本發(fā)明涉及一種可降解軟/硬仿生復(fù)合軟骨組織支架材料的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兼具類天然組織環(huán)境與良好機(jī)械強(qiáng)度的仿生復(fù)合支架的制備方法，可望應(yīng)用于軟骨組織工程支架材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于機(jī)械損傷或關(guān)節(jié)炎造成的軟骨缺損是醫(yī)學(xué)上長(zhǎng)期難以克服的問(wèn)題。成年軟骨修復(fù)能力有限，軟骨缺損直徑小于3mm能自發(fā)修復(fù)，但當(dāng)直徑大于3mm時(shí)，缺損部位無(wú)法自行修復(fù)。組織工程學(xué)技術(shù)為骨缺損的修復(fù)提供了新的方法，它具有對(duì)供體損傷小、無(wú)抗原性、可制成三維立體、解剖結(jié)構(gòu)精確等優(yōu)點(diǎn)，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。
應(yīng)用于軟骨組織修復(fù)的合成可降解高分子主要有聚乳酸（PLA）、聚丙乙交酯（PLGA）等。其中PLGA由于具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和易調(diào)控的降解速率，容易宏觀塑形等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物緩釋等領(lǐng)域，但其低的親水性、活性基團(tuán)和生物信號(hào)分子的缺乏以及體內(nèi)酸性降解產(chǎn)物的累積等缺陷導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。
目前對(duì)PLA或PLGA等進(jìn)行共聚或接枝改性是改善其性能的重要方法之一。如采用表面可控胺解技術(shù)、接枝-涂層、偶聯(lián)或?qū)?層（LBL）自組裝技術(shù)將細(xì)胞相容性物質(zhì)如膠原、纖維蛋白等固定到聚乳酸類物質(zhì)表面，可改善高聚物支架的親水性能和細(xì)胞識(shí)別能力。
馬來(lái)酸酐是一種可在生物體內(nèi)正常代謝的多官能團(tuán)物質(zhì)，其酸酐中的碳-碳雙鍵可發(fā)生自由基反應(yīng)。采用接枝法將馬來(lái)酸酐和脂肪二胺引入PLA或PLGA鏈制備可降解聚合物，可望在進(jìn)一步提高材料親水性能的同時(shí)有效緩解材料在降解過(guò)程中酸性物質(zhì)積累的問(wèn)題。本課題組采用D,L-丙交酯、乙交酯和馬來(lái)酸酐通過(guò)直接熔融聚合獲得了馬來(lái)酸酐接枝聚丙乙交酯（MPLGA），已成功申請(qǐng)專利（見ZL2013.10564511.1），該方法操作簡(jiǎn)單，獲得的共聚物中具有較高的酸酐接枝率（2.0~10.0wt%）。在MPLGA骨架中進(jìn)一步引入乙二胺，可獲得含有堿性基團(tuán)的共聚物EMPLGA（見專利ZL201410420672.8），有效緩解材料在降解過(guò)程中酸性物質(zhì)積累的問(wèn)題。但由于直接熔融共聚制備MPLGA過(guò)程中共聚物的分子量受單體和馬來(lái)酸酐的純度影響很大，且參與反應(yīng)的物質(zhì)越多，其分子量的影響因素越復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性越差，同時(shí)獲得的MPLGA分子量較?。ǎ?.0 × 105Da），無(wú)法滿足不同醫(yī)用材料的需求，限制了其在生物醫(yī)用材料臨床的應(yīng)用。
水凝膠在組成和性能上與正常的細(xì)胞外基質(zhì)極為相似，具有優(yōu)異生物相容性：細(xì)胞可以懸浮于水凝膠中生長(zhǎng)，呈天然的球形，有利于維持細(xì)胞的正常表型。用于軟骨組織修復(fù)的天然水凝膠主要包括膠原、纖維蛋白膠、海藻酸鹽、明膠、透明質(zhì)酸和瓊脂等。但水凝膠多孔材料存在機(jī)械強(qiáng)度小、形狀保持能力差以及消毒比較困難等不足。
本發(fā)明采用D,L-丙交酯、乙交酯熔融共聚獲得高分子量的PLGA，再以馬來(lái)酸酐直接接枝到PLGA骨架中，接枝過(guò)程中PLGA分子量下降程度小，可獲得高分子量MPLGA，進(jìn)一步引入乙二胺，獲得具有堿性功能基團(tuán)的高分子量EMPLGA，采用造孔劑法制備高分子量的EMPLGA多孔“硬”支架。
通過(guò)對(duì)軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的仿生模擬，將明膠/透明質(zhì)酸水凝膠“軟”支架和明膠/透明質(zhì)酸微球復(fù)合到預(yù)先成型的EMPLGA“硬”支架中。水凝膠“軟”支架能為軟骨細(xì)胞提供一個(gè)類天然組織的生長(zhǎng)環(huán)境，以有效保持軟骨細(xì)胞的自然形態(tài)，引導(dǎo)細(xì)胞的正常增殖、分化和功能表達(dá)，明膠/透明質(zhì)酸微球能復(fù)合生物活性因子，可望實(shí)現(xiàn)其分步可控釋放，進(jìn)一步賦予該復(fù)合仿生支架更為優(yōu)越的生物學(xué)性能。EMPLGA“硬”支架能在軟骨修復(fù)過(guò)程中提供足夠高的機(jī)械強(qiáng)度、可控的降解速率和良好的形狀保持能力。該仿生復(fù)合支架兼具類天然組織環(huán)境與良好機(jī)械強(qiáng)度，可望應(yīng)用于軟骨組織工程支架材料領(lǐng)域。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供支架兼具類天然組織環(huán)境與良好機(jī)械強(qiáng)度的仿生復(fù)合支架的制備方法。
本發(fā)明方法的步驟如下：
（1）將D,L-丙交酯、乙交酯加入干燥處理后的安瓿瓶中，再加入一定量辛酸亞錫(Sn(Oct)2)；真空干燥12~24 h后，在常溫下采用擴(kuò)散泵抽高真空0.5~1.0 h，使安瓿瓶?jī)?nèi)壓強(qiáng)低于5.0Pa，封管。將封管后的安瓿瓶放入恒溫箱中，在120~170℃溫度下反應(yīng)12~60 h后取出。將粗產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，配制成1.0~5.0wt%溶液，然后滴入3~5倍體積的乙醇中沉析，反復(fù)沉析3~5次，將提純后的產(chǎn)物真空干燥至恒重即得PLGA聚合物。
（2）將純化后的PLGA與一定量的馬來(lái)酸酐、過(guò)氧化二苯甲酰（BPO）混合，置于減壓、100℃的環(huán)境中反應(yīng)24h即得到MPLGA粗聚物。將粗聚物置于Soxhelt抽提器內(nèi)，以三氯甲烷為溶劑抽提8 h，每小時(shí)回流4~6次以除去均聚物，將抽提后的共聚物40℃下真空干燥至恒重。將共聚物加入到三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍體積的乙醇中沉析，反復(fù)沉析3~5次，然后將提純物40℃下真空干燥至恒重，得到純MPLGA。
（3）將純化后的MPLGA溶于三氯甲烷中，配制成20.0~30.0wt%的MPLGA的三氯甲烷溶液。
（4）將乙二胺溶于三氯甲烷中，配制成濃度為38.0wt%的乙二胺的三氯甲烷溶液。
（5）在攪拌的條件下，將步驟（4）所得乙二胺的三氯甲烷溶液滴入到步驟（3）所得MPLGA的三氯甲烷溶液中，冰浴控制反應(yīng)體系溫度低于10℃，保溫5~10min，再將溫度升至室溫反應(yīng)30~60min，最后將產(chǎn)物滴入過(guò)量的乙醇中沉析，反復(fù)沉析3~5次，用去離子水洗滌至中性，真空干燥至恒重，得到乙二胺改性馬來(lái)酸酐化聚丙乙交酯聚合物（EMPLGA）固體。
（6）稱取一定量EMPLGA溶入三氯甲烷中，充分溶解后將一定量的300~450μm的Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并攪拌均勻，室溫下?lián)]發(fā)出大量溶劑后，將混合物加入到鋼制模具中，壓制成型。室溫下干燥6小時(shí)后將樣品在稀鹽酸溶液中浸泡3小時(shí)，洗滌后再用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每3~4小時(shí)換一次水，得到的多孔支架在空氣中干燥24小時(shí)，真空干燥48小時(shí)。
（7）將明膠（Gel）和透明質(zhì)酸（HA），按重量比95:5，配制明膠/明質(zhì)酸混合水溶液。向容器中加入液體石蠟加熱至60℃，再向容器中加入少量span-80，機(jī)械攪拌。取明膠/透明質(zhì)酸混合溶液加入到容器中，攪拌，使液滴均勻的分散于油相中，所述加入容器中的明膠/透明質(zhì)酸混合溶與液體石蠟的體積比為13:87。然后將容器置于冰水浴中，待體系冷卻，溫度低于4℃后，加入少量戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)、固化成球。用丙酮與水（體積比3:1）的混合溶液洗滌2~3次，濾去液體石蠟和水，最后用純丙酮洗滌，抽濾，自然涼干，所得復(fù)合微球表面光滑。
（8）取一定量冰醋酸，用蒸餾水稀釋到PH值4.7左右，將明膠和透明質(zhì)酸，按重量比8:2分別加入溶解，均配制成5mg/mL的溶液。將配制好的明膠溶液與透明質(zhì)酸溶液均勻混合。
（9）向步驟（8）中的混合溶液中加入一定量步驟（7）制得的Gel/HA微球得到復(fù)合體系，所加溶膠與微球的質(zhì)量比為10:1。將Gel/HA 溶膠與微球的復(fù)合體系置于連有真空裝置的燒瓶中，然后將圓柱體狀EMPLGA 多孔“硬”支架材料浸泡于復(fù)合體系中，抽真空20~30min。將復(fù)合支架取出放入冷凍干燥機(jī)中冷凍12h，干燥48h。取出后，用碳化二亞胺（EDC）的乙醇溶液浸泡24h，然后用乙醇溶液浸泡12h，每4h 換一次水。將浸泡好的復(fù)合支架材料放入空氣中干燥48h，真空干燥，得EMPLGA/Gel-HA水凝膠-微球仿生復(fù)合支架。
步驟（1）中，所述D,L-丙交酯、乙交酯、辛酸亞錫的重量比為：D,L-丙交酯70.0~80.0wt%、乙交酯20.0~30.0wt%、辛酸亞錫0.01~0.03wt%，且辛酸亞錫經(jīng)脫水處理。
步驟（1）中，所述三氯甲烷溶液（1.0~5.0wt%）的濃度直接與PLGA分子量大小有關(guān)，分子量越大，配制的三氯甲烷溶液濃度應(yīng)越小。
步驟（2）中，所述馬來(lái)酸酐的量為D,L-丙交酯、乙交酯單體總量的5~10 wt%，過(guò)氧化苯甲酰的加入量為馬來(lái)酸酐重量的1~5 wt%。所述的減壓環(huán)境為壓力低于0.09MPa。
步驟（5）中，所述乙二胺的加入量為MPLGA質(zhì)量的20.0~30.0%。
步驟（6）EMPLGA與三氯甲烷的濃度為1.0~5.0wt%，鹽酸的濃度為5.0-10.0wt%，EMPLGA與Na2CO3的質(zhì)量比為1:5。
步驟（7）中，明膠/透明質(zhì)酸混合溶液的濃度為20.0~25.0wt%，span-80的濃度為0.016~0.020g/L，攪拌速率200~800r/min，戊二醛的濃度為0.3mL/g。
步驟（9）中真空度為0.07~0.09MPa，碳化二亞胺的乙醇溶液濃度為0.1wt%。
本發(fā)明成功設(shè)計(jì)出了兼具類天然組織環(huán)境與良好機(jī)械強(qiáng)度的由高分子量EMPLGA和明膠/透明質(zhì)酸水凝膠-微球構(gòu)成的可降解仿生復(fù)合支架材料，為該仿生復(fù)合支架的制備方法提供了詳細(xì)的說(shuō)明。
本發(fā)明所得到的EMPLGA/水凝膠-微球仿生復(fù)合支架具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）采用直接熔融共聚制備的PLGA分子量可達(dá)1.0~2.0 × 105Da，共價(jià)引入馬來(lái)酸酐和乙二胺，獲得了含馬來(lái)酸酐和胺基活性基團(tuán)的高分子量EMPLGA，拓展其降解性能的調(diào)控范圍，同時(shí)能有效緩解材料在降解過(guò)程中酸性物質(zhì)積累。
（2）設(shè)計(jì)出了兼具類天然組織環(huán)境與良好機(jī)械強(qiáng)度的仿生復(fù)合支架，EMPLGA“硬”支架能提供足夠高的機(jī)械強(qiáng)度、可控的降解速率和良好的形狀保持能力。水凝膠“軟”支架能為軟骨細(xì)胞提供一個(gè)類天然組織的生長(zhǎng)環(huán)境，明膠/透明質(zhì)酸微球能復(fù)合生物活性因子，可望實(shí)現(xiàn)其分步可控釋放，進(jìn)一步賦予該復(fù)合仿生支架更為優(yōu)越的生物學(xué)性能。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，所述的原料份數(shù)除特別說(shuō)明外，均為重量份數(shù)。
實(shí)施例1：
將78.0g干燥后的D,L-丙交酯、22.0g乙交酯加入干燥處理后的安瓿瓶中，再加入0.015g經(jīng)脫水處理的辛酸亞錫(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在4.0Pa的條件下用酒精噴燈封管。將封管后的安瓿瓶放入恒溫箱中，在140℃溫度下反應(yīng)24 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗產(chǎn)物PLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.76×105Da，Mw/Mn=1.21。
將粗產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，配制成2.0wt%溶液，滴入3倍體積的乙醇中沉析3次，真空干燥。將純化后的PLGA與6.0g馬來(lái)酸酐、0.20g過(guò)氧化二苯甲?；旌?，置于三頸燒瓶中，在壓強(qiáng)為0.084MPa、100℃的條件下反應(yīng)24h得MPLGA粗聚物。將接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器內(nèi)，以三氯甲烷為溶劑抽提8 h，將抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成2.0wt%溶液，滴入3倍體積的乙醇中沉析3次，然后將提純物真空干燥至恒重，得到淡黃色純接枝共聚物MPLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.71×105Da，Mw/Mn=1.24，接枝率為1.11%。
將10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制20.0wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等體積的乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。將MPLGA的三氯甲烷加入裝有攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，在攪拌的條件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制體系溫度低于10℃。滴加完畢，保溫5min后，再將溫度升至室溫反應(yīng)60 min。將產(chǎn)物滴入過(guò)量的乙醇溶液中沉淀析出，用去離子水洗滌呈中性，產(chǎn)物40℃真空干燥至恒重，得到黃色的EMPLGA固體。
稱取2.0gEMPLGA溶入25mL三氯甲烷中，充分溶解后將10.0g粒徑為300~450μm的Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并攪拌均勻，室溫下?lián)]發(fā)出大量溶劑后，將混合物加入到鋼制模具中，壓制成型。室溫下干燥6小時(shí)后將樣品在5.0wt%溶液中浸泡3小時(shí)，洗滌后再用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水，得到的多孔支架在空氣中干燥24小時(shí)，真空干燥48小時(shí)。
取15.8g明膠和0.83g透明質(zhì)酸，配制成20.0%的明膠/透明質(zhì)酸混合溶液；向250mL圓底燒瓶中加入50mL液體石蠟，水浴加熱至60℃后，再加入0.8g濃度為0.012g/L的span-80，以200r/min機(jī)械攪拌30min，形成穩(wěn)定的乳液后，加入10mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶液，乳化10min，待乳化完全后迅速冷卻至4℃以下，再加入200μL的戊二醛交聯(lián)固化2小時(shí)。
取10mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋到PH值4.7左右，得到醋酸溶液。將8.0g明膠和2.0g透明質(zhì)酸，分別加入溶解，均配制成5mg/mL的溶液。將配制好的明膠溶液與透明質(zhì)酸溶液均勻混合。
向40mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶膠中加入20.0mgGel/HA微球。將Gel/HA 溶膠與微球的復(fù)合體系置于連有真空裝置的燒瓶中，然后將圓柱體EMPLGA 多孔“硬”支架材料浸泡于復(fù)合體系中，在0.082MPa的條件下抽真空20~30min。將復(fù)合支架取出放入冷凍干燥機(jī)中冷凍12h，干燥48h。取出后，用0.1%的碳化二亞胺的乙醇溶液浸泡24h，然后用乙醇溶液浸泡12h，每4h 換一次水。將浸泡好的復(fù)合支架材料放入空氣中干燥48h，真空干燥。
實(shí)施例2：
將76.0g干燥后的D,L-丙交酯、24.0g乙交酯加入干燥處理后的安瓿瓶中，再加入0.022g經(jīng)脫水處理的辛酸亞錫(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在5.0Pa的條件下用酒精噴燈封管。將封管后的安瓿瓶放入恒溫箱中，在120℃溫度下反應(yīng)36 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗產(chǎn)物PLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.45×105Da，Mw/Mn=1.31。
將粗產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，配制成3.0wt%溶液，滴入4倍體積的乙醇中沉析4次，真空干燥。將純化后的PLGA與6.5g馬來(lái)酸酐、0.25g過(guò)氧化二苯甲?；旌希糜谌i燒瓶中，在壓強(qiáng)為0.065MPa、100℃的條件下反應(yīng)24h得MPLGA粗聚物。將接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器內(nèi)，以三氯甲烷為溶劑抽提8 h，將抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成3.0wt%溶液，滴入4倍體積的乙醇中沉析4次，然后將提純物真空干燥至恒重，得到淡黃色純接枝共聚物MPLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.39×105Da，Mw/Mn=1.35，接枝率為0.98%。
將10g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制25.0wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等體積的乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。將MPLGA的三氯甲烷加入裝有攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，在攪拌的條件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制體系溫度低于10℃。滴加完畢，保溫5min后，再將溫度升至室溫反應(yīng)60 min。將產(chǎn)物滴入過(guò)量的乙醇溶液中沉淀析出，用去離子水洗滌呈中性，產(chǎn)物40℃真空干燥至恒重，得到黃色的EMPLGA固體。
稱取3.0gEMPLGA溶入37.5mL三氯甲烷中，充分溶解后將15.0g粒徑為300~450μm的Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并攪拌均勻，室溫下?lián)]發(fā)出大量溶劑后，將混合物加入到鋼制模具中，壓制成型。室溫下干燥6小時(shí)后將樣品在7.5wt%溶液中浸泡3小時(shí)，洗滌后再用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水，得到的多孔支架在空氣中干燥24小時(shí)，真空干燥48小時(shí)。
取15.8g明膠和0.83g透明質(zhì)酸，配制成22.5%的明膠/透明質(zhì)酸混合溶液；向250mL圓底燒瓶中加入50mL液體石蠟，水浴加熱至60℃后，再加入0.8g濃度為0.016g/L的span-80，以300r/min機(jī)械攪拌30min，形成穩(wěn)定的乳液后，加入10mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶液，乳化10min，待乳化完全后迅速冷卻至4℃以下，再加入200μL的戊二醛交聯(lián)固化2小時(shí)。
取10mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋到PH值4.7左右，得到醋酸溶液。將7.0g明膠和1.75g透明質(zhì)酸，分別加入溶解，均配制成5mg/mL的溶液。將配制好的明膠溶液與透明質(zhì)酸溶液均勻混合。
向50mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶膠中加入25.0mgGel/HA微球。將Gel/HA 溶膠與微球的復(fù)合體系置于連有真空裝置的燒瓶中，然后將圓柱體EMPLGA 多孔“硬”支架材料浸泡于復(fù)合體系中，在0.085MPa的條件下抽真空20~30min。將復(fù)合支架取出放入冷凍干燥機(jī)中冷凍12h，干燥48h。取出后，用0.1%的碳化二亞胺的乙醇溶液浸泡24h，然后用乙醇溶液浸泡12h，每4h 換一次水。將浸泡好的復(fù)合支架材料放入空氣中干燥48h，真空干燥。
實(shí)施例3：
將73.0g干燥后的D,L-丙交酯、27.0g乙交酯加入干燥處理后的安瓿瓶中，再加入0.025g經(jīng)脫水處理的辛酸亞錫(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在6.0Pa的條件下用酒精噴燈封管。將封管后的安瓿瓶放入恒溫箱中，在130℃溫度下反應(yīng)36 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗產(chǎn)物PLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.85×105Da，Mw/Mn=1.23。
將粗產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，配制成4.0wt%溶液，滴入5倍體積的乙醇中沉析5次，真空干燥。將純化后的PLGA與6.8g馬來(lái)酸酐、0.18g過(guò)氧化二苯甲?；旌希糜谌i燒瓶中，在壓強(qiáng)為0.076MPa、100℃的條件下反應(yīng)24h得MPLGA粗聚物。將接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器內(nèi)，以三氯甲烷為溶劑抽提8 h，將抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成4.0wt%溶液，滴入5倍體積的乙醇中沉析5次，然后將提純物真空干燥至恒重，得到淡黃色純接枝共聚物MPLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.80×105Da，Mw/Mn=1.27，接枝率為0.89%。
將10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制30.0wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等體積的乙二胺和三氯甲烷混合配制38wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。將MPLGA的三氯甲烷加入裝有攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，在攪拌的條件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制體系溫度低于10℃。滴加完畢，保溫5min后，再將溫度升至室溫反應(yīng)60 min。將產(chǎn)物滴入過(guò)量的乙醇溶液中沉淀析出，用去離子水洗滌呈中性，產(chǎn)物40℃真空干燥至恒重，得到黃色的EMPLGA固體。
稱取2.5gEMPLGA溶入31mL三氯甲烷中，充分溶解后將12.5g粒徑為300~450μm的Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并攪拌均勻，室溫下?lián)]發(fā)出大量溶劑后，將混合物加入到鋼制模具中，壓制成型。室溫下干燥6小時(shí)后將樣品在6.0wt%溶液中浸泡3小時(shí)，洗滌后再用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水，得到的多孔支架在空氣中干燥24小時(shí)，真空干燥48小時(shí)。
取15.8g明膠和0.83g透明質(zhì)酸，配制成25.0%的明膠/透明質(zhì)酸混合溶液；向250mL圓底燒瓶中加入50mL液體石蠟，水浴加熱至60℃后，再加入0.8g的濃度為0.02g/L的span-80，以400r/min機(jī)械攪拌30min，形成穩(wěn)定的乳液后，加入10mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶液，乳化10min，待乳化完全后迅速冷卻至4℃以下，再加入200μL的戊二醛交聯(lián)固化2小時(shí)成球。
取10mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋到PH值4.7左右，得到醋酸溶液。將6.0g明膠和1.5g透明質(zhì)酸，分別加入溶解，均配制成5mg/mL的溶液。將配制好的明膠溶液與透明質(zhì)酸溶液均勻混合。
向45mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶膠中加入22.5mgGel/HA微球。將Gel/HA 溶膠與微球的復(fù)合體系置于連有真空裝置的燒瓶中，然后將圓柱體EMPLGA 多孔“硬”支架材料浸泡于復(fù)合體系中，在0.078MPa的條件下抽真空20~30min。將復(fù)合支架取出放入冷凍干燥機(jī)中冷凍12h，干燥48h。取出后，用0.1%的碳化二亞胺的乙醇溶液浸泡24h，然后用乙醇溶液浸泡12h，每4h 換一次水。將浸泡好的復(fù)合支架材料放入空氣中干燥48h，真空干燥。
實(shí)施例4：
將75.0g干燥后的D,L-丙交酯、25.0g乙交酯加入干燥處理后的安瓿瓶中，再加入0.026g經(jīng)脫水處理的辛酸亞錫(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在7.0Pa的條件下用酒精噴燈封管。將封管后的安瓿瓶放入恒溫箱中，在150℃溫度下反應(yīng)36 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗產(chǎn)物PLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.54×105Da，Mw/Mn=1.35。
將粗產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，配制成5.0wt%溶液，滴入3倍體積的乙醇中沉析3次，真空干燥。將純化后的PLGA與7.0g馬來(lái)酸酐、0.15g過(guò)氧化二苯甲?；旌?，置于三頸燒瓶中，在壓強(qiáng)為0.086MPa、100℃的條件下反應(yīng)24h得MPLGA粗聚物。將接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器內(nèi)，以三氯甲烷為溶劑抽提8 h，將抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成5.0wt%溶液，滴入3倍體積的乙醇中沉析3次，然后將提純物真空干燥至恒重，得到淡黃色純接枝共聚物MPLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.48×105Da，Mw/Mn=1.38，接枝率為1.05%。
將10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制22.5wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等體積的乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。將MPLGA的三氯甲烷加入裝有攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，在攪拌的條件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制體系溫度低于10℃。滴加完畢，保溫5min后，再將溫度升至室溫反應(yīng)60 min。將產(chǎn)物滴入過(guò)量的乙醇溶液中沉淀析出，用去離子水洗滌呈中性，產(chǎn)物40℃真空干燥至恒重，得到黃色的EMPLGA固體。
稱取3.0gEMPLGA溶入37.5mL三氯甲烷中，充分溶解后將15.0g粒徑為300~450μm的Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并攪拌均勻，室溫下?lián)]發(fā)出大量溶劑后，將混合物加入到鋼制模具中，壓制成型。室溫下干燥6小時(shí)后將樣品在8.0wt%溶液中浸泡3小時(shí)，洗滌后再用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水，得到的多孔支架在空氣中干燥24小時(shí)，真空干燥48小時(shí)。
取15.8g明膠和0.83g透明質(zhì)酸，配制成21.0%的明膠/透明質(zhì)酸混合溶液；向250mL圓底燒瓶中加入50mL液體石蠟，水浴加熱至60℃后，再加入0.8g的濃度為0.012g/L的span-80，以500r/min機(jī)械攪拌30min，形成穩(wěn)定的乳液后，加入10mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶液，乳化10min，待乳化完全后迅速冷卻至4℃以下，再加入200μL的戊二醛交聯(lián)固化2小時(shí)成球。
取10mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋到PH值4.7左右，得到醋酸溶液。將5.0g明膠和1.25g透明質(zhì)酸，分別加入溶解，均配制成5mg/mL的溶液。將配制好的明膠溶液與透明質(zhì)酸溶液均勻混合。
向35mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶膠中加入17.5mgGel/HA微球。將Gel/HA 溶膠與微球的復(fù)合體系置于連有真空裝置的燒瓶中，然后將圓柱體EMPLGA 多孔“硬”支架材料浸泡于復(fù)合體系中，在0.086MPa的條件下抽真空20~30min。將復(fù)合支架取出放入冷凍干燥機(jī)中冷凍12h，干燥48h。取出后，用0.1%的碳化二亞胺的乙醇溶液浸泡24h，然后用乙醇溶液浸泡12h，每4h 換一次水。將浸泡好的復(fù)合支架材料放入空氣中干燥48h，真空干燥。
實(shí)施例5：
將80.0g干燥后的D,L-丙交酯、20.0g乙交酯加入干燥處理后的安瓿瓶中，再加入0.030g經(jīng)脫水處理的辛酸亞錫(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在8.0Pa的條件下用酒精噴燈封管。將封管后的安瓿瓶放入恒溫箱中，在160℃溫度下反應(yīng)36 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗產(chǎn)物PLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.32×105Da，Mw/Mn=1.38。
將粗產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，配制成4.0wt%溶液，滴入3倍體積的乙醇中沉析3次，真空干燥。將純化后的PLGA與6.2g馬來(lái)酸酐、0.18g過(guò)氧化二苯甲?；旌?，置于三頸燒瓶中，在壓強(qiáng)為0.068MPa、100℃的條件下反應(yīng)24h得MPLGA粗聚物。將接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器內(nèi)，以三氯甲烷為溶劑抽提8 h，將抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3倍體積的乙醇中沉析3次，然后將提純物真空干燥至恒重，得到淡黃色純接枝共聚物MPLGA。所得產(chǎn)品Mw=1.27×105Da，Mw/Mn=1.43，接枝率為0.95%。
將10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制27.5wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等體積的乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。將MPLGA的三氯甲烷加入裝有攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，在攪拌的條件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制體系溫度低于10℃。滴加完畢，保溫5min后，再將溫度升至室溫反應(yīng)60 min。將產(chǎn)物滴入過(guò)量的乙醇溶液中沉淀析出，用去離子水洗滌呈中性，產(chǎn)物40℃真空干燥至恒重，得到黃色的EMPLGA固體。
稱取2.0gEMPLGA溶入25mL三氯甲烷中，充分溶解后將10.0g粒徑為300~450μm的Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并攪拌均勻，室溫下?lián)]發(fā)出大量溶劑后，將混合物加入到鋼制模具中，壓制成型。室溫下干燥6小時(shí)后將樣品在10.0wt%溶液中浸泡3小時(shí)，洗滌后再用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水，得到的多孔支架在空氣中干燥24小時(shí)，真空干燥48小時(shí)。
取15.8g明膠和0.83g透明質(zhì)酸，配制成23.5%的明膠/透明質(zhì)酸混合溶液；向250mL圓底燒瓶中加入50mL液體石蠟，水浴加熱至60℃后，再加入0.8g的濃度為0.020g/L的span-80，以600r/min機(jī)械攪拌30min，形成穩(wěn)定的乳液后，加入10mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶液，乳化10min，待乳化完全后迅速冷卻至4℃以下，再加入200μL的戊二醛交聯(lián)固化2小時(shí)成球。
取10mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋到PH值4.7左右，得到醋酸溶液。將4.0g明膠和1.0g透明質(zhì)酸，分別加入溶解，均配制成5mg/mL的溶液。將配制好的明膠溶液與透明質(zhì)酸溶液均勻混合。
向40mL明膠/透明質(zhì)酸混合溶膠中加入20.0mgGel/HA微球。將Gel/HA 溶膠與微球的復(fù)合體系置于連有真空裝置的燒瓶中，然后將圓柱體EMPLGA 多孔“硬”支架材料浸泡于復(fù)合體系中，在0.075MPa的條件下抽真空20~30min。將復(fù)合支架取出放入冷凍干燥機(jī)中冷凍12h，干燥48h。取出后，用0.1%的碳化二亞胺的乙醇溶液浸泡24h，然后用乙醇溶液浸泡12h，每4h 換一次水。將浸泡好的復(fù)合支架材料放入空氣中干燥48h，真空干燥。