先潤濕；3)將溶膠滴加到多孔支架的表面，在重力和毛細(xì)作用下，將溶膠導(dǎo)入支架內(nèi)部；或?qū)⒅Ъ芙氲剿z溶膠中，將水凝膠吸附到多孔支架內(nèi)部；4)將復(fù)合有溶膠的支架置于30℃～40℃條件下至少5分鐘，即得到負(fù)載了水凝膠的多孔支架。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法，其特征是所說的多孔支架為聚合物類多孔支架，包括聚乳酸、膠原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，或為陶瓷類多孔支架，包括多孔羥基磷灰石、磷酸三鈣或生物玻璃支架；所說的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將水凝膠復(fù)合到多孔組織工程支架中的方法。該方法是是在溶膠狀態(tài)下將水凝膠導(dǎo)入到多孔支架中，然后改變外部條件使溶膠凝膠化，獲得復(fù)合水凝膠的多孔支架。根據(jù)需要，水凝膠溶膠中還可添加細(xì)胞生長與分化的細(xì)胞生長因子。本發(fā)明方法制得的支架同時具備多孔支架的良好的機械性能和水凝膠支架的優(yōu)良的生物相容性能。本發(fā)明適用范圍廣，適用于多種結(jié)構(gòu)和組成的多孔支架和水凝膠，以及多種細(xì)胞；制備工藝簡單，重復(fù)性好，所制備的支架可以廣泛地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/02GK1586636SQ20041005298
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者高長有, 龔逸鴻, 何麗娟, 馬祖?zhèn)? 沈家驄 申請人:浙江大學(xué)