專利名稱：腸道病毒71型感染性克隆及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種正鏈RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及腸道病毒71型感染性克隆及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
由腸道病毒71型(Enterovirus type 71 ；EV71)引起的嬰幼兒手足口病常形成大范圍爆發(fā)流行，其主要臨床特征為發(fā)熱和手足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個(gè)別患者還可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜炎等致命性并發(fā)癥。手足口病四季均發(fā)病，人群對(duì)引起手足口病的腸道病毒普遍易感，但病毒隱性感染與顯性感染之比為100 1，成人大多已通過(guò)隱性感染獲得相應(yīng)抗體，因此，手足口病患者主要為學(xué)齡前兒童。目前國(guó)內(nèi)對(duì)EV71引起的手口足病尚無(wú)有效的治療藥物和疫苗，主要依靠預(yù)防綜合防治措施。2008年以來(lái)EV71在我國(guó)大陸廣泛流行，疫情在全國(guó)各地蔓延開(kāi)來(lái)，其來(lái)勢(shì)更洶涌、更嚴(yán)重，EV71導(dǎo)致的疾病給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此需要建立感染性克隆，特別是迫切需要利用本土流行毒株構(gòu)建感染性克隆，來(lái)研究其致病機(jī)理、病毒變異與毒力關(guān)系，并用于制備疫苗。這一工作顯得尤為迫切和重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種構(gòu)立EV71感染性克隆的方法；本發(fā)明目的之二是在前述基礎(chǔ)上提供一種針對(duì)正鏈RNA病毒高效拯救系統(tǒng)；本發(fā)明目的之三是在前述基礎(chǔ)上提供一種EV71病毒的cDNA克隆的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法是a.以從EV17病毒毒株提取的RNA為模板，用下述三對(duì)引物分別擴(kuò)增出Li、L2和 L3三個(gè)片段，所用的三對(duì)引物為L(zhǎng)l上游引物atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctata gtcLl 下游弓丨物:gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaagL2 上游弓丨物ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagatL2 下游弓I物:tttgagatctgattctctagaagtggcagctgtL3 上游弓丨物:tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaatL3 下游引物:ttttctagagcggccgctTO ；b.將Ll片段經(jīng)酶切后與真核表達(dá)載體連接，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得亞克隆質(zhì)粒PLl，再將經(jīng)PLl質(zhì)粒與L2片段經(jīng)酶切后連接轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒PL2，再將質(zhì)粒PL2與L3片段經(jīng)酶切后連接轉(zhuǎn)化，獲得含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒；c.將b所得到的含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至非
3洲綠猴腎細(xì)胞宿主細(xì)胞，得到EV711型感染性克隆。本發(fā)明的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法中所用真核表達(dá)載體為 pcDNA3. 1(+)，所用的大腸桿菌為JM109 ；如此得到的三個(gè)亞克隆質(zhì)粒分別是pPLl質(zhì)粒、 PPL2質(zhì)粒和pPL3質(zhì)粒；所得到的含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒為 pPev3. 1 (+)重組質(zhì)粒。以前述優(yōu)選方式得到的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒為pPev3. 1⑴重組質(zhì)粒。EV71是小RNA病毒科腸道屬中的一員，根據(jù)衣殼蛋白VPl區(qū)的核苷酸序列的不同， EV71可以分為A、B、C三個(gè)基因型，其中B型和C型又進(jìn)一步劃分為B1、B2、B3、B4以及Cl、 C2、C3、C4和C5亞型，而C4亞型又細(xì)分為Wa和C4b亞群。EV71基因組為長(zhǎng)度約7. 5nts 的單股正鏈RNA，病毒在復(fù)制過(guò)程中不經(jīng)歷DNA中間體，而常規(guī)基因工程操作技術(shù)都是在 DNA分子水平上進(jìn)行操作的，對(duì)EV71的分子病毒學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究因此受到限制。本發(fā)明是利用EV71病毒的全長(zhǎng)cDNA為模板，體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄出感染性的RNA分子，以拯救出RNA 病毒。感染性克隆是將病毒DNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，借助載體構(gòu)建病毒的全長(zhǎng)cDNA分子克隆， 同時(shí)將RNA聚合酶的啟動(dòng)子調(diào)控元件也導(dǎo)入該分子克隆中，由含病毒基因組cDNA的質(zhì)粒獲取RNA病毒的一項(xiàng)技術(shù)。由于最終獲取的RNA病毒來(lái)源于cDNA克隆，通過(guò)人為加入的DNA 環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了在DNA水平上對(duì)RNA病毒基因組進(jìn)行各種修飾或改造，然后通過(guò)拯救病毒的表型變化來(lái)判定這些基因操作的效果，從而為篩選無(wú)神經(jīng)毒或低神經(jīng)毒的EV71基因工程疫苗毒株提供條件，同時(shí)也可為研究RNA病毒的致病機(jī)制、致弱機(jī)理提供便利。本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)1)根據(jù)通過(guò)分子克隆技術(shù)獲得的EV71全基因組序列，所設(shè)計(jì)的特異性引物可擴(kuò)增覆蓋整個(gè)基因組；2)本發(fā)明以EV71病毒的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)，利用帶修飾的特異性引物分別擴(kuò)增覆蓋基因組的3個(gè)片段，獲得的三個(gè)片段的cDNA兩端分別含有不同的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，純化回收后，可分別與克隆載體連接，建立亞克??；3)為了利用單一限制性酶切位點(diǎn)連接病毒全長(zhǎng)基因，本發(fā)明采用沉默突變，在所述基因組第4240位人為引入^CbaI位點(diǎn)，同時(shí)這一位點(diǎn)也可作為區(qū)別于親本毒的分子標(biāo)記；利用雙酶切方法將三個(gè)片段的cDNA依次定向克隆至改造的pcDNA3. 1(+)載體，構(gòu)建了含EV71基因組全長(zhǎng)cDNA分子克隆的重組質(zhì)粒pPev3. 1(+)。以非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero) 為受體細(xì)胞，獲得所需感染性克隆。上述構(gòu)建過(guò)程中，用RT-PCR方法分三個(gè)片段擴(kuò)增EV71的全長(zhǎng)cDNA時(shí)，在基因組非編碼區(qū)前引入了聚合酶I和聚合酶II雙啟動(dòng)子的核心序列，為了利用單一酶切位點(diǎn)連
接病毒全長(zhǎng)基因，采用沉默突變的方法，在不改變編碼氨基酸的前提下通過(guò)擴(kuò)增引物將鳥(niǎo)嘌呤((^424tl)變成胸腺嘧啶(T)從而引入)(bai酶切位點(diǎn)，并可以作為區(qū)別于親本毒的遺傳標(biāo)記；5)本發(fā)明構(gòu)建EV71全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的方法分三個(gè)片段擴(kuò)增病毒的基因組，所擴(kuò)增的片段相對(duì)較短，且采用適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增、性能優(yōu)良的聚合酶I^emix υΓ ^ Version 2. 0 (TaKaRa公司)進(jìn)行擴(kuò)增，使用時(shí)只需在制品溶液中加入模板和引物便可進(jìn)行 PCR反應(yīng)，大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，減少了 PCR操作過(guò)程中的污染。從而能夠更好的保證所擴(kuò)
4增片段序列的保真性，病毒基因組位于含聚合酶I和聚合酶II雙啟動(dòng)子真核質(zhì)粒的下游， 末端具有終止轉(zhuǎn)錄翻譯的終止子和限制性內(nèi)切酶NotI位點(diǎn)，能夠保證感染性克隆在受體細(xì)胞內(nèi)包裝出高豐度高質(zhì)量的病毒粒子，因此用本發(fā)明方法所構(gòu)建EV71的感染性克隆高效穩(wěn)定，由該拯救系統(tǒng)所拯救的EV71在宿主細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性、致病性與親本毒具有較高的一致性。6)本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，成功率高，難度較小，可成功構(gòu)建我國(guó)大陸EV71流行毒株的感染性cDNA分子克隆。


圖1是表示覆蓋基因組的3個(gè)cDNA片段，在圖1中，1 :L1片段擴(kuò)增產(chǎn)物；2 12片段擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :L3片段擴(kuò)增產(chǎn)物；M :500-12000bp的DNA marker。；圖2是表示構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA的技術(shù)流程圖；圖3是含病毒全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒的鑒定；圖4沉默突變引入的^CbaI位點(diǎn)的分子標(biāo)簽序列；圖5在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生的細(xì)胞病變圖；圖6感染Vero細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，這一實(shí)施例所用的EV71病毒毒株系2010年分離自蘭州市臨床診斷手口足病患兒的糞便，并經(jīng)人腸道通用病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus types A 16，CA16)和腸道病毒EV71型RT-PCR特異性核酸檢測(cè)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR平行檢測(cè)后得到的陽(yáng)性標(biāo)本，命名為EV71LanzhoU/01，分子流行病學(xué)基因分型為Wa型，EV71 Lanzhou/01毒株保藏于蘭州生物制品研究所，凍存于-70°C。本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于本實(shí)施例。實(shí)施例1. EV71病毒基因組的獲得。根據(jù)對(duì)EV71病毒的分子生物學(xué)研究，參考GenBank (GenBank登錄號(hào)⑶396280) 公開(kāi)的相關(guān)序列，通過(guò)比較分析后，設(shè)計(jì)出帶修飾擴(kuò)增覆蓋全基因組的三對(duì)特異性引物L(fēng)l 上、下游引物，L2上、下游引物和L3上、下游引物，這三段特異性引物分別是Ll上游引物atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctata gtcLl 下游弓丨物RaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaagL2 上游弓丨物ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagatL2 下游弓丨物:tttgagatctgattctctagaagtggcagctgtL3 上游弓丨物:tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaatL3 下游引物ttttctaga￡cggccgct38 ；在以上的特異引物中，擴(kuò)增Ll片段所用上游引物L(fēng)l中加入I^cI酶切位點(diǎn)和含聚合酶I、聚合酶II雙啟動(dòng)子，以保證在轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生高豐度高質(zhì)量的RNA，其下游引物L(fēng)f含 HindIII酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增L2片段所用上游引物L(fēng)2含HindIII酶切位點(diǎn)，其下游引物L(fēng)2—和擴(kuò)增L3片段的上游引物L(fēng)3中引入點(diǎn)突變，擴(kuò)增后將基因組第4240位的G突變?yōu)門(mén)，突變后密碼子CTT與突變前密碼子CTG均編碼亮氨酸，為同義突變，獲得的序列tctaga為限制件內(nèi)切酶^CbaI的識(shí)別序列，能夠用于基因組全長(zhǎng)cDNA的拼接，同時(shí)也作為區(qū)別于親本毒的遺傳標(biāo)記；擴(kuò)增L3片段所用下游引物L(fēng)3、含NotI酶切位點(diǎn)和38nt的poly (A)。從臨床診斷手口足病患兒的糞便中得到的EV71病毒毒株中得到RNA，以其為模板，用上述特異性引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，得到基因組的Li、L2和L3三個(gè)片段，大小分別為 1448bp,2906bp和3197bp (圖1)，與預(yù)期大小相符。以上述EV71病毒RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，分別以Ll上、下游引物，L2上、下游引物，L3上、下游引物為擴(kuò)增引物，使用適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增、性能優(yōu)良的I^emix LATaq Version 2. O (TaKaRa公司)DNA聚合酶擴(kuò)增出上述Li、L2和L3三個(gè)片段。按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)構(gòu)建50 μ L反應(yīng)體系，三個(gè)片段的擴(kuò)增條件分別為片段 Ll :94°C 5min，94°C 30s, 57°C 30s, 68°C lmin30s, go to 2，72°C 8min ；片段 L2 94°C5min，94°C30s，57°C30s，68°C3min，go to 2，72°C8min ；片段L3 :94°C 5min，94°C 30s， 57°C 30s, 68°C 3min20s，go to 2，72°C 8min ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳核實(shí)后進(jìn)行純化回收，獲得上述三個(gè)片段的DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示。將上述Li，L2和L3三段分別進(jìn)行切膠回收，分別與pMD20_T Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞以及陽(yáng)性克隆篩選等本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，將篩選出的三個(gè)片段的陽(yáng)性克隆pMD-Ll、pMD-L2和pMD_L3送交測(cè)序，測(cè)序獲得的三個(gè)片段再通過(guò)相應(yīng)的軟件進(jìn)行拼接， 最終獲得EV71病毒Lanzhou/10株的基因組。EV71病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建。將pcDNA3. 1 (+)載體與前述得到的Ll片段分別用I^cl/Hindlll雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化至JM109，測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，獲得含Ll片段的亞克隆質(zhì)粒pPLl ；將pPLl與實(shí)例1得到的L2片段分別用HindIIIAbaI雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化至JM109，測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，獲得含Ll和L2片段的亞克隆質(zhì)粒pPL12 ；將pPL12與實(shí)例1得到的L3片段分別用Xbal/NotI 雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化至JM109，測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，獲得含L1、L2和L3片段的全基因組cDNA 克隆的重組質(zhì)粒pPev3. 1 (+)，參見(jiàn)圖2所示。將上述所構(gòu)建全基因組(^嫩克隆的重組質(zhì)粒？ 撲3.1(+)各201^分別用)0^1和 PstI進(jìn)行酶切鑒定，37°C 2. 5h，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，用I^stI酶切后產(chǎn)生4個(gè)片段分別為4672bp、^87bp、2753bp和1889bp ；用XbaI酶切后產(chǎn)生一個(gè)片段大小為13601bp，表明重組質(zhì)粒含有第4240位突變形成的^CbaI酶切位點(diǎn)，酶切鑒定結(jié)果表明，酶切所得的片段與預(yù)期結(jié)果一致，對(duì)其進(jìn)行測(cè)全序。在圖3中，1 重組質(zhì)粒pPev3. 1 (+) XbaI 酶切產(chǎn)物；2 重組質(zhì)粒 pPev3. 1 (+)PstI 酶切產(chǎn)物；3 :500-12000bp 的 DNA marker。初步證明成功克隆到了 EV71基因組的全長(zhǎng)cDNA。本實(shí)施例中所涉及的雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化等步驟，均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。病毒拯救和鑒定用 Promega 公司生產(chǎn)的 Wizard SV Genomic DNA Purification System 制備純化由實(shí)例2得到的含全基因組cDNA的重組質(zhì)粒pPev3. 1⑴。待Vero單層生長(zhǎng)至80% 90%滿時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)各取MyL重組質(zhì)粒pPev3. 1(+)和30 μ L Lipofectamine 2000 (Invitrogen)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。同時(shí)設(shè)立脂質(zhì)體對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照。轉(zhuǎn)染后4- 吸去細(xì)胞上清，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置
6370C CO2繼續(xù)培養(yǎng)5d后收獲病毒，反復(fù)凍融3次后連續(xù)在Vero上傳代，待第二代72h出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變(CPE)(如圖5所示)。在圖5中，A 拯救病毒感染Vero細(xì)胞出現(xiàn)的CPE 的圖片；B 正常對(duì)照細(xì)胞圖片。對(duì)收獲的病毒分別用RT-PCR、分子標(biāo)簽測(cè)序、間接免疫熒光等進(jìn)行鑒定(如圖4，6所示)，均證實(shí)成功拯救到了 EV71 Lanzhou/01株病毒。圖4為沉默突變引入的)(bal位點(diǎn)的分子標(biāo)簽序列(下劃線部分為^CbaI位點(diǎn)序列，黑三角為相應(yīng)的突變位點(diǎn))；在圖6中，A 為拯救病毒感染Vero細(xì)胞的免疫熒光圖片；B 為正常對(duì)照細(xì)胞的免疫熒光圖片。本實(shí)施例中所涉及的RT-PCR、間接免疫熒光等步驟，均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。 由上步驟所得到的EV7 Lanzhou/01感染克隆毒株全基因序列見(jiàn)SEQ ID8，而用引物L(fēng)2/L2—擴(kuò)增的產(chǎn)物L(fēng)2的序列見(jiàn)SEQ ID7。
權(quán)利要求
1.腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征是a.以從EV17病毒毒株提取的RNA為模板，用下述三對(duì)引物分別擴(kuò)增出L1、L2和L3三個(gè)片段，所用的三對(duì)引物為L(zhǎng)l上游引物atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcLl 下游弓I物:gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaagL2 上游弓丨物ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagatL2 下游弓I物:tttgagatctgattctctagaagtggcagctgtL3 上游弓I物:tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaatL3 下游引物ttttctaga￡c￡gcc￡ct38 ；b.將Ll片段經(jīng)酶切后與真核表達(dá)載體連接，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得亞克隆質(zhì)粒 PLl，再將經(jīng)PLl質(zhì)粒與L2片段經(jīng)酶切后連接轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒PL2，再將質(zhì)粒PL2與L3片段經(jīng)酶切后連接轉(zhuǎn)化，獲得含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒；c.將b所得到的含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至非洲綠猴腎細(xì)胞宿主細(xì)胞，得到EV711型感染性克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于所用真核表達(dá)載體為pcDNA3. 1 (+)，所用的大腸桿菌為JM109 ；所得到的三個(gè)亞克隆質(zhì)粒分別是pPLl 質(zhì)粒、PPL2質(zhì)粒和pPL3質(zhì)粒；所得到的含L1、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒為pPev3. 1(+)重組質(zhì)粒。
3.由權(quán)利要求2所得到的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒為pPev3.1 (+)重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種腸道病毒71型感染性克隆及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法是從EV17病毒毒株提取的RNA為模板，用下述三對(duì)引物分別擴(kuò)增出L1、L2和L3三個(gè)片段；再將L1片段經(jīng)酶切后與真核表達(dá)載體連接，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得亞克隆質(zhì)粒PL1，再將經(jīng)PL1質(zhì)粒與L2片段經(jīng)酶切后連接轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒PL2，再將質(zhì)粒PL2與L3片段經(jīng)酶切后連接轉(zhuǎn)化，獲得含L1、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質(zhì)粒；再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至非洲綠猴腎細(xì)胞宿主細(xì)胞，得到EV711型感染性克隆。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102212554SQ20111008225
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月24日
發(fā)明者劉湘濤, 曹偉軍, 李建強(qiáng), 楊帆, 王玉琳, 鄭海學(xué) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所