一種對(duì)于鼠具有感染性的人腸道病毒71型病毒突變株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種對(duì)于鼠具有感染性的人腸道病毒71型病毒突變株。
【背景技術(shù)】
[0002]手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)是5歲以下兒童常見的病毒性疫病，患病兒童表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔潰瘍、手部足部等處皮膚紅疹，嚴(yán)重患兒有呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等的病變甚至死亡，人腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)是HFMD的兩個(gè)主要致病原[I]。人腸道病毒71型(EV71)是引起我國(guó)手足口病的最主要病原體。
[0003]中國(guó)最近爆發(fā)的手足口病主要與CA16和EV71有關(guān)，其中EV71是導(dǎo)致患者嚴(yán)重癥狀和重大死亡的主要病原，目前仍無可用的疫苗和特異的藥物，EV71的單價(jià)滅活疫苗雖已經(jīng)完成三期的臨床試驗(yàn)[2-4]，但仍存在很多問題，而其他類型的疫苗仍在研發(fā)階段[5]，其中基于病毒樣顆粒的新型疫苗是最有潛力的候選疫苗[5，6]，但面臨動(dòng)物模型缺乏的問題。目前尚無針對(duì)性的預(yù)防性疫苗或治療性藥物，也缺乏用于評(píng)價(jià)疫苗和藥物保護(hù)效果的小鼠模型。
[0004]小鼠感染模型為研究病毒的致病機(jī)制和宿主的免疫反應(yīng)提供了可行性手段[7-11]，小鼠感染模型也方便評(píng)價(jià)疫苗有效性和篩選抗病毒藥物。然而，EV71病毒不能有效感染成年小鼠[I]。因此，缺乏適宜的小動(dòng)物感染模型大大限制了候選疫苗有效性的評(píng)價(jià)，本領(lǐng)域亟待盡快解決這一瓶頸問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)于鼠具有感染性的人腸道病毒71型病毒突變株。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，提供一種人腸道病毒71型的鼠適應(yīng)株，所述適應(yīng)株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC V201343。
[0007]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的人腸道病毒71型的鼠適應(yīng)株對(duì)于鼠的致病力強(qiáng)。
[0008]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人腸道病毒71型的鼠適應(yīng)株的用途，用于制備試劑，所述的試劑用于制備感染人腸道病毒71型的鼠。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的感染人腸道病毒71型的鼠用于作為動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)抗病毒藥物的治療效果。
[0010]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的組合物，所述的組合物含有所述的人腸道病毒71型的鼠適應(yīng)株；以及生理學(xué)可接受的載體。
[0011]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的組合物的用途，用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的試劑盒。
[0012]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的試劑盒，其中包括所述的人腸道病毒71型的鼠適應(yīng)株或所述的組合物。
[0013]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【附圖說明】
[0014]圖1、EV71對(duì)ICR乳鼠的致病性，2.5X107TCID50的G082腹腔感染I日齡ICR小鼠(n=14)和1.0 X 106TCID50的鼠適應(yīng)株MAV-W腹腔感染7日齡ICR小鼠(n=7)，感染后觀察小鼠的存亡情況和臨床病征14天。小鼠在感染EV71后的存亡曲線(A)和臨床癥狀分級(jí)情況(B)。臨床病征分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0015]圖2、鼠適應(yīng)株MAV-W腹腔注射，感染2周齡及較小的ICR小鼠，
[0016]不同劑量的鼠適應(yīng)株MAV-W腹腔注射7日齡和14日齡的ICR小鼠后的存亡曲線
(A)和臨床癥狀分級(jí)(B)。臨床病征分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0017]圖3.G08-MAV感染c57小鼠，2.5X107TCID50的G082腹腔注射感染I日齡c57小鼠(n=6)，鼠適應(yīng)株MAV-W腹腔注射感染7日齡c57小鼠(n=ll)后的死亡曲線㈧和臨床癥狀分級(jí)(B)。臨床病征分級(jí)如下:0級(jí)，健康；I級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0018]圖4、利用MAV-W評(píng)價(jià)EV71單抗D5的抗病毒保護(hù)效果。三組7日齡ICR乳鼠腹腔注射鼠適應(yīng)株獻(xiàn)￥-1(5父1051'(:1050)，2411后三組分別腹腔注射？83、對(duì)照抗體(10 μ g/g)和EV71特異單抗D5 (10 μ g/g)。之后連續(xù)14天每天記錄各組的臨床癥狀評(píng)分(A)和死亡率
(B)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。其中對(duì)照抗體為HBsAg特異的單抗。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明人通過在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代人腸道病毒71型(EV71)G082分離株，獲得一個(gè)鼠適應(yīng)性的突變株，命名為MAV-W，并在已建立的小鼠感染模型中評(píng)價(jià)了 EV71單抗對(duì)病毒攻擊小鼠的有效保護(hù)作用。本發(fā)明的毒株為評(píng)價(jià)候選疫苗和藥物的有效性以及研究EV71的致病機(jī)制提供了有效途徑。
[0020]與親本株G082相比，本發(fā)明獲得的MAV-W病毒對(duì)小鼠的致病性增強(qiáng)，MAV-W腹腔接種7日齡和14日齡ICR小鼠后引起共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等典型神經(jīng)癥狀和較高死亡率，MAV-W腹腔感染7日齡c57小鼠，也出現(xiàn)嚴(yán)重癱瘓和死亡。因此，本發(fā)明的MAV-W病毒非常適合用于制備動(dòng)物EV71感染模型，應(yīng)用于科學(xué)研究。
[0021]應(yīng)用本發(fā)明的MAV-W病毒制備的動(dòng)物感染模型，其病情變化顯著、利于觀察和評(píng)估。適合應(yīng)用于對(duì)一些潛在治療病毒感染的藥物進(jìn)行療效評(píng)估。在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用基于MAV-W的EV71小鼠感染模型，發(fā)現(xiàn)EV71中和性抗體能夠有效保護(hù)被病毒攻擊的小鼠。
[0022]本發(fā)明還提供了一種組合物，含有有效量所述的人腸道病毒71型的鼠適應(yīng)株以及生理學(xué)可接受的載體。所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“生理學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。
[0023]本發(fā)明還提供了一種用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的試劑盒或藥盒，其中含有所述的組合物，或所述的重組載體。
[0024]此外，為了方便給藥，所述的藥盒中還可含有注射用的針，和/或藥學(xué)上可接受的載體，和/或使用說明書。
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]1、材料與方法
[0027]細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0028]RD細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))和Vero細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))用含有10%血清和100U/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。ICR和c57孕鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海巴斯德研究所的ABSL2+動(dòng)物房。
[0029]EV71鼠適應(yīng)株的建立
[0030]EV71 病毒G082 株(即 Ku Z, Shi J, Liu Q, and Huang Z*.Development of murinemonoclonal antibodies with potent neutralizat1n effects on enterovirus71.J.Virol.Methodsl86 (2012) 193-197 中的 EV71/G082 病毒株)在 RD 細(xì)胞上擴(kuò)增，按照Reed-Muench法在RD細(xì)胞上測(cè)定病毒滴度TCID50為5.0X 108/ml，該分離株病毒通過腹腔感染一日齡的ICR小鼠，取一只出現(xiàn)明顯癱瘓的小鼠腦組織，加入Iml冷的無菌PBS溶液后碾磨勻衆(zhòng)，反復(fù)凍融三次后，4000rpm/min在4°C離心30min,0.45 μ m濾器過濾,取上清液，在Veix)細(xì)胞上傳代一次，腹腔注射I日齡的ICR小鼠，取一只病死的小鼠腦組織，同上處理后在Vero細(xì)胞上傳代,如此反復(fù)進(jìn)行在小鼠體內(nèi)和Vero細(xì)胞上進(jìn)行四個(gè)循環(huán),最終篩選獲得一株鼠適應(yīng)的EV71病毒，命名為EV71-G082-Mouse Adapted Virus-W(MAV-W)，分裝后_80°C保存，并在Vero細(xì)胞測(cè)定其TCID50值為1.0X 108/ml。
[0031]病毒感染小鼠實(shí)驗(yàn)
[0032]特定日齡的ICR或c57小鼠腹腔注射適當(dāng)劑量的野生毒株G082或鼠適應(yīng)株MAV-W,以后每日觀察小鼠的臨床病癥和存亡情況。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0033]利用MAV-W評(píng)價(jià)EV71單抗對(duì)病毒攻擊小鼠的保護(hù)效果
[0034]三組7日齡的ICR小鼠先通過腹腔注射感染MAV-W(5.0X105TCID50)，24h后三組ICR小鼠分別通過腹腔注射PBS、對(duì)照抗體(即Ku Z，Shi J，Liu Q，and HuangZ*.Development of murine monoclonal antibodies with potent neutralizat1neffects on enterovirus71.J.Virol.Methodsl86 (2012) 193 - 197 中的對(duì)照抗體)(10 μ g/g)和 EV71 的單抗 D5(即 Ku Z，Shi J，Liu Q，and Huang Z*.Development of murinemonoclonal antibodies with potent neutralizat1n effects on enterovirus71.T.Virol.Methodsl86 (2012) 193 - 197 中的 D5) (10 μ g/g)，之后連續(xù) 14 天每天記錄各組的臨床癥狀評(píng)分和死亡率。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0035]I1、實(shí)施例
[0036]實(shí)施例1、MAV-W對(duì)小鼠的致病力顯著增強(qiáng)
[0037]為比較G082和MAV-W對(duì)小鼠的致病力，將2.5 X 107TCID50的G082腹腔感染I日齡ICR小鼠，1.0X 106TCID50的鼠適應(yīng)株MAV-W腹腔感染7日齡ICR小鼠，小鼠的死亡率分別為0%和85.7%(圖1A)，G082感染的I日齡小鼠約64%(9/14)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，僅7%(1/14)的小鼠出現(xiàn)癱瘓。而7日齡的小鼠在感染1.0X106TCID50的MAV-W后表現(xiàn)出反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、腿無力繼而發(fā)生癱瘓甚至死亡的臨床病癥(圖1B)，感染后第5天開始出現(xiàn)癱瘓，約85.7%(6/7)的小鼠出現(xiàn)癱瘓