專(zhuān)利名稱(chēng):用清蛋白聚合的血清親合結(jié)合法純化乙型肝炎表面抗原前-s-區(qū)的制作方法
本發(fā)明涉及純化酵母表達(dá)的重組體前-S-Hepatitis B表面抗原(HBsAg，前S-肝炎B)的一種快速有效方法。
已證實(shí)該表面抗原肝炎B前-S區(qū)是病毒受體位點(diǎn)，在肝炎B病毒進(jìn)入肝細(xì)胞之前，該區(qū)結(jié)合于肝細(xì)胞，Valenzuela et al，Bio/Technology 3∶317-320(1985)，該前-S區(qū)結(jié)合于聚合的血清清蛋白，認(rèn)為聚合的血清清蛋白與肝細(xì)胞膜有關(guān)，因此，含有前-S的，衍生的重組體抗原被稱(chēng)作可誘導(dǎo)抗體的一類(lèi)抗原，這些抗體能阻斷肝炎B病毒與感受性宿主細(xì)胞的接觸。肝炎B病毒含有前-S的表面抗原已從感染的人類(lèi)血漿中分離得到，Neurath and Strick，Arch.Virol 6079-81(1979)，最近并用Valenznela，supra描述的標(biāo)準(zhǔn)重組體技術(shù)得到。事實(shí)上，Neurath和Strick能采用與人類(lèi)聚合的血清清蛋白選擇性結(jié)合的方法從HBeAg陽(yáng)性人類(lèi)血清中分離小量HBsAg。該HBsAg可用3M硫氰酸鈉從連接了聚合的人類(lèi)血清清蛋白的瓊脂糖柱上洗脫。以此方法得到了25倍到80倍純化血清HBsAg。然而，這一程序不能純化重組體衍生的前-S(2)HBsAg。
重組體前-S-HBsAg用快速有效兩步層析方法純化。破裂表達(dá)重組體前-S-HBsAg的酵母細(xì)胞，澄清該細(xì)胞內(nèi)含物并用聚合的人類(lèi)血清清蛋白親合層析法分離。該前-S-HBsAg可用丁基瓊脂糖疏水作用親合層析進(jìn)一步純化。這種方法得到高于90%純度的前-S-HBsAg。
因此，本發(fā)明目的之一是提供一有效方法以純化重組體衍生前-S-HBsAg。另一目的是提供一種方法，其允許快速，高純度高產(chǎn)率重獲前-S-HBsAg。本發(fā)明的這些目的和其它目的可從下文敘述中看出。
本發(fā)明涉及一快速兩步方法從酵母細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中分離前-S抗原，在這種酵母細(xì)胞中該肽段是用重組體技術(shù)產(chǎn)生的。當(dāng)下列敘述和實(shí)例描述與前-S(2)-HBsAg相關(guān)的本發(fā)明時(shí)，應(yīng)明了本發(fā)明適用于任何含有與肝炎B表面抗原-S區(qū)相關(guān)的肽段的蛋白質(zhì)。實(shí)例包括重組體衍生的前-S(1)S(2)-HBsAg，及未與肝炎B病毒表面抗原S區(qū)共價(jià)結(jié)合的前-S(1)S(2)和前-S(2)多肽。
表達(dá)前-S(2)HBsAg的重組體酵母用Valenzuela et al。敘述的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)得到，Bio/Technology，3317-320(1985)，表達(dá)前-S(2)-HBsAg的酵母細(xì)胞用Carty et al方法生長(zhǎng)，Eighty-Fourth ASM Meeting p.194，1984，收集這些細(xì)胞，離心并重懸于含約0.1M磷酸鈉，約PH7.2，0.5MNacl的高滲緩沖液，濃度約50%(Wt/wt)，貯于-70℃。細(xì)胞在約20-23℃時(shí)融解，離心并重懸于Breaking緩沖液，其中含約0.1M HEPES，PH7.5，補(bǔ)充有0.01M EDTA，1μg/ml抑胃肽，0.13單位/ml aprotinin0.01M苯胺-鹽酸及2mM苯基-甲烷，磺酸(PMSF)。該混合物1-7次通過(guò)Stansted壓機(jī)以破裂細(xì)胞。破裂細(xì)胞漿液通過(guò)離心8，000xg 45分鐘4℃而澄清。
澄清的酵母提取物加入-含有偶聯(lián)了聚合的人類(lèi)血清清蛋白(PHSA)的Sepharose4B柱。人類(lèi)血清清蛋白是按Machi-da et al，Gastroent 85268-274(1983)敘述的方法用戊二醛聚合的，按廠家要求偶聯(lián)于CNBr-激活的Sepharose 4B。用一合適洗脫液洗，用含50mMHEPES PH7.5和0.5N Nacl的緩沖液A洗，然后將酵母提取液上柱。合適洗脫液包括堿金屬的一，二或三鹵代醋酸鹽。堿金屬指鋰鈉，鉀，其中鈉最為常用。鹵素指氟，氯，溴和碘，其中氯最常用。因此，最常用為三氯醋酸鈉。當(dāng)所有樣品進(jìn)入柱子，不被吸收的蛋白質(zhì)就用緩沖液A從柱中洗掉。吸收的前-S(2)-HBsAg用三氯醋酸鈉水溶液從PHSA Sepharose柱中洗掉，三氯醋酸鈉濃度1M-3.5M，最好用3M，PH6-8，最好用PH7。PHSA親合分離得到80倍富集的前-S(2)-HBsAg。聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和銀染證明所分離的組分為前-S(2)-HBsAg，純度至少為50%。
該前-S(2)-HBsAg進(jìn)一步用丁基Sepharose(Pharmacia)層析純化。特別純化了的前-S(2)-HBsAg對(duì)50mM3-(N-嗎啉)丙烷磺酸(MOPS)PH7.0透析，泵入丁基Sepharose 4B柱，沖洗該柱，用約0.1% triton x-100，50mM MOPS，PH7.0將結(jié)合的前-S(2)-HBsAg洗脫，聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和銀染證明洗脫出的前-S(2)-HBsAg組分純度大于90%。
以下各例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不是對(duì)本發(fā)明的限制。
例1用聚合的人類(lèi)血清清蛋白親合層析純化前-(S)-HBsAg表達(dá)前-S(2)-HBsAg的重組體衍生酵母用Valen-zuela et al，Bio/Technology 3317-320，1985，所述標(biāo)準(zhǔn)組技術(shù)得到，細(xì)胞用Cartyetal，Eighty-Fourth ASM Metting，1984，Abstr 030，P194，所述方法生長(zhǎng)，濃縮富集，對(duì)磷酸鹽緩沖液PH7.2透析過(guò)濾，離心收集細(xì)胞，重懸于高滲緩沖液(0.1M磷酸鈉，PH7.2，0.5M NaCl)，以-50%細(xì)胞懸液(Wt/wt)貯于-70℃。
非特別指明，所有工作均在4℃完成、冰凍細(xì)胞懸浮液于20℃融解，至漿液具有半融稠度。細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至一已事先稱(chēng)重的離心瓶中，攪動(dòng)至全部融解。于8000xg離心45分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞154gm(濕重)與250ml破碎緩沖液(0.1M HEPES，PH7.5，0.01MEDTA，1μS/ml抑胃肽A，0.13 units/ml aprotinin，0.01M苯胺鹽酸，2mM PMSF)混合準(zhǔn)備裂解，細(xì)胞均勻分布然后通過(guò)-Stansted壓機(jī)，80每平方吋克，10-12每平方吋克回壓。破碎重復(fù)四次，8000xg離心45分鐘收集上清液。
人類(lèi)血清清蛋白用戊二醛聚合，如Machida et al，Gas-troentero，85268-74，1983，所述，根據(jù)廠家指導(dǎo)偶聯(lián)于CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)。制備聚合人類(lèi)血清清蛋白(PHSA)結(jié)合Sepharose柱，床體積64ml，用300ml3M三氯醋酸鈉PH7洗，再用700ml緩沖液A洗，緩沖液A含有50mM HEPES，0.5M Nacl和PH7.5。
澄清的酵母提取液440ml(含20，520mg蛋白質(zhì)和129mg前-S(2)，HBsAg)被泵入PHSA Seph-arose柱，流速25ml/hour，全部樣品進(jìn)柱后，用緩沖液A洗去末被吸收的蛋白質(zhì)。前-S(2)-HBsAg用3M三氯醋酸鈉PH7洗脫，檢測(cè)和純度分析前-S(2)-HBsAg用聚丙烯酰胺電泳然后或銀染或免疫轉(zhuǎn)移法完成，從PHSA柱中洗脫出來(lái)的組分的重復(fù)等分試樣在0.05ml緩沖液(含2%十二烷基磺酸鈉(SDS)，0.125M Tris-Hcl PH6.8，100mM二硫蘇糖醇)中溫育15分鐘，100℃。按Laemmli，Nature 227，680(1971)所述方法將樣品通過(guò)12.5%聚丙烯酰胺分離膠電泳2.5小時(shí)，65mA/gel。一套凝膠按Morrissey，Anal Biochem 117，307-310(1981)方法用硝酸銀染色以看到多肽，另一套凝膠按Burne-tte，Anal Biochem 112，195-203(1981)方法進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)移，其中兔血清按Hilleman，et al，Am.J.Med.Sci 270，401(1975)方法制備。洗脫液含43mg蛋白質(zhì)和22.1mg前-S(2)-HBsAg，表明根據(jù)這項(xiàng)技術(shù)富集了80倍。
例2前-S-HBsAg的二次純化。
例1中得到的純化的前-S(2)HBsAg，進(jìn)一步用丁基Sepharose(Pharmacia)柱層析純化。制備丁基sepharose 4B柱，用500ml50mM MOPS PH7.0(緩沖液B)洗，流速30ml/hour。純化的前-S(2)-HBsAg對(duì)緩沖液B透析，透析后的抗原，118ml含41.5mg蛋白質(zhì)和21.3mg前-S(2)-HBsAg被泵入該柱。該柱用緩沖液B洗至移去所有未被吸收的蛋白質(zhì)，前-S(2)HBsAg用含0.1%Triton x-100的緩沖液B洗脫。該吸收組分含13.5mg蛋白質(zhì)和25mg前-S(2)-HBsAg。例1中所述的銀染和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移聚丙烯酰胺凝膠電泳揭示該洗脫組分含有高于90%的前-S(2)-HBsAg。
權(quán)利要求
1.一種純化重組體表達(dá)的肝炎B病毒前-S表面抗原的方法，包括a.將含前(2)的抗原連接于聚合的血清清蛋白母體入；b.將該抗原從母體上洗脫，用鹵代醋酸堿金屬鹽；及c.用丁基瓊脂糖親合層析及一合適的洗脫劑進(jìn)行最后純化。
2.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟a中的清蛋白是人類(lèi)或黑猩猩的血清清蛋白。
3.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟a中的清蛋白是人類(lèi)血清清蛋白。
4.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟a中的抗原是前-S(2)-HBsAg，前-S(1)S(2)-HBsAg，前-S(1)S(2)或前-S(2)。
5.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟b中的堿金屬鹽是鋰，鈉或鉀鹽。
6.據(jù)權(quán)項(xiàng)4所述的方法，其中堿金屬是鈉。
7.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟b中有一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)鹵素分子。
8.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟b中的鹵代醋酸含有三分子的氟、氯、溴、碘。
9.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟b中的鹵代醋酸堿金屬鹽是三氯醋酸鹽。
10.用權(quán)項(xiàng)1的方法純化的重組體衍生肝炎B病毒前-S抗原。
11.用權(quán)項(xiàng)1方法純化的重組體衍生肝炎B病毒前-S(2)-HBsAg。
12.用權(quán)項(xiàng)1方法純化的重組體衍生的肝炎B病毒前-S(1)S(2)-HBsAg。
13.用權(quán)項(xiàng)1方法純化的重組體衍生肝炎B病毒前-S(1)S(2)。
14.用權(quán)項(xiàng)1方法純化的重組體衍生肝炎B病毒pre-S(2)。
專(zhuān)利摘要
重組體前-S-HBsAg通過(guò)快速有效兩步層析法純化。破碎表達(dá)重組體前-S-HBsAg的酵母細(xì)胞，澄清細(xì)胞內(nèi)含物，用聚合人類(lèi)血清清蛋白親合層析分離該內(nèi)含物，前-S-HBsAg進(jìn)一步用丁基瓊脂糖疏水反應(yīng)層析純化。這一過(guò)程得到高于90％純度的前-S-HBsAg。
文檔編號(hào)C07K1/22GK87102799SQ87102799
公開(kāi)日1988年1月13日 申請(qǐng)日期1987年4月17日
發(fā)明者E·戴爾·萊曼, 特德·F·謝弗, 威廉·J·麥卡里爾 申請(qǐng)人:默克公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan