專利名稱：XJ－160病毒感染性全基因組cDNA克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種XJ-160病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，特別是涉及XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
近二十年來隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，RNA病毒的研究取得了重大突破。簡單來說，反向遺傳學(xué)技術(shù)就是首先利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)將病毒的RNA基因組轉(zhuǎn)化為cDNA，然后在DNA水平上完成對RNA病毒基因組的操作，如進行人為修飾和改造等，最后利用體內(nèi)/外轉(zhuǎn)錄技術(shù)或其它的方法將基因組cDNA轉(zhuǎn)回到RNA狀態(tài)，成為改造后新的病毒基因組，并最終利用宿主細胞獲得具有目的表型的重組病毒。反向遺傳學(xué)技術(shù)使研究人員對RNA病毒基因組的操作成為可能，大大方便了RNA病毒的研究。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類RNA病毒的研究中，為研究RNA病毒的生命機理、致病機制和病毒與宿主細胞之間關(guān)系提供了關(guān)鍵的技術(shù)平臺(1)。
感染性克隆是利用反向遺傳學(xué)技術(shù)建立的一種反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，其表現(xiàn)形式是將RNA病毒的全長基因組cDNA克隆到一個載體中，獲得一個穩(wěn)定的含有全長基因組cDNA的克隆，利用這樣的克隆轉(zhuǎn)錄得到新的病毒RNA基因組，從而實現(xiàn)對RNA病毒的操作。由于正鏈RNA病毒的RNA基因組可行使mRNA的功能，單一的裸露RNA即具有感染性的特性，使感染性克隆這種反向遺傳學(xué)技術(shù)在正鏈RNA病毒的研究中應(yīng)用更為普遍(2)。正鏈RNA病毒成員較多，分別屬于小RNA病毒科、披膜病毒科、黃病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科等，對于每一種病毒來說，其各種機理的闡明很大程度上得益于建立的感染性克隆。獲得RNA病毒感染性cDNA克隆可以大大提高對RNA病毒研究的潛力，借助基因組感染性克隆可以進一步揭示病毒基因組的分子特征，使單個功能基因的研究不再是脫離病毒整體的孤立研究。從整個基因組水平來研究錯綜復(fù)雜、相互關(guān)聯(lián)的病毒與宿主的關(guān)系具有獨特的優(yōu)勢。RNA病毒感染性克隆也為新型病毒疫苗的研制和新型病毒載體的開發(fā)提供了極好的分子生物學(xué)研究工具。
披膜病毒作為一類正鏈RNA病毒，含有成員眾多并主要集中在甲病毒屬，在各大洲均有分布。甲病毒屬包含一類導(dǎo)致嚴重腦炎的病毒如東部馬腦炎病毒(Eastern EquineEncephalitis Virus，EEE)、西部馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus，WEE)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEE)和另一類引起發(fā)熱、皮疹和關(guān)節(jié)炎的病毒如辛德畢斯病毒(Sindbis virus，SIN)、西門利克森林病毒(Semliki Foiestvirus，SFV)、羅斯河病毒(RossRiver virus，RR)等。其中SIN、SFV、RR、VEE等多種病毒株的感染性克隆的建立(3，4，5，6)及應(yīng)用為甲病毒的基因功能、調(diào)控模式和病毒的致病機理的闡明提供了重要的研究手段。特別是辛德畢斯病毒作為披膜病毒科甲病毒屬的代表病毒，在病毒形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)、病毒復(fù)制等方面均集中表現(xiàn)了動物病毒的基本特性，成為研究動物病毒的模式病毒。辛德畢斯病毒感染性克隆在甲病毒的研究和開發(fā)中起著重要作用，而且來自不同地域的分離株的感染性克隆都將有利于從多角度充分揭示甲病毒的生命機理。
XJ-160病毒是我國于1990年首次分離的病毒，全基因組核苷酸序列測定(7)表明該病毒株具有典型的辛德畢斯病毒基因組結(jié)構(gòu)，除5’帽子結(jié)構(gòu)和3’polyA尾外，基因組全長總共11626個核苷酸，全序列已經(jīng)錄入GenBank(AF103728)。同源性分析表明該病毒株與目前國際上已知的辛德畢斯病毒株相比，其核苷酸和氨基酸的變異較大，提示XJ-160病毒為辛德畢斯病毒新亞型(8)。該XJ-160病毒已申請中國發(fā)明專利(申請?zhí)枮?8120692.1)。
為了從基因組水平研究XJ-160病毒與國外同類病毒的差異性，以及進一步深入闡明XJ-160病毒的復(fù)制機制和致病機理，為病毒性傳染病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)，我們構(gòu)建了XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供XJ-160病毒感染性全基因組cDNA克隆，它包括XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆及其構(gòu)建方法，還提供一種可作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆的骨架質(zhì)粒以及用途。本發(fā)明是利用低拷貝質(zhì)粒作骨架構(gòu)建而成的，其克隆的穩(wěn)定性好；該感染性克隆具有清晰的遺傳學(xué)背景，感染性克隆來源的恢復(fù)病毒較好的重現(xiàn)了XJ-160病毒的各種生物學(xué)特征。
為達到上述目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明中感染性cDNA克隆的構(gòu)建方案是首先獲得覆蓋病毒基因組全長的cDNA片段，然后選擇適合的克隆載體，將若干cDNA片段在載體上組裝成病毒基因組全長cDNA；同時在病毒基因組序列5’端加上RNA聚合酶啟動子序列，在3’端加上polyA尾序列和單一限制性內(nèi)切酶識別序列；通過體外轉(zhuǎn)錄獲得轉(zhuǎn)錄體RNA，然后轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，通過細胞病變、噬斑檢測、間接免疫熒光等多項指標來檢測轉(zhuǎn)染RNA后是否產(chǎn)生恢復(fù)病毒。
本發(fā)明提供了一種XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆，該克隆由骨架質(zhì)粒pBR、含11620個堿基對的病毒基因組全長cDNA、基因組5’端的SP6啟動子序列和基因組3’端的35個連續(xù)的A組成。其中所述的骨架質(zhì)粒pBR由線性化的質(zhì)粒pBR322與含單酶切位點的連接子連接而成；所述的病毒基因組全長cDNA由三個cDNA組裝片段通過所述單酶切位點插入骨架質(zhì)粒pBR組裝而成，三個組裝片段順次連接，覆蓋了XJ-160病毒的全長基因組；所述的SP6啟動子序列位于基因組5’端上游緊鄰第一個核苷酸A，所述的35個連續(xù)的A緊鄰基因組3’末端核甘酸C。
其感染性全基因組cDNA的序列為1 ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATAGCACT51 ACCATCATAA TGGAGAGGCC TGTAGTTAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG101 TCCGTTTGTC GCTCAACTGC AAAAGAGCTT CCCGCAATTC GAGGTAGTAG151 CACAGCAGGC CACACCAAAT GACCATGCTA ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT201 CTGGCTAGTA AATTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG CGACGATTTT251 GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCACTATC301 ACTGCGTCTG CCCTATGCGG AGCCCCGAAG ATCCCGACCG TATGATGAAA351 TACGCCAATA AGTTGGCGGA GAAGGCAAAT AAGATTACTA ATAAAAATTT401 GCATGAGAAG ATTAAAGACC TCCGGATCGT ACTCGATACT CCGGATGCTG451 AGACACCGTC GCTCTGCTTC CATAATGACG TTACCTGCAG TACGCGTGCA
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5301 AGGCAAGTAG TGACAGTCGA TGTCCACTCC ACCCAAGAGG ATACTCCCAT5351 TCCTCCTCCA AGGTTAAAGA AACTGGCCCG GTTAGCGGCG GCGAAACAGA5401 CCCCAGTAGC ACTTACCGTA TCGAATGATG TGGGCTCAAT GGATGAGTCC5451 CTCTGCCTTT CATTTGGCAG CGTATCCATG TCTTTTGGAT CTTTTTCCGA5501 CGGTGAGATC GATGAAATAA GTCGTATGAA GACTGAGTCA GAACCCGTTT5551 TATTTGGAAC TTTTGAACCT GGAGAAGTTA ATTCCATTAT ATCGTCTCGA5601 TCAGCCGTGT CTTTTCCACC GCTAAGGCAG AGACGTAGAC GTAGGAACAA5651 GCGGACTGAA TACTGACTAA CCGGGGTAGG TGGGTACATA TTTTCGACGG5701 ATACAGGGCC AGGACATCTG CAAAAGAAGT CTGTCTTGCA GAATCAATTT5751 TCCGAACCGA CCTTGGAGCG TAACGTGCTG GAAAAGATAT ACGCTCCGAC5801 GCTTGATACG TCGAAAGAAG AACTACTCAA ATTTAGATAC CAAATGATGC5851 CCACCGAAGC CAATAAGAGC AGGTACCAGT CCCGCAAAGT CGAAAATCAA5901 AAAGCCGTCA CCACTGAGCG TTTGCTTTCA GGGTTACGGC TATATACCTC5951 GGCAACTGAT CAGCCTGAAT GTTATAAAAT TACTTACCCG AAACCTTTGT6001 ATTCCAGCAG TGTACCAGCA AGTTACTCCG ACCCGAAGTT CGCAGTTGCC6051 GTCTGCAATA ACTACTTGCA TGAAAACTAC CCAACGGTAG CGTCCTACCA6101 GATTACTGAT GAATACGACG CTTACCTCGA TATGGTGGAT GGGACTGTCG6151 CTTGCCTGGA CACCGCAACA TTCTGCCCGG CTAAACTCAG AAGTTATCCA6201 AAGAGGCATG AGTATCGCGC ACCGAATATC CGTAGCGCAG TCCCGTCTGC6251 TATGCAGAAC ACGTTGCAAA ACGTGCTCAT CGCTGCAACC AAGAGGAACT6301 GCAACGTTAC ACAAATGCGT GAACTACCAA CGCTGGACTC AGCGACGTTT6351 AACGTCGAGT GCTTTAAAAA ATATGCGTGC AACAATGAAT ACTGGGAAGA6401 GTTTGCCCGT AAACCAATTA GAATTACCAC GGAGTTCGTT ACTGCGTATG6451 TAGCCAGACT GAAAGGACCA AAGGCAGCAG CCTTATTTGC AAAGACGTAC6501 AATTTGGTCC CATTGCAAGA GGTACCCATG GATAGGTTTG TTATGGATAT6551 GAAAAGAGAT GTGAAAGTCA CACCAGGTAC CAAGCACACC GAAGAGAGAC6601 CAAAGGTGCA GGTAATCCAA GCTGCAGAGC CACTAGCGAC GGCATATTTG6651 TGCGGAATCC ATCGCGAGTT GGTGCGTAGA CTTACGGCGG TGTTGCTACC6701 TAACATTCAT ACACTTTTTG ATATGTCAGC AGAGGACTTT GACGCTATTA6751 TAGCCGAACA CTTTAAACAT GGCGATCCGG TGCTGGAGAC AGATATTGCT6801 TCATTCGATA AGAGCCAAGA TGACGCTATG GCGTTGACTG GCCTGATGAT6851 CTTGGAAGAT CTAGGCGTGG ATCACCTACT ACTCGACTTA ATTGAGTGTG6901 CCTTTGGTGA AATATCGTCA ACACACTTGC CCACGGGCAC TCGTTTCAAA6951 TTTGGTGCAA TGATGAAATC CGGAATGTTT CTTACATTAT TCGTTAACAC7001 AGTTTTGAAT GTTGTGATCG CCTGCAGAGT ACTAGAGGAA AGGCTTAAGA7051 TGTCGAGATG CGCGGCGTTT ATCGGCGACG ATAACATTAT ACACGGGGTA7101 GTGTCTGATA AGGTGATGGC AGAGAGGTGC GCCACCTGGC TTAACATGGA7151 AGTTAAGATT ATCGACGCCA TTATCGGTGA GAGACCACCG TATTTTTGCG7201 GTGGATTTAT TCTGCAAGAC TCAGTCACTT CCACAGCGTG CCGCGTGGCC7251 GACCCACTGA AAAGATTATT TAAGCTTGGT AAACCGCTAC CAGCCGACGA7301 CGAGCAAGAC GAAGATAGAA GGCGAGCTTT ATTGGACGAA ACAAAGGCGT7351 GGTTCAGAGT GGGCATTACT GATACTTTAG CAACTGCTGT AGCAACCCGG7401 TACGAGGTAG ATAATATCAC ACCTGTCTTA TTGGCATTGA GAACGTTTGC7451 CCAGAGCAAA AATTCGTTTC AGGCCATTAG AGGAGAAATA AAGCAACTCT7501 ACGGTGGTCC TAAATAGTCA GCATAGCATA TTTTATCTGA CTAATACTGT7551 AACACCCCTA CTATGAATAG AGGATTCTTT AACATGCTTG GCCGCCGCCC7601 CTTCCCGGCC CCCACTTCTA TGTGGAGGCC ACGTAGAAGG AGGCAGGCGG7651 CCCCGATGCC CGCCCGCAAC GGGTTGGCTT CCCAAATTCA GCAGCTTACC
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10101 TCTACTAATC AAGAGTATAT CACCTGCAAG TTTACTACTG TAGTCCCCTC10151 CCCGAAAGTC AAATGTTGCG GCTCCTTGGA ATGTCAGCCC GCCGCTCACG10201 CCGACTATAA CTGCAAAGTT TTTGGAGGGG TTTACCCATT CATGTGGGGA10251 GGAGCACAGT GTTTTTGCGA CAGCGAGAAC ACCCAGATGA GCGAGGCGTA10301 CGTCAAACTG TCAGCGGACT GCGTAACGGA TTACGCACAG GCAGTTAAGG10351 TGCATACTGC TGCAATGAAG GTAGGACTAC GCATAGTGTA TGGGAATACC10401 ACCAGCTATT TAGATGTGTA CGTGAATGGA GTCACGCCGG GGACATCCAA10451 AGATCTAAAA GTCATAGCTG GGCCAGTTTC GTCCTCCTTT ACGCCGTTTA10501 ATCATAAGGT TGTCATCTAC CGTGGTTTAG TCTATAATTA TGACTTCCCT10551 GAATACGGCG CAATGAAACC TGGAGTGTTC GGAGACATCC AAGCTACCTC10601 CTTGACCAGT AGAGACCTTA TTGCAAGCAC GGACATTAGA TTGCTTAAGC10651 CTTCCGTTAA AAACGTGCAC GTCCCGTACA CGCAAGCTGC TTCAGGATTC10701 GAGATGTGGA AGAACAACTC AGGTCGACCA CTGCAGGAAA CCGCTCCTTT10751 TGGGTGTAAG ATTGCAGTCA ACCCGCTACG AGCGGTGGAC TGTTCGTACG10801 GTAATATTCC TATCTCCATC GATATCCCAA ATGCCGCCTT CATTAGGATA10851 TCGGATGCGC CGCTAGTTTC GACGGTTAAA TGTGAGGTCA GCGAATGTAC10901 CTATTCAGCT GATTTTGGTG GTATGGCAAC CCTGCAGTAT GTGTCGGACC10951 GCGAAGGACA ATGCCCCGTG CACTCTCACT CAAGCACAGC AACACTTCAG11001 GAATCGACAG TGCATGTCCT GGAGAAAGGG GCGGTGACCG TGCACTTTAG11051 TACCGCCAGC CCACAGGCTA ATTTCATTAT ATCGCTGTGT GGCAAGAAAA11101 CAACATGCAA CGCGGAATGT AAGCCACCTG CGGACCACAT TGTGAGTACA11151 CCGCACAAAA TCGATCAGGA GTTCCAAACC GCTATTTCAA AAACATCATG11201 GAGCTGGTTA CTGGCACTCT TTGGCGGCGC CTCGTCGCTA TTAATTATAG11251 GACTCATGAT TTTTACTTGC AGCATGTTGC TGACAAGCAC CCGGAGATGA11301 CCGCTATGTC CCAATGACCC GACCAGCAAA ACTCGACGTA TTTCCGAGGA11351 ACTGATGTGC ATAATGCATC AGGCTGGTAT ATTAGATCCC CGCTCATCGC11401 GGGCACTATA GCAACAATGA AACTCGATGT ATTTCCGAGG ATGCGCAGTG11451 CATAATGCTG CGCCGTGTTG CCATATAATC ATTTTATTAA TCAACTATTT11501 AGCAGACGCT AAAACTCAAT GTATTTCTGA GGAAGCGTGG TGCATAATGC11551 CATGCAGCGT CTGTATAATT TCTTTTATTA TTCTTTTATC AATTAACCAA11601 AATTTTGTTT TTAACATTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA11651 AAAAACTCGA GCAATTCTTG AAGACGAAAG GGCCTCGTGA TACGCCTATT11701 TTTATAGGTT AATGTCATGA TAATAATGGT TTCTTAGACG TCAGGTGGCA11751 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA11801 CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA11851 ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTATGAGTAT TCAACATTTC CGTGTCGCCC11901 TTATTCCCTT TTTTGCGGCA TTTTGCCTTC CTGTTTTTGC TCACCCAGAA11951 ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT CAGTTGGGTG CACGAGTGGG12001 TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG AGTTTTCGCC12051 CCGAAGAACG TTTTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC12101 GCGGTATTAT CCCGTGTTGA CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT12151 ACACTATTCT CAGAATGACT TGGTTGAGTA CTCACCAGTC ACAGAAAAGC12201 ATCTTACGGA TGGCATGACA GTAAGAGAAT TATGCAGTGC TGCCATAACC12251 ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT CTGACAACGA TCGGAGGACC12301 GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT GTAACTCGCC12351 TTGATCGTTG GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT12401 GACACCACGA TGCCTGCAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC12451 TGGCGAACTA CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG
12501 AGGCGGATAA AGTTGCAGGA CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC12551 TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT12601 CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT12651 ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT12701 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA12751 CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA12801 TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT12851 GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC12901 TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA12951 AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT13001 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT13051 CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC13101 CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT13151 GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA13201 TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT13251 TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA13301 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG13351 CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG13401 CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG ACTTGAGCGT13451 CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG13501 CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA13551 TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC13601 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA13651 GTCAGTGAGC GAGGAAGCGG AAGAGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA13701 CGCATCTGTG CGGTATTTCA CACCGCATAT GGTGCACTCT CAGTACAATC13751 TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT ACACTCCGCT ATCGCTACGT13801 GACTGGGTCA TGGCTGCGCC CCGACACCCG CCAACACCCG CTGACGCGCC13851 CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC TTACAGACAA GCTGTGACCG13901 TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT CACCGTCATC ACCGAAACGC13951 GCGAGGCAGC TGCGGTAAAG CTCATCAGCG TGGTCGTGAA GCGATTCACA14001 GATGTCTGCC TGTTCATCCG CGTCCAGCTC GTTGAGTTTC TCCAGAAGCG14051 TTAATGTCTG GCTTCTGATA AAGCGGGCCA TGTTAAGGGC GGTTTTTTCC14101 TGTTTGGTCA CTGATGCCTC CGTGTAAGGG GGATTTCTGT TCATGGGGGT14151 AATGATACCG ATGAAACGAG AGAGGATGCT CACGATACGG GTTACTGATG14201 ATGAACATGC CCGGTTACTG GAACGTTGTG AGGGTAAACA ACTGGCGGTA14251 TGGATGCGGC GGGACCAGAG AAAAATCACT CAGGGTCAAT GCCAGCGCTT14301 CGTTAATACA GATGTAGGTG TTCCACAGGG TAGCCAGCAG CATCCTGCGA14351 TGCAGATCCG GAACATAATG GTGCAGGGCG CTGACTTCCG CGTTTCCAGA14401 CTTTACGAAA CACGGAAACC GAAGACCATT CATGTTGTTG CTCAGGTCGC14451 AGACGTTTTG CAGCAGCAGT CGCTTCACGT TCGCTCGCGT ATCGGTGATT14501 CATTCTGCTA ACCAGTAAGG CAACCCCGCC AGCCTAGCCG GGTCCTCAAC14551 GACAGGAGCA CGATCATGCG CACCCGTGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA14601 GAGCTCGATT TAGGTGACAC TATAG其中1-11620 病毒核苷酸序列11621-11655 polyA序列11656-11661 XhoI酶切位點11656-14606 pBR骨架質(zhì)粒序列14601-14606 SaCI酶切位點
14607-14625 SP6啟動子序列本發(fā)明提供了能夠保證全長基因組cDNA克隆在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定性的骨架質(zhì)粒。由于基因組cDNA在低拷貝克隆載體中穩(wěn)定，所以本發(fā)明選用低拷貝質(zhì)粒pBR322來制備適用于本發(fā)明的骨架質(zhì)粒。本發(fā)明中用一對互補寡核苷酸退火形成的連接子替換pBR322質(zhì)粒中的EcoR I-Ava I片段(86-1268nt)，去除質(zhì)粒中的Tetr基因，得到骨架質(zhì)粒。具體步驟包括首先將pBR322質(zhì)粒線性化，然后將線性化后的質(zhì)粒與含單酶切位點的連接子用本領(lǐng)域常規(guī)方法連接制得骨架質(zhì)粒。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，是用EcoR I和Ava I雙酶切除去質(zhì)粒pBR322中四環(huán)素抗性基因Tetr，得到2934bp的線性化的質(zhì)粒。
本發(fā)明中將XJ-160病毒的基因組分成三個組裝片段進行組裝，因此，本發(fā)明中所述的連接子中設(shè)計含有單酶切位點，以便利用相應(yīng)酶切位點將病毒基因組引入骨架質(zhì)粒中。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述的連接子由兩個互補的寡核苷酸片段SX-和SX+經(jīng)退火獲得，其中SX-和SX+的序列分別為SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’；SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’寡核苷酸片段SX-和SX+退火后生成的連接子中含有單酶切位點Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I，該連接子長度為61bp，末端為粘性末端，分別與用EcoR I和Ava I酶切后得到的2934bp的線性化質(zhì)粒的粘性末端互補。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，將得到的2934bp的線性化質(zhì)粒和61bp的連接子用本領(lǐng)域常規(guī)方法連接得到構(gòu)建感染性cDNA克隆使用的骨架質(zhì)粒，本發(fā)明中命名為pBR。
本發(fā)明中以三個cDNA組裝片段的方式將XJ-160病毒病毒全基因組cDNA引入到骨架質(zhì)粒中。XJ-160病毒基因組全長11626個核苷酸，本發(fā)明中將基因組8453位核苷酸C突變?yōu)門，產(chǎn)生Xba I單酶切位點(8451-8456 TCCAGA→T↓CTAGA)，結(jié)合位于基因組2517位的BamHI單酶切位點，將XJ-160病毒全基因組序列分為NS1(1-2516nt)、6K(2517-8451nt)和S2(8452-11626nt)三個組裝片段。在病毒基因組cDNA序列5’端上游緊鄰第一個核苷酸A引入SP6啟動子序列和Sac I酶切位點，SP6用于以起始病毒RNA的轉(zhuǎn)錄，Sac I用于片段組裝；在病毒基因組3’末端核苷酸C后引入polyA序列(35個A組成)和一個單酶切位點Xho I，Xho I用于線性化全基因克隆質(zhì)粒制備體外轉(zhuǎn)錄模板。引入的Xba I酶切位點作為全基因克隆的遺傳標記，用于鑒別恢復(fù)病毒的來源。利用Sac I、BamHI、Xba I和Xho I四個酶切位點，將病毒全基因組分為三片段，以pBR質(zhì)粒作骨架進行全長cDNA片段組裝。
另一方面，本發(fā)明提供了骨架質(zhì)粒pBR作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆的載體的用途。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒pBR作為制備XJ-160病毒病毒全長基因組感染性cDNA克隆的載體。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆的構(gòu)建方法，該方法包括(1)從感染XJ-160病毒的小鼠腦組織提取RNA；(2)用三對引物通過RT-PCR擴增，得到覆蓋病毒基因組全長的三個cDNA組裝片段；(3)制備上述三個cDNA組裝片段的T載體克隆；(4)經(jīng)亞克隆操作構(gòu)建得到XJ-160病毒的全長基因組cDNA克?。?5)體外轉(zhuǎn)錄制備病毒基因組全長RNA；(6)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將上述全長RNA導(dǎo)入哺乳動物細胞；(7)收取含恢復(fù)病毒的細胞上清；(8)對恢復(fù)病毒進行遺傳標記的鑒定；(9)比較恢復(fù)病毒與親本病毒的生物學(xué)特性。
其中病毒RNA的提取和RT-PCR的操作均采用本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法。
從cDNA克隆合成感染性轉(zhuǎn)錄體，有效的RNA聚合酶啟動子是必須的。本發(fā)明選用噬菌體啟動子SP6，合成的引物Sp6f2中包含有SP6啟動子序列。
制備上述三個cDNA組裝片段的T載體克隆，簡而言之，包括下述步驟(1)制備含有下列成分的反應(yīng)體系pGEMT載體、PCR產(chǎn)物(NS1、6K或S2)、T4 DNA連接酶和連接緩沖液，4℃連接過夜；(2)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞；(3)篩選出陽性克隆(pGEMT-NS1、pGEMT-6K和pGEMT-S2)，用于下列亞克隆操作。
病毒基因組全長cDNA片段的亞克隆操作，包括下述步驟(1)Xba I/Xho I雙酶切pGEMT-S2質(zhì)粒和pBR骨架質(zhì)粒，得到S2片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I雙酶切pGEMT-6K質(zhì)粒和pBR-S2質(zhì)粒，得到6kb片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I雙酶切pGEMT-NS1質(zhì)粒和pBR-6K-S2質(zhì)粒，得到NS1片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-NS1-6K-S2，該質(zhì)粒即為XJ-160病毒全基因組cDNA克隆質(zhì)粒，命名為pBR-XJ160。
獲得RNA轉(zhuǎn)錄體是鑒定全基因克隆感染性的必須步驟。首先制備符合轉(zhuǎn)錄要求的完全線性化的質(zhì)粒DNA模板，然后用SP6RNA聚合酶合成5’端帶帽子結(jié)構(gòu)的RNA轉(zhuǎn)錄體。步驟包括(1)酶切使全基因組質(zhì)粒線性化制備轉(zhuǎn)錄模板，在本發(fā)明的具體實施方案中，使用XhoI酶切全基因組質(zhì)粒成線性；(2)制備RNA轉(zhuǎn)錄體，在本發(fā)明的具體實施方案中，使用mMESSAGE mMACHINETMtranscription SP6 Kit(Ambion)，具體操作在廠商推薦方法基礎(chǔ)上稍作改動。
使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將RNA轉(zhuǎn)錄體導(dǎo)入哺乳動物細胞。本發(fā)明的具體實施方案中使用的哺乳動物細胞是BHK細胞。
將轉(zhuǎn)染后的哺乳動物細胞按本領(lǐng)域常規(guī)方法進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞出現(xiàn)明顯病變且超過80％時收獲細胞及其上清，凍存?zhèn)溆?，該病毒為第一代恢?fù)病毒；凍存前，吸取上清重復(fù)上述培養(yǎng)操作得到第二代恢復(fù)病毒，依此類推。全基因克隆來源的病毒稱作恢復(fù)病毒(BR-XJ160)。
為了區(qū)分恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和親本病毒XJ-160，需要對獲得的病毒進行遺傳標記的鑒定。在本發(fā)明的具體實施方案中，在構(gòu)建全基因組cDNA克隆時在基因組8453nt引入一個堿基突變(C→T)，創(chuàng)建出Xba I酶切識別序列(8451-8456 TCCAGA→T↓CTAGA)，所以用Xba I消化來自兩種病毒的RT-PCR產(chǎn)物，對酶切結(jié)果進行比較。
為了鑒定本發(fā)明制備的感染性全基因組cDNA克隆是否可作為理想的反向遺產(chǎn)學(xué)系統(tǒng)，對感染性全基因組cDNA克隆pBR-XJ160的穩(wěn)定性進行了鑒定，并對感染性克隆來源的恢復(fù)病毒(BR-XJ160)與親本病毒XJ-160的多項生物學(xué)特性進行了比較?；謴?fù)病毒和親本病毒的生物學(xué)性狀表明在細胞病變效應(yīng)、病毒的抗原性、病毒顆粒的形態(tài)、病毒噬斑形態(tài)和病毒在宿主細胞生長動力以及病毒毒力等方面沒有明顯的區(qū)別。感染性克隆來源的恢復(fù)病毒(BR-XJ160)較好的重現(xiàn)了XJ-160病毒的各種生物學(xué)特征。其中包括(1)pBR-XJ160克隆質(zhì)粒在宿主菌中多次傳代后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，各代質(zhì)粒的酶切圖譜不變，表明了該克隆的傳代穩(wěn)定性；各代克隆質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染宿主細胞后均可產(chǎn)生恢復(fù)病毒，表明克隆的感染性是穩(wěn)定的。(2)用間接免疫熒光測定法(9)鑒定病毒的抗原性。(3)電鏡負染觀察病毒顆粒。(4)用標準的噬斑檢測方法(9)檢測病毒在宿主細胞上形成的空斑。(5)用噬斑法檢測病毒在感染培養(yǎng)的哺乳動物細胞后，于不同時間細胞上清中產(chǎn)生的子代病毒的滴度，用滴度的對數(shù)繪制曲線。(6)在乳鼠的腦組織接種病毒，檢測病毒的致病能力。
所述的骨架質(zhì)粒pBR作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆的載體的用途，上述的RNA病毒為披膜病毒科(Togaviridae)病毒或者是為甲病毒屬(Alphavirus)病毒或者是辛德畢斯病毒(Sindbis virus)。


圖1低拷貝骨架質(zhì)粒pBR的構(gòu)建2.XJ-160病毒全基因克隆構(gòu)建策略3組裝片段的RT-PCR電泳中1 DL15000 2 NS1 36K 4 S2 5DL15000圖4全基因克隆pBR-XJ160構(gòu)建過程5間接免疫熒光檢測恢復(fù)病毒和XJ-160病毒感染的BHK細胞中A恢復(fù)病毒(BR-XJ160)B正常BHK細胞(陰性對照)C XJ-160病毒(陽性對照)圖6恢復(fù)病毒(BR-XJ160)的遺傳標記鑒定中A遺傳標記分析示意圖B遺傳標記的瓊脂糖凝膠電泳分析圖7全基因克隆pBR-XJ160質(zhì)粒的穩(wěn)定性分析中A→H8次傳代DH5α菌提取質(zhì)粒經(jīng)Sac I/Xho I雙酶切產(chǎn)生11.6kb和2.9kb片段圖8恢復(fù)病毒(BR-XJ160)與親本病毒XJ-160的噬斑比較中A恢復(fù)病毒(BR-XJ160)B XJ-160病毒圖9電鏡觀察XJ-160病毒和恢復(fù)病毒(BR-XJ160)的形態(tài)圖(負染色)圖中A恢復(fù)病毒(BR-XJ160)(×69000×2)B XJ-160病毒(×69000×2)注箭頭所示病毒顆粒的放大圖像位于右上圖10恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒在BHK細胞中的生長動力曲線本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明涉及的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆pBR-XJ160是利用低拷貝質(zhì)粒作骨架構(gòu)建而成的，克隆的穩(wěn)定性好；在基因組cDNA克隆過程中引入了遺傳標記有利于區(qū)分恢復(fù)病毒和親本病毒；同時由于引入的遺傳標記突變位點并未影響全基因克隆的感染性，為今后在感染性克隆進行基因突變研究提供了借鑒。該感染性克隆具有清晰的遺傳學(xué)背景，感染性克隆來源的恢復(fù)病毒較好的重現(xiàn)了XJ-160病毒的各種生物學(xué)特征。本發(fā)明的感染性克隆作為有效的XJ-160病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，可在XJ-160病毒的進一步研究和開發(fā)中用作分子生物學(xué)工具。
具體實施例方式
一、低拷貝骨架質(zhì)粒pBR的構(gòu)建選擇低拷貝質(zhì)粒pBR322(TaKaRa公司)作為全基因克隆的骨架質(zhì)粒。但要對pBR322質(zhì)粒進行改造，使其成為適合本研究所用的工作質(zhì)粒pBR。用一對互補的寡核苷酸退火形成的連接子替換pBR322質(zhì)粒中的EcoR I-Ava I片段(86-1268nt)，去除質(zhì)粒中的Tet基因，構(gòu)建成只含有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒，作為病毒全基因組cDNA克隆的骨架質(zhì)粒(見圖1)。
1、合成一對互補的寡核苷酸(上海生工)，進行等摩爾退火反應(yīng)，獲得連接子片段寡核苷酸SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’，SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’。
退火反應(yīng)條件20ul體系47uM SX-，9ul，47uM SX+9ul，0.1MNaCl 0.2ul混勻，放于95℃水浴中，關(guān)閉水浴鍋電源，使溫度自然降至室溫，即可使用。
2、骨架質(zhì)粒pBR的獲得用EcoR I和Ava I雙酶切消化pBR322質(zhì)粒，回收得到2934bp的線性質(zhì)粒。酶切反應(yīng)參照各內(nèi)切酶說明書(Promega公司和TakaRa公司)。依次在1.5mlEppendof管內(nèi)加入DNA、10x相應(yīng)緩沖液和內(nèi)切酶EcoR I和Ava I，用ddH2O補充到總體積20ul，37℃消化2小時，取3ul反應(yīng)液于0.8-1％的瓊脂糖凝膠中，進行100W恒壓水平電泳，紫外燈下觀察酶切結(jié)果。
利用T4 DNA連接酶將2934bp的線性質(zhì)粒和上述得到的61bp的連接子進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)克隆篩選后得到骨架質(zhì)粒pBR。
所得質(zhì)粒pBR的核甘酸序列中消除了pBR322原有EcoR I位點，而將EcoR I位點移至多克隆位點(連接子)中。多克隆位點含有單酶切位點Sac I，Hind III，BamH I，SphI，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I，Xho I。這些單酶切位點用于病毒全基因cDNA克隆的構(gòu)建。
二、XJ-160病毒全長基因組cDNA合成和克隆1.克隆構(gòu)建策略(見圖2)XJ-160病毒基因組全長11626個核苷酸，將基因組8453位核苷酸C突變?yōu)門，產(chǎn)生XbaI單酶切位點(8451-8456 TCCAGA→T↓CTAGA)，結(jié)合位于基因組2517位的BamH I單酶切位點，將XJ-160病毒全基因組序列分為NS1(1-2516nt)、6K(2517-8451nt)和S2(8452-11626nt)三個片段進行拼接組裝。在病毒基因組cDNA序列5’端上游緊鄰第一個核苷酸A引入SP6啟動子序列和Sac I酶切位點，SP6用于以起始病毒RNA的轉(zhuǎn)錄，Sac I用于片段組裝；在病毒基因組3’末端核苷酸C后引入polyA序列(35個A組成)和一個單酶切位點Xho I，Xho I用于線性化全基因克隆質(zhì)粒制備體外轉(zhuǎn)錄模板。引入的Xba I酶切位點作為全基因克隆的遺傳標記，用于鑒別恢復(fù)病毒的來源。利用pBR質(zhì)粒作骨架，將病毒全基因組分為三片段，利用Sac I、BamH I、Xba I和Xho I四個酶切位點進行全長cDNA片段組裝。
2.病毒培養(yǎng)及病毒RNA提取取-80℃貯存的經(jīng)三輪單斑純化后保存在凍干鼠腦懸液中的XJ-160病毒，將毒種接種乳鼠腦組織進行病毒擴增，用TriZol液(Invitrogen)從感染病毒的腦組織中提取病毒RNA(操作方法參見廠商說明書)。
3.RT-PCR獲得病毒cDNA片段利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SUPERSCRIPTTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)和PCR試劑盒Expand High fidelity PCR System(Roche公司)進行病毒基因組全長cDNA組裝片段的擴增(操作方法參見生產(chǎn)商提供的說明書)。
cDNA片段擴增條件94℃預(yù)變性5min；94℃ 30 Sec，55℃ 30 Sec，72℃3min，30個循環(huán)，72℃延伸10mincDNA片段的電泳結(jié)果見圖3。
表1 XJ-160病毒基因組cDNA片段擴增所用引物引物 引物序列a擴增片段bSp6f2 cgagctcgatttaggtgacactatagATTGACGGCGTAGTACACACTATTG SacI-BamHI(NS1)1-25nt (Sac I)BamR2 CTTGCAGGGGTTTGTAGTCTTCAT2699nt-2676ntP5 CGGGATCCTAAGCAGTGTGG2514nt-2533nt(BamH I) BamH I-XbaI(6K)XbR CTCTaGATGGTTCGCGGGTG8457nt-8438ntXbF CATCtAGAGCGTTAGATATCCTG 8449nt-8471nt(Xba I)Xba I-Xho I(S2)X2 ccgctcgagTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGGTTAATTG 11626nt-11596nt(Xho I)a大寫字母表示病毒序列，小寫字母表示非病毒序列，下劃線代表限制性內(nèi)切酶識別序列b用于構(gòu)建全長克隆的cDNA片段見圖2c斜體小寫字母表示SP6啟動子序列4.三個組裝片段的T載體克隆PCR產(chǎn)物與pGEMT載體的連接反應(yīng)體系10ul5ul快速連接緩沖液，1ulpGEMT載體，3ul PCR產(chǎn)物和1ul T4 DNA連接酶?；靹蚝?，置于4℃連接過夜。
轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物取上述連接產(chǎn)物5ul加入100ulDH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，置冰浴60min后，42℃熱休克90秒，再置冰浴數(shù)分鐘，加入無氨芐青霉素的LB約0.7ml，在37℃搖床150rpm搖菌60min；取200ul菌液加入40ul X-gal及4ul IPTG，混勻后涂含氨芐青霉素(100ug/ml)LB瓊脂平板，于37℃倒置培養(yǎng)約14-16小時，直到可見清晰的藍色和白色菌落。挑取白色菌落搖菌、提取質(zhì)粒、進行酶切鑒定。
每一個PCR產(chǎn)物至少獲得三個獨立的T-A克隆(插入方向不同，或來自不同的轉(zhuǎn)化試驗)。
5.病毒基因組全長cDNA組裝的亞克隆操作利用NS1、6K、S2片段組裝成全基因組cDNA，構(gòu)建過程(見圖4)(1)Xba I/XhoI雙酶切pGEMT-S2質(zhì)粒和pBR骨架質(zhì)粒，得到S2片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I雙酶切pGEMT-6K質(zhì)粒和pBR-S2質(zhì)粒，得到6kb片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I雙酶切pGEMT-NS1質(zhì)粒和pBR-6K-S2質(zhì)粒，得到NS1片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-NS1-6K-S2，該質(zhì)粒即為XJ-160病毒全基因組cDNA克隆質(zhì)粒，命名為pBR-XJ160。
DNA片段的克隆操作參見冷泉港第三版《分子克隆》(10)。
三、全基因組cDNA克隆的感染性鑒定1.體外轉(zhuǎn)錄制備病毒基因組全長RNA制備轉(zhuǎn)錄模板用Xho I單酶切全基因質(zhì)粒pBR-XJ160，酶切反應(yīng)體系50ul10×緩沖液5ul，pBR-XJ160質(zhì)粒20ug，Xho I酶50IU，用ddH2O補足至50ul，混勻。37℃水浴至少3小時，取少許反應(yīng)液進行電泳，鑒定酶切是否完全。加入5％SDS和1/10體積的蛋白酶K(20mg/ml)，于50℃水浴至少30分鐘，用等體積酚氯仿抽提一次，然后加入1/10體積的5M醋酸銨和2倍體積的無水乙醇沉淀線性質(zhì)粒DNA，4℃10000rpm離心10分鐘，棄上清，室溫干燥，用無RNase的ddH2O溶解使其濃度為0.5ug/ul。
制備RNA轉(zhuǎn)錄體用mMESSAGE mMACHINETMtranscription SP6 Kit(Ambion)完成體外轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系20ulNuclease-free water2ul，2×NTP/Cap10ul，10×Reaction Buffer2ul，20mMGTP2ul，線性全基因質(zhì)粒(0.5ug/ul)2ul，Enzyme Mix 2ul?；靹蚝笥?7℃水浴2小時，然后取1ul反應(yīng)液加入3ul上樣緩沖液混勻，于85℃水浴3-4min，取出后置于冰上，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的合成效率。
轉(zhuǎn)錄體RNA的純化在反應(yīng)液中加入1ul Nuclease-free的DNase I，于37℃水浴15min，去除質(zhì)粒DNA模板；然后加入30ul Nuclease-free water和25ul 2.5MliCl，混勻后置于-20℃，沉淀RNA，至少30min；4℃10000rpm離心15分鐘，棄上清，用70％乙醇(DEPC處理的去離子水配制)洗滌一次，離心棄上清，室溫干燥，用無RNase的ddH2O溶解至適當(dāng)體積，用分光光度計檢測RNA的濃度，然后分裝后于-70℃貯存。一般含有1ug線性化模板DNA的20ul反應(yīng)體系可產(chǎn)生大約20ugRNA。
2.將轉(zhuǎn)錄體RNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞在35mm細胞培養(yǎng)皿中接種105BHK細胞，37℃孵育24-48小時待細胞生長至50-80％融合時用于RNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作過程(1)棄去細胞上清，用無血清Eagle’s培養(yǎng)液洗滌細胞一次；(2)配制脂質(zhì)體-RNA復(fù)合物首先在無RNase的Ependorf管中加入1ml無血清無抗生素的Eagle’s培養(yǎng)液，然后加入轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C(GiBcol公司)10ul，在振蕩器上振蕩混勻，最后加入約5ug純化的轉(zhuǎn)錄體RNA，在振蕩器上充分混勻；(3)立刻將脂質(zhì)體-RNA復(fù)合物轉(zhuǎn)移至洗滌好的BHK-21細胞上，于37℃5％CO2孵箱中孵育4-5小時；(4)棄去轉(zhuǎn)染上清，更換Eagle’s完全培養(yǎng)基2.5ml(含10％小牛血清，2％青霉素鏈霉素，1％谷氨酰胺)，37℃5％CO2繼續(xù)孵育，逐日觀察細胞變化。該實驗設(shè)立陰性對照為步驟(2)不加RNA，其它條件相同。
在轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄體RNA后12h、24h、36h、48h、60h、72h六個時間點連續(xù)觀察細胞變化。當(dāng)細胞完全病變時，收獲細胞和上清凍存于-20℃。
用10ul脂質(zhì)體DMRIE-C包裹約5ugRNA轉(zhuǎn)染大約105個BHK細胞(在35mm培養(yǎng)皿中細胞生長達70-80％)，在轉(zhuǎn)染后24小時即可在顯微鏡下觀察到細胞病變效應(yīng)，但不是很明顯，只有很少量的細胞呈現(xiàn)圓縮，其折光所產(chǎn)生的表象與XJ-160病毒導(dǎo)致的BHK細胞病變極為相似，這些細胞在顯微鏡視野中成灶狀分布，隨時間發(fā)展這種圓縮的細胞越來越多；轉(zhuǎn)染48小時后細胞呈現(xiàn)明顯的細胞病變，幾乎80％的細胞呈現(xiàn)圓縮，有少許細胞開始脫落。而沒有轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄體RNA的陰性對照細胞形態(tài)一直保持良好。
3.恢復(fù)病毒擴增和定量當(dāng)大方瓶中的單層BHK細胞長到80-90％融合成片時，棄去培養(yǎng)液，用Eagle’s培養(yǎng)液洗滌一次，加入0.2ml轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄體RNA后的細胞上清，用Eagle’s培養(yǎng)液補足到1ml，置于37℃5％CO2孵箱中使病毒充分吸附細胞，吸附1小時后棄去吸附上清，加入10ml維持液(含2％小牛血清的Eagle’s培養(yǎng)液)，于37℃5％CO2孵箱中孵育，連續(xù)觀察細胞變化。當(dāng)細胞出現(xiàn)明顯病變且超過80％時收獲細胞，凍存于-20℃，該病毒視為第一代恢復(fù)病毒。在凍存之前，吸取上清0.2ml，繼續(xù)上述過程，得到第二代恢復(fù)病毒。同樣的方法由第二代恢復(fù)病毒傳代得到第三代恢復(fù)病毒，將恢復(fù)病毒的第三代病毒作為鑒定恢復(fù)病毒生物學(xué)特性的后續(xù)實驗毒種，以200ul為單位將第三代恢復(fù)病毒細胞上清分裝貯存于-70℃冰箱。
噬斑法測定恢復(fù)病毒滴度選擇生長良好融合成片的單層BHK細胞(六孔細胞培養(yǎng)板)，用Eagle’s培養(yǎng)液洗滌細胞一次；將需測定的病毒懸液作10倍系列稀釋(10-1-10-10)，在每個培養(yǎng)孔分別接種各稀釋度(根據(jù)檢測的病毒選擇稀釋度范圍10-4-10-8或10-5-10-9)的病毒懸液0.5ml，同時設(shè)不含病毒的Eagle’s培養(yǎng)液的空白對照，于37℃孵育吸附1小時，棄掉吸附病毒液，用Hank’s液洗滌一次，覆蓋含1％低熔點瓊脂糖的固體培養(yǎng)基(含4％小牛血清的2×Eagle’s培養(yǎng)液與等體積2％低熔點瓊脂糖混合配制而成)，于37℃5％CO2孵箱中孵育，連續(xù)觀察細胞變化；當(dāng)在顯微鏡下可以觀察到局部區(qū)域出現(xiàn)明顯細胞病變時覆蓋第二層含0.3％中性紅(Sigma公司)的固體培養(yǎng)基，于37℃5％CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，約6個小時后觀察空斑的形態(tài)并計算每個細胞孔的噬斑數(shù)量。病毒滴度計算每孔噬斑數(shù)/接種的病毒懸液體積×稀釋度。
當(dāng)細胞病變接近完全時，同時收獲對照細胞和轉(zhuǎn)染RNA細胞的上清，在BHK細胞連續(xù)傳代三次，后者在三次傳代細胞中均出現(xiàn)典型的細胞病變，前者均未出現(xiàn)任何細胞病變。對轉(zhuǎn)染RNA后的細胞上清以及三次傳代細胞上清進行了病毒滴度檢測，結(jié)果見表2。當(dāng)恢復(fù)病毒傳第三代后病毒的滴度基本達到XJ-160病毒的水平(108PFU/ml)。
表2恢復(fù)病毒滴度檢測細胞上清 病毒滴度(PFU/ml)轉(zhuǎn)染RNA細胞 1.5×107傳第一代細胞 2×107傳第二代細胞 5×107傳第三代細胞 2.6×108上述結(jié)果提示以全基因克隆pBR-XJ160作為模板合成的轉(zhuǎn)錄體RNA具有感染性，轉(zhuǎn)染BHK細胞后可產(chǎn)生病毒。將全基因克隆來源的病毒稱作恢復(fù)病毒，命名為BR-XJ160。
4.間接免疫熒光測定法(IFA)鑒定病毒的抗原性IFA操作過程(1)用PBS洗滌玻璃片一次，用冷丙酮固定15分鐘，吹干；(2)滴加50ulXJ-160病毒小鼠免疫腹水(效價1∶1240，1∶100稀釋)(本室自制)，37℃濕盒作用30分鐘，PBS沖洗2-3次，吹干；(3)滴加50ul FITC標記的羊抗小鼠抗體(1∶100稀釋原液)，37℃濕盒作用30分鐘，PBS沖洗3次；(4)用90％甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
為了鑒定來自全基因克隆的恢復(fù)病毒(BR-XJ160)的抗原性，分別用恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒感染BHK細胞，感染后24小時細胞完全病變時用抗XJ-160病毒的小鼠免疫血清進行間接免疫熒光檢測(IFA)。結(jié)果顯示兩種病毒感染的細胞均表現(xiàn)出相同的熒光(見圖5)。該結(jié)果提示恢復(fù)病毒(BR-XJ160)具有與XJ-160病毒相同的抗原性。
5.恢復(fù)病毒(BR-XJ160)的遺傳學(xué)鑒定為了區(qū)分恢復(fù)病毒和親本病毒XJ-160，在構(gòu)建XJ-160病毒的全基因克隆時在基因組8453nt引入一個堿基突變(C→T)，創(chuàng)建出Xba I酶切識別序列(8451-8456 TCCAGA→TCTAGA)，將該酶切位點作為XJ-160病毒感染性克隆的遺傳標記(見圖2)。將轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄體RNA后的細胞上清和親本病毒分別感染BHK細胞，待出現(xiàn)明顯的細胞病變后，分別收獲細胞，提取細胞總RNA。利用RT-PCR方法擴增病毒基因組含有Xba I位點(8451-8456nt)的基因片段(7567-9821nt，2255bp)。用Xba I消化來自兩種病毒的RT-PCR產(chǎn)物，應(yīng)得到不同的酶切結(jié)果(見圖6A)。
上游引物7568f(5’GGATCCACTATGAATAGAGGATTC 3’7567-7584nt)下游引物E3-E2r(5’TTACGGTACCGTAGCGTTAGCCGATCTAATGC 3’9821-9802nt)。
將Xba I酶消化后的RT-PCR產(chǎn)物，在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。
電泳結(jié)果(見圖6B)顯示恢復(fù)病毒的RT-PCR產(chǎn)物可被Xba I酶切產(chǎn)生885bp和1368bp兩條片段，而XJ-160病毒的PCR產(chǎn)物不能被Xba I酶切割為兩片段。這一結(jié)果明確了恢復(fù)病毒(BR-XJ160)來自全基因克隆pBR-XJ160，由其感染性全長RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染細胞后得到，而不是受親本病毒XJ-160污染所致。
6.具有感染性的全基因克隆的遺傳穩(wěn)定性鑒定將經(jīng)鑒定具有感染性的全基因克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli DH5α，挑單菌落接種Amp+LB液體培養(yǎng)基，37℃搖菌12小時，堿裂解法提取質(zhì)粒，作為第一次擴增的質(zhì)粒；將第一次擴增質(zhì)粒的菌液以1∶1000稀釋后轉(zhuǎn)接，搖菌12小時，提取質(zhì)粒作為第二次擴增的質(zhì)粒；依此類推，這樣連續(xù)得到8次擴增的質(zhì)粒。每一次質(zhì)粒擴增相當(dāng)于復(fù)制20代。將8次擴增所得質(zhì)粒同時用Sac I/Xho I雙酶切消化2-3小時，于0.8％瓊脂糖凝膠電泳，觀察8次擴增質(zhì)粒的酶切圖譜是否有變化。
結(jié)果顯示8代質(zhì)粒的酶切圖譜完全相同，Sac I/Xho I雙酶切pBR-XJ160質(zhì)粒得到長11.6kb的全長基因組cDNA片段和2.9kb載體片段(見圖7)。這些結(jié)果提示該全基因克隆pBR-XJ160質(zhì)粒在DH5α宿主菌中可以穩(wěn)定傳代。
用第8次擴增的全基因克隆質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得轉(zhuǎn)錄體RNA，在經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK細胞后48小時即可觀察到細胞圓縮、脫落等細胞病變效應(yīng)。將轉(zhuǎn)染后的細胞上清再次感染BHK細胞，24小時后細胞完全病變。以上結(jié)果表明全基因克隆pBR-XJ160質(zhì)粒的感染性也是穩(wěn)定的。
四、恢復(fù)病毒(BR-XJ160)的生物學(xué)性狀鑒定1.病毒在BHK細胞上的空斑病毒的噬斑檢測方法上面已有描述。
對恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和親本病毒XJ-160在BHK細胞上形成的空斑進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在長滿BHK細胞的35mm培養(yǎng)皿中分別感染100pfu病毒后約48小時均形成清晰可見的病毒噬斑，二者的形狀大小沒有明顯的區(qū)別。見圖82.電鏡觀察病毒形態(tài)電鏡負染色檢查操作(1)取感染病毒后細胞完全病變的細胞上清20ul滴于石蠟?zāi)ど希瑢~網(wǎng)反扣于上清上約10min；(2)吸取20ul磷鎢酸負染試劑滴于石蠟?zāi)ど希瑢~網(wǎng)再反扣于負染試劑上約10min；(3)取下銅網(wǎng)，室溫晾干，即可通過透射電鏡觀察病毒形態(tài)。
電鏡負染色觀察恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和親本病毒的形態(tài)在XJ-160病毒和恢復(fù)病毒感染的細胞上清中，負染色均可以觀察到病毒顆粒，多呈圓形，外周可見到排列整齊的棘突，直徑大約在60-80nm之間(N＞10)。兩種病毒顆粒在形態(tài)上沒有明顯的區(qū)別。見圖93.病毒的生長動力檢測取已知病毒滴度的親本病毒和恢復(fù)病毒，以0.01mol感染單層BHK細胞，每一種病毒平行試驗三孔。分別于感染后4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h、36h吸取細胞上清，用噬斑法測定各時間點的細胞上清的病毒滴度，計算每個時間點上清病毒滴度的平均值，繪制病毒感染BHK細胞后的生長動力曲線。
感染病毒后連續(xù)觀察細胞病變，兩種病毒產(chǎn)生的細胞病變過程和程度基本相同于感染后12小時可見到零星的細胞出現(xiàn)圓縮、突起和細胞折光改變；于感染后16小時局部細胞呈現(xiàn)較明顯的細胞病變效應(yīng)(CPE)；20小時細胞呈現(xiàn)典型的細胞病變效應(yīng)；24小時細胞幾乎全部病變。對不同時間點的細胞上清樣品進行病毒滴度測定顯示兩種病毒在BHK細胞中的生長動力曲線是相似的(見圖10)。以上結(jié)果提示恢復(fù)病毒和親本病毒在BHK細胞中的復(fù)制能力和播散能力沒有顯著區(qū)別。
4.病毒對乳小鼠的致病性用保存于-70℃的第三代恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒，對出生2-3日齡的乳小鼠進行腦內(nèi)接種，每只小鼠接種0.02ml。逐日觀察乳鼠是否發(fā)病及發(fā)病時間、發(fā)病特征、是否死亡。同時設(shè)陰性對照，接種Eagle’s培養(yǎng)液0.02ml。每組共8只乳鼠。
接種病毒的兩組乳鼠均在4天后出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，表現(xiàn)為拒乳、后肢麻痹，兩組乳鼠的癥狀相似并逐漸加重，第6天開始有乳鼠死亡，至第8天接種病毒的兩組乳鼠全部死亡。而對照組乳鼠生長狀態(tài)良好，未見任何臨床癥狀，全部存活。
以上結(jié)果表明恢復(fù)病毒(BR-XJ160)和親本病毒XJ160對乳小鼠的致病性沒有明顯區(qū)別。
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<212>DNA<213>人工序列<400>9ccgctcgagt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttgaaatg ttaaaaacaa60aattttggtt aattg 7權(quán)利要求
1.一種XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆，其特征在于該克隆由低拷貝骨架質(zhì)粒pBR、病毒基因組全長cDNA片段、基因組5’端的SP6啟動子序列和基因組3’端的35個連續(xù)的A組成。其中所述的骨架質(zhì)粒pBR是線性化的質(zhì)粒pBR322與含單酶切位點的連接子連接而成；所述的病毒基因組全長cDNA片段含有11620個核甘酸，通過所述單酶切位點將覆蓋病毒全長基因組的cDNA片段插入到骨架質(zhì)粒pBR中；所述的SP6啟動子序列位于基因組5’端上游緊鄰第一個核苷酸A，所述的35個連續(xù)的A緊鄰基因組3’末端核甘酸C。該感染性全基因組cDNA克隆序列為1 ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATAGCACT51 ACCATCATAA TGGAGAGGCC TGTAGTTAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG101 TCCGTTTGTC GCTCAACTGC AAAAGAGCTT CCCGCAATTC GAGGTAGTAG151 CACAGCAGGC CACACCAAAT GACCATGCTA ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT201 CTGGCTAGTA AATTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG CGACGATTTT251 GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCACTATC301 ACTGCGTCTG CCCTATGCGG AGCCCCGAAG ATCCCGACCG TATGATGAAA351 TACGCCAATA AGTTGGCGGA GAAGGCAAAT AAGATTACTA ATAAAAATTT401 GCATGAGAAG ATTAAAGACC TCCGGATCGT ACTCGATACT CCGGATGCTG451 AGACACCGTC GCTCTGCTTC CATAATGACG TTACCTGCAG TACGCGTGCA501 GAGTACTCCG TTATGCAAGA TGTGTATATT AATGCACCCG GAACTATTTA551 CCATCAAGCT ATGAAAGGCG TGCGGACACT TTACTGGATT GGGTTTGACA601 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CACTATTCCG CGTGGAGTAG GAGGCAGAGG8201 TGACAGCGGC CGCCCGATTA TGGACAACGC AGGCCGCGTC GTCGCTATCG8251 TCCTCGGAGG AGCTGATGAG GGAACACGTA CTGCCCTCTC GGTAGTTACC8301 TGGAACAGTA AAGGAAAAAC GATTAAGACA TCCCCTGAGG GAACTGAAGA8351 GTGGTCCGCA GCACCGCTGG TTACGGCCAT GTGCTTACTT GGAAATGTAA8401 GCTTCCCTTG CAACCGTCCG CCTACTTGCT ACACCCGCGA ACCATCTAGA8451 GCGTTAGATA TCCTGGAAGA GAATGTGAAC CATGAGGACT ACGACACTTT8501 GCTCGACGCT ATACTGCGAT GCGATTTTTC CGGTAGAAAT AAAAGAAGTG8551 TTACCGGCGA CTTTACCTTG ACCAGCCCGT ACCTAGGTAC ATGTCCATAC8601 TGTCACCATA CCGAGCCGTG CTTTAGTCCG ATAAAGATCG AGCAGGTCTG8651 GGATGAAGCG GATGACACCA CTATACGCAT CCAGACCTCT GCCCAATTTG8701 GGTACGATCA GAGTGGAGCG ACAAGCGTAA ATAAATACCG CTACATGTCG8751 TTCGATCAGG ATCATACTGT GAAAGAAGGC CAGATGGACG ATATTAAGAT8801 CAGTACTTCA GGACCGTGCA GAAGACTTGG CCATAAAGGT TACTTCCTCC8851 TTGCGAAATG TCCGCCCGGG GACAGCGTGA CGGTCAGTAT AGTGAGCAGC8901 AGTTCAACTA CATCATGCAC GTTGGCACGT AAGATAAAAC CGAAGTTTGT8951 GGGACGGGAA CGGTATGATC TGCCCCCCGT TTACGGAAAG AACATCCCTT9001 GCAGAATGTA 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AAACAGTCAG CCGTTCTTTT GGGCTCAGTT GTGTATCCCC TTAGCCGCTG9901 TTGTCATCCT TGTGCGTTAC TGTTCATGTT GCTTGCCTTT TTTAGTGGTT9951 GCCGGCGTCT ACCTGGGGAA GGTAGACGCC TACGAACATG CGACCACCAT10001 TCCAAATGTG CCGAAGATTC CGTATAAAGC ACTTGTAGAA CGGTCTGGCT10051 ACGCCCCGCT TAACTTAGAG ATCACCGTCG TGTCGTCGCA GGTTTTACCA10101 TCTACTAATC AAGAGTATAT CACCTGCAAG TTTACTACTG TAGTCCCCTC10151 CCCGAAAGTC AAATGTTGCG GCTCCTTGGA ATGTCAGCCC GCCGCTCACG10201 CCGACTATAA CTGCAAAGTT TTTGGAGGGG TTTACCCATT CATGTGGGGA10251 GGAGCACAGT GTTTTTGCGA CAGCGAGAAC ACCCAGATGA GCGAGGCGTA10301 CGTCAAACTG TCAGCGGACT GCGTAACGGA TTACGCACAG GCAGTTAAGG10351 TGCATACTGC TGCAATGAAG GTAGGACTAC GCATAGTGTA TGGGAATACC10401 ACCAGCTATT TAGATGTGTA CGTGAATGGA GTCACGCCGG GGACATCCAA10451 AGATCTAAAA GTCATAGCTG GGCCAGTTTC GTCCTCCTTT ACGCCGTTTA10501 ATCATAAGGT TGTCATCTAC CGTGGTTTAG TCTATAATTA TGACTTCCCT10551 GAATACGGCG CAATGAAACC TGGAGTGTTC GGAGACATCC AAGCTACCTC10601 CTTGACCAGT AGAGACCTTA TTGCAAGCAC GGACATTAGA TTGCTTAAGC10651 CTTCCGTTAA AAACGTGCAC GTCCCGTACA CGCAAGCTGC TTCAGGATTC10701 GAGATGTGGA AGAACAACTC AGGTCGACCA CTGCAGGAAA CCGCTCCTTT10751 TGGGTGTAAG ATTGCAGTCA ACCCGCTACG AGCGGTGGAC TGTTCGTACG10801 GTAATATTCC TATCTCCATC GATATCCCAA ATGCCGCCTT CATTAGGATA10851 TCGGATGCGC CGCTAGTTTC GACGGTTAAA TGTGAGGTCA GCGAATGTAC10901 CTATTCAGCT GATTTTGGTG GTATGGCAAC CCTGCAGTAT GTGTCGGACC10951 GCGAAGGACA ATGCCCCGTG CACTCTCACT CAAGCACAGC AACACTTCAG11001 GAATCGACAG TGCATGTCCT GGAGAAAGGG GCGGTGACCG TGCACTTTAG11051 TACCGCCAGC CCACAGGCTA ATTTCATTAT ATCGCTGTGT GGCAAGAAAA11101 CAACATGCAA CGCGGAATGT AAGCCACCTG CGGACCACAT TGTGAGTACA11151 CCGCACAAAA TCGATCAGGA GTTCCAAACC GCTATTTCAA AAACATCATG11201 GAGCTGGTTA CTGGCACTCT TTGGCGGCGC CTCGTCGCTA TTAATTATAG11251 GACTCATGAT TTTTACTTGC AGCATGTTGC TGACAAGCAC CCGGAGATGA11301 CCGCTATGTC CCAATGACCC GACCAGCAAA ACTCGACGTA TTTCCGAGGA11351 ACTGATGTGC ATAATGCATC AGGCTGGTAT ATTAGATCCC CGCTCATCGC11401 GGGCACTATA GCAACAATGA AACTCGATGT ATTTCCGAGG ATGCGCAGTG11451 CATAATGCTG CGCCGTGTTG CCATATAATC ATTTTATTAA TCAACTATTT11501 AGCAGACGCT AAAACTCAAT GTATTTCTGA GGAAGCGTGG TGCATAATGC11551 CATGCAGCGT CTGTATAATT TCTTTTATTA TTCTTTTATC AATTAACCAA11601 AATTTTGTTT TTAACATTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA11651 AAAAACTCGA GCAATTCTTG AAGACGAAAG GGCCTCGTGA TACGCCTATT11701 TTTATAGGTT AATGTCATGA TAATAATGGT TTCTTAGACG TCAGGTGGCA11751 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA11801 CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA11851 ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTATGAGTAT TCAACATTTC CGTGTCGCCC11901 TTATTCCCTT TTTTGCGGCA TTTTGCCTTC CTGTTTTTGC TCACCCAGAA11951 ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT CAGTTGGGTG CACGAGTGGG12001 TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG AGTTTTCGCC12051 CCGAAGAACG TTTTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC12101 GCGGTATTAT CCCGTGTTGA CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT12151 ACACTATTCT CAGAATGACT TGGTTGAGTA CTCACCAGTC ACAGAAAAGC12201 ATCTTACGGA TGGCATGACA GTAAGAGAAT TATGCAGTGC TGCCATAACC12251 ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT CTGACAACGA TCGGAGGACC12301 GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT GTAACTCGCC12351 TTGATCGTTG GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT12401 GACACCACGA TGCCTGCAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC12451 TGGCGAACTA CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG12501 AGGCGGATAA AGTTGCAGGA CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC12551 TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT12601 CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT12651 ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT12701 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA12751 CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA12801 TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT12851 GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC12901 TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA12951 AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT13001 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT13051 CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC13101 CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT13151 GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA13201 TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT13251 TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA13301 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG13351 CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG13401 CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG ACTTGAGCGT13451 CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG13501 CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA13551 TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC13601 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA13651 GTCAGTGAGC GAGGAAGCGG AAGAGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA13701 CGCATCTGTG CGGTATTTCA CACCGCATAT GGTGCACTCT CAGTACAATC13751 TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT ACACTCCGCT ATCGCTACGT13801 GACTGGGTCA TGGCTGCGCC CCGACACCCG CCAACACCCG CTGACGCGCC13851 CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC TTACAGACAA GCTGTGACCG13901 TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT CACCGTCATC ACCGAAACGC13951 GCGAGGCAGC TGCGGTAAAG CTCATCAGCG TGGTCGTGAA GCGATTCACA14001 GATGTCTGCC TGTTCATCCG CGTCCAGCTC GTTGAGTTTC TCCAGAAGCG14051 TTAATGTCTG GCTTCTGATA AAGCGGGCCA TGTTAAGGGC GGTTTTTTCC14101 TGTTTGGTCA CTGATGCCTC CGTGTAAGGG GGATTTCTGT TCATGGGGGT14151 AATGATACCG ATGAAACGAG AGAGGATGCT CACGATACGG GTTACTGATG14201 ATGAACATGC CCGGTTACTG GAACGTTGTG AGGGTAAACA ACTGGCGGTA14251 TGGATGCGGC GGGACCAGAG AAAAATCACT CAGGGTCAAT GCCAGCGCTT14301 CGTTAATACA GATGTAGGTG TTCCACAGGG TAGCCAGCAG CATCCTGCGA14351 TGCAGATCCG GAACATAATG GTGCAGGGCG CTGACTTCCG CGTTTCCAGA14401 CTTTACGAAA CACGGAAACC GAAGACCATT CATGTTGTTG CTCAGGTCGC14451 AGACGTTTTG CAGCAGCAGT CGCTTCACGT TCGCTCGCGT ATCGGTGATT14501 CATTCTGCTA ACCAGTAAGG CAACCCCGCC AGCCTAGCCG GGTCCTCAAC14551 GACAGGAGCA CGATCATGCG CACCCGTGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA14601 GAGCTCGATT TAGGTGACAC TATAG其中1-11620 病毒核苷酸序列11621-11655 polyA序列11656-11661 XhoI酶切位點11656-14606 pBR骨架質(zhì)粒序列14601-14606 SacI酶切位點14607-14625 SP6啟動子序列
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆，其特征在于所述的線性化的質(zhì)粒pBR322是通過EcoR I和Ava I酶切，除去質(zhì)粒pBR322中四環(huán)素抗性基因Tetr后的剩余部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆，其特征在于所述的連接子由兩個互補的寡核苷酸片段SX-和SX+經(jīng)退火獲得，其中SX-和SX+的序列分別為SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’因而生成的所述單酶切位點為Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆，其特征在于所述的覆蓋病毒全長基因組cDNA片段包括三個組裝片段NS1、6K和S2，分別依次對應(yīng)于XJ-160病毒基因組第1-2516位、第2517-8451位、 第8452-11626位核苷酸，同時在NS1片段5’端引入SP6啟動子序列，在S2片段3’端引入35個連續(xù)的A，第8453位核苷酸由基因組中的C突變?yōu)門，由此引入的Xba I位點作為鑒別恢復(fù)病毒的遺傳標記。
5.一種權(quán)利要求1所述的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于它包括(1)從感染XJ-160病毒的乳小鼠腦組織提取RNA；(2)用三對引物通過RT-PCR擴增，得到覆蓋病毒全長基因組的三個cDNA組裝片段；(3)制備上述三個cDNA組裝片段的T載體克隆；(4)經(jīng)亞克隆操作構(gòu)建得到XJ-160病毒的全長基因組cDNA克?。?5)體外轉(zhuǎn)錄制備病毒基因組全長RNA；(6)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將上述全長RNA導(dǎo)入哺乳動物細胞；(7)收取含恢復(fù)病毒的細胞上清；(8)對恢復(fù)病毒進行遺傳標記的鑒定；(9)比較恢復(fù)病毒與親本病毒的生物學(xué)特性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于所述的三對引物及其序列為Sp6f2 5’CGAGCTCGATTTAGGTGACACTATAGATTGATTGACGGCGTAGTACACACTATTG 3’BamR2 5’CTTGCAGGGGTTTGTAGTCTTCAT 3’P5 5’CGGGATCCTAAGCAGTGTGG 3’XbR5’CTCTAGATGGTTCGCGGGTG 3’XbF5’CATCTAGAGCGTTAGATATCCTG 3’X2 5’CCGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGGTTAATTG 3’由Sp6f2和BamR2擴增得到NS1片段，由P5和XbR擴增得到6K片段，由XbF和X2擴增得到S2片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于所述的病毒基因組全長cDNA片段的亞克隆操作，包括下述步驟(1)Xba I/Xho I雙酶切pGEMT-S2質(zhì)粒和pBR骨架質(zhì)粒，得到S2片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I雙酶切pGEMT-6K質(zhì)粒和pBR-S2質(zhì)粒，得到6kb片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I雙酶切pGEMT-NS1質(zhì)粒和pBR-6K-S2質(zhì)粒，得到NS1片段和線性質(zhì)粒，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化獲得目的質(zhì)粒pBR-NS1-6K-S2，該質(zhì)粒即為XJ-160病毒全基因組cDNA克隆質(zhì)粒，命名為pBR-XJ160。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的由線性化的質(zhì)粒pBR322與含單酶切位點的連接子連接而成的骨架質(zhì)粒pBR，其特征在于所述的線性化的質(zhì)粒pBR322是通過EcoR I和AvaI酶切除去質(zhì)粒pBR322中四環(huán)素抗性基因Tetr后的剩余部分；所述的連接子由兩個互補的寡核苷酸片段SX-和SX+經(jīng)退火獲得，其中SX-和SX+的序列分別為SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’；SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’因而生成的所述單酶切位點為Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8中所述的骨架質(zhì)粒pBR作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆載體的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的骨架質(zhì)粒pBR作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆載體的用途，其特征在于所述的RNA病毒為披膜病毒科病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的骨架質(zhì)粒pBR作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆載體的用途，其特征在于所述的RNA病毒為甲病毒屬病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的骨架質(zhì)粒pBR作為制備RNA病毒全長基因組感染性cDNA克隆載體的用途，其特征在于所述的RNA病毒為辛德畢斯病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種XJ－160病毒感染性全基因組cDNA克隆pBR－XJ160，該克隆由骨架質(zhì)粒pBR、含11620個堿基對的病毒基因組全長cDNA、基因組5’端的SP6啟動子序列和基因組3’端的35個連續(xù)的A組成。其中所述的骨架質(zhì)粒pBR由線性化的質(zhì)粒pBR322與含單酶切位點的連接子連接而成；所述的病毒基因組全長cDNA由三個cDNA組裝片段通過所述單酶切位點插入骨架質(zhì)粒pBR組裝而成，三個組裝片段順次連接，覆蓋了XJ－160病毒的全長基因組；所述的SP6啟動子序列位于基因組5’端上游緊鄰第一個核苷酸A，所述的35個連續(xù)的A緊鄰基因組3’末端核甘酸C，該克隆可在宿主菌中穩(wěn)定傳代，其RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染宿主細胞后可以產(chǎn)生恢復(fù)病毒(BR－XJ160)，并可以通過遺傳標記的鑒定區(qū)分恢復(fù)病毒與親本病毒?；謴?fù)病毒(BR－XJ160)較好的重現(xiàn)了XJ－160病毒的各種生物學(xué)特征，該感染性全基因組cDNA克隆是理想的XJ－160病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)。
文檔編號C12P19/34GK1621527SQ20031011545
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者梁國棟, 楊益良, 付士紅, 何海懷, 侯云德 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所