乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克隆質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克隆質(zhì)粒，包含乙型腦炎病毒弱毒株10S3的全長基因組cDNA序列，或乙型腦炎病毒弱毒株10S3的全長基因組cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo)記性酶切位點的全長cDNA序列。本發(fā)明還公開了一種乙型腦炎病毒感染性克隆弱毒株，該弱毒株是乙型腦炎病毒弱毒株10S3的克隆毒株，所述弱毒株10S3的全長基因cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明的乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克隆質(zhì)粒，在細(xì)胞上拯救出的乙型腦炎病毒感染性克隆弱毒株，在免疫動物后能對動物抵抗乙型腦炎病毒提供完全的免疫保護(hù)，非常有利于乙型腦炎病毒的預(yù)防和控制。
【專利說明】乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克隆質(zhì)粒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克 隆質(zhì)粒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 乙型腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV)是一種重要的人畜共患病 病原，屬黃病毒科黃病毒屬（Flavivirus)，該屬重要成員還包括黃熱病毒（Yellow Fever Virus, YFV)、登革病毒（Dengue Virus, DENV)和西尼羅河病毒（West nile virus, WNV)等。 JEV基因組是一單股正義RNA，有5'帽、無3'多聚腺苷尾，全長約llkb。基因組編碼單一 長開放閱讀框，兩側(cè)是5'非編碼區(qū)（5' -untranslated region, 5' -UTR)和3'非編碼區(qū) (3' -UTR)。單個長開放閱讀框翻譯產(chǎn)生一個多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯中或翻譯后裂解成 10個蛋白。N端占多聚蛋白長度四分之一的序列編碼結(jié)構(gòu)蛋白（C-prM-E)，其余部分是非結(jié) 構(gòu)蛋白（NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)。依據(jù)E蛋白基因序列，可將JEV分成五個基 因型（genotype)。
[0003] JEV由蚊傳播，可感染人和馬、豬、野生水禽等多種動物。感染人和馬，主要呈現(xiàn)腦 炎神經(jīng)癥狀。人感染發(fā)病后，死亡率可高達(dá)20%，而幸存者大多留有腦炎后遺癥，危害甚重。 而豬只不分大小均可感染該病毒，臨床可表現(xiàn)出新生仔豬腦炎和種豬繁殖障礙，如流產(chǎn)、死 胎和睪丸炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。其它動物則表現(xiàn)為隱性感染。豬在JEV循環(huán)傳 播中也起重要作用，豬不僅是中間宿主，還是JEV傳播的擴增器。豬感染JEV后，病毒血癥 持續(xù)的時間長，病毒滴度高，吸食豬血的蚊都可被感染成為帶毒蚊，從而擴大蚊對JEV的傳 播。因此，必須加強對豬群中JEV的防治工作。
[0004] 我國是JEV的主要流行地區(qū)，目前除青海未報道外，其他各省市均存在JEV流行， 每年JE病例在數(shù)千例以上。分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，1978年前我國流行的JEV均屬基因 III 型（Genotype III，GIII)，但 1978 年出現(xiàn)首株基因 I (Genotype I，GI)，在隨后的 20 年 間我國處于GI和GIII共流行的態(tài)勢。近年來，我國從腦炎患者、豬、蚊體內(nèi)分離出多株GI， GI JEV流行呈上升趨勢。疫苗接種是預(yù)防JE的有效途徑。目前，我國普遍給兒童接種JEV 疫苗株SA14-14-2,而豬用JEV疫苗株也為SA14-14-2。SA14-14-2是由SA14株致弱而來， 同屬GIII。研究顯示，GIII疫苗誘導(dǎo)抗體，對GI JEV僅具有部分中和能力。因此，需要開 發(fā)新的獸用疫苗，來預(yù)防豬群中JEV的流行。
[0005] 自上世紀(jì)八十年代以來，病毒感染性克隆技術(shù)的興起和發(fā)展極大地促進(jìn)了病毒的 研究。由于感染性克隆技術(shù)可以直接操作病毒基因組序列，可以根據(jù)研究者的目的改變病 毒的遺傳序列，已逐漸成為研究病毒基因組復(fù)制與表達(dá)、病毒蛋白的功能、病毒與宿主間的 相互作用、構(gòu)建新型病毒載體和研制新型疫苗的重要平臺。但在利用感染性克隆技術(shù)研究 JEV過程中，存在一大障礙就是JEV基因組cDNA克隆在宿主菌中不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生核苷酸缺 失、插入等突變現(xiàn)象，導(dǎo)致病毒的感染性克隆難以建立。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決目前預(yù)防乙型腦炎的GIII疫苗誘導(dǎo)的抗體對GI型JEV僅具有部分 中和能力，急需開發(fā)新的乙腦獸用疫苗的技術(shù)問題，提供一種乙型腦炎病毒弱毒株重組感 染性克隆質(zhì)粒，通過該重組感染性克隆質(zhì)粒拯救出的感染性JEV病毒，在免疫小鼠后可使 小鼠抵抗乙型腦炎病毒GI株的攻擊，為動物提供完全的免疫保護(hù)，適于開發(fā)成乙型腦炎病 毒感染性克隆弱毒疫苗株。
[0007] 此外，還需要提供一種上述乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克隆質(zhì)粒的應(yīng)用。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 在本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組質(zhì)粒，包含：乙型腦炎病毒弱毒株10S3的 全長基因 cDNA序列，該弱毒株10S3的全長基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 在本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組質(zhì)粒，包含：乙型腦炎病毒弱毒株10S3的 全長基因 cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo)記性酶切位點的全長cDNA序列，該弱毒株10S3的全長基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 優(yōu)選的，所述弱毒株10S3的全長基因 cDNA序列內(nèi)部引入的標(biāo)記性酶切位點是通 過定點突變將該弱毒株10S3的全長基因第9291位堿基C突變成G而引入的SacII酶切位 點。
[0012] 優(yōu)選的，所述全長基因 cDNA序列5'末端還加設(shè)有T7啟動子；所述全長基因 cDNA 序列3'末端還加設(shè)有丁型肝炎病毒核酶序列（HDVr序列)。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種感染性克隆弱毒株，所述感染性克隆弱毒株是 通過將上述重組質(zhì)粒線性化，再將該線性化的全長CDNA體外轉(zhuǎn)錄成RNA后轉(zhuǎn)染細(xì)胞而獲得 的感染性乙型腦炎病毒。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種乙型腦炎病毒弱毒株，所述乙型腦炎病毒弱 毒株的全長基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述感染性克隆弱毒株在制備預(yù)防乙型腦炎 的疫苗中的應(yīng)用。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述乙型腦炎病毒弱毒株在制備預(yù)防乙型腦 炎的疫苗中的應(yīng)用。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述感染性克隆弱毒株在制備區(qū)分乙型腦炎 疫苗免疫毒株與自然感染毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分乙型腦炎的感染性克隆疫苗株與自然感 染毒株的檢測試劑盒，包含：針對引入的標(biāo)記性酶切位點設(shè)計的特異性引物、標(biāo)記性的限制 性內(nèi)切酶。
[0019] 利用針對引入的標(biāo)記性酶切位點設(shè)計合成的特異性引物，通過RT-PCR及進(jìn)一步 的限制性酶切，可以有效區(qū)分出乙型腦炎的感染性克隆疫苗株與自然感染毒株。
[0020] 優(yōu)選的，針對引入的位于病毒基因組9287-9292位核苷酸的SacII酶切位點設(shè)計 特異性引物。
[0021] 本發(fā)明乙型腦炎病毒弱毒株重組感染性克隆質(zhì)粒，在細(xì)胞上拯救出的乙型腦炎病 毒感染性克隆弱毒株，不僅在免疫動物后能對動物抵抗乙型腦炎病毒提供完全的免疫保 護(hù)，而且能有效區(qū)分乙型腦炎疫苗免疫動物與乙型腦炎病毒自然感染動物，滿足臨床上對 乙型腦炎病毒疫苗免疫毒株與自然感染毒株的鑒別診斷，非常有利于乙型腦炎病毒的預(yù)防 和控制，應(yīng)用前景十分廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0023] 圖1是本發(fā)明實施例2的10S3弱毒株全基因組擴增結(jié)果圖；
[0024] 圖2是本發(fā)明實施例3加 T7啟動子序列的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；
[0025] 圖3是本發(fā)明實施例3加 HDVr序列的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；
[0026] 圖4是本發(fā)明實施例3全長克隆pAHEN構(gòu)建示意圖；
[0027] 圖5是本發(fā)明實施例3轉(zhuǎn)錄本RNA電泳圖；
[0028] 圖6是本發(fā)明實施例3的10S3全長感染性克隆線性化轉(zhuǎn)錄后在BHK-21細(xì)胞上轉(zhuǎn) 染及傳代結(jié)果圖；
[0029] 圖7是本發(fā)明實施例3的JEV NS3單抗的間接免疫熒光鑒定結(jié)果圖；
[0030] 圖8是本發(fā)明實施例3引物PJEF8791/PJER10965的PCR擴增結(jié)果圖；
[0031] 圖9是本發(fā)明實施例3的SacII酶切結(jié)果圖；
[0032] 圖10是本發(fā)明實施例4的vAHEN和10S3的一步生長曲線比較圖；
[0033] 圖11是本發(fā)明實施例4的vAHEN和10S3的空斑試驗結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0034] 下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京： 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。
[0035] 本發(fā)明將豬源JEV GI野毒株HEN0701在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代，并經(jīng)過純化和 篩選獲得一株弱毒株10S3株。克隆并測定了弱毒株10S3的全基因組（SEQ ID N0. 1)，發(fā)現(xiàn) 其與野毒株存在19處核苷酸變異。然后，本發(fā)明利用反向遺傳操作技術(shù)，采用分段克隆逐 一拼接的策略在PBR322載體中構(gòu)建了弱毒株10S3的全長克隆pAHEN，通過定點突變方法， pAHEN在病毒基因組9291處攜帶有SacII遺傳標(biāo)記。pAHEN線性化后體外轉(zhuǎn)錄出RNA，RNA 轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，拯救出病毒vAHEN。vAHEN能與JEN NS3特異性單抗結(jié)合，通過檢測也發(fā) 現(xiàn)vAHEN攜帶有SacII遺傳標(biāo)記，該引入的SacII遺傳標(biāo)記在自然流行毒株的基因組中并 不存在，它是本發(fā)明人工構(gòu)建的感染性克隆毒株的特有標(biāo)志，而且本發(fā)明的構(gòu)建既不影響 病毒復(fù)制和免疫保護(hù)效果，又可以用來區(qū)分乙型腦炎感染性克隆弱毒株與自然感染毒株。
[0036] 本發(fā)明拯救出的乙型腦炎感染性克隆弱毒株vAHEN，通過一步生長曲線和空斑試 驗，顯示vAHEN與10S3體外生長特征相似。vAHEN通過顱內(nèi)和皮下接種，均不致死小鼠，呈 現(xiàn)弱毒特征。vAHEN接種小鼠，能保護(hù)抵抗HEN0701攻擊。本發(fā)明成功構(gòu)建出的JEV弱毒株 的感染性克隆pAHEN，為利用反向遺傳學(xué)研究JEV、開發(fā)新型感染性克隆弱毒疫苗和構(gòu)建新 型病毒載體等都具有重要意義。
[0037] 下面通過實施例，具體闡述本發(fā)明。
[0038] 在本發(fā)明的下述實施例中，使用的實驗材料如下：
[0039] 病毒和細(xì)胞：BHK-21細(xì)胞（美國細(xì)胞保藏中心ATCC，保藏號為：CCL-10)，乙型腦 炎病毒HEN0701株（本實驗室保存；發(fā)表文章見：鄭浩，張建武，袁世山.豬源乙型腦炎病 毒的分離鑒定及其E基因分析.中國獸醫(yī)科學(xué)，2009, 39(6) :476-481)。
[0040] 質(zhì)粒與菌株：pBR322,購自 Promega ;pCR_Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0 購自 Invitrogen 公司； T0P10感受態(tài)購自北京天根。
[0041] 其他試劑：MEM，GIBC0公司產(chǎn)品；吣《、5&(：1、乂11〇1、乂11^1和了40嫩連接酶，冊8公司 產(chǎn)品；SuperScriptP? PII Reverse Transcriptase購自 Invitrogen公司；DNA片段小量快 速回收試劑盒，北京博大泰克生物基因技術(shù)公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit和QIApr印 Spin miniprep Kit，QIAGEN 公司產(chǎn)品。
[0042] 在本發(fā)明的實施例中，BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下：
[0043] BHK-21細(xì)胞在含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁長滿單層后， 棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，并以PBS洗一次，以0. 25%的胰酶將細(xì)胞消化下，加入新的含有 10%FBS的MEM培養(yǎng)基，以1:8的比例分種于細(xì)胞瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。
[0044] 實施例1乙型腦炎病毒（JEV) HEN0701傳代致弱株的篩選
[0045] 將JEV GI株HEN0701在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代100代，并以空斑連續(xù)純化10次， 挑選6個克隆毒通過皮下和頡內(nèi)接種小鼠，篩選弱毒株。具體過程如下：
[0046] 1. 1病毒傳代
[0047] 將35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長成融合單層的BHK-21細(xì)胞，以lmL PBS洗一次，將 HEN0701株接種BHK-21細(xì)胞。37°C孵育lh后，以lmL PBS洗一次，每平皿加入2. 5mL含 2%FBS的MEM維持培養(yǎng)液，置于37 °C含5%C02的培養(yǎng)箱。接種HEN0701的平皿中BHK-21 細(xì)胞病變達(dá)70-80%時，收獲細(xì)胞上清，分裝于1. 5mL離心管，凍存于-70°C，該批病毒稱之 為HEN0701P1。按上述方法，將HEN0701P1以原液0. 3mL接種BHK-21細(xì)胞，收獲病毒稱為 HEN0701P2。將HEN0701P2接種BHK-21細(xì)胞，收獲HEN0701P3。如此，將病毒在BHK-21細(xì)胞 上傳代至HEN0701P100。
[0048] 1. 2病毒的空斑純化
[0049] 以DMEM將HEN0701P100以1:10稀釋至ΚΓ5和ΚΓ6。生長于60mm平皿中的融合單 層BHK-21細(xì)胞，以PBS洗兩次，將10_ 5和10_6的病毒稀釋液分別以lmL接種一平皿。37°C 孵育lh后，每平皿以3mL DMEM洗二次，加入12mL含1%低熔點瓊脂糖和2%FBS的覆蓋培養(yǎng) 基。于37°C、5%C02中培養(yǎng)4d，挑起單個病毒空斑置入0. 3mL DMEM中，凍存于-75°C。以上 述方法，挑取6個空斑連續(xù)純化10輪，獲得6株克隆毒，分別稱之為：8S1、8S2、9S1、10S1、 10S2 和 10S3。
[0050] 1.3對小鼠的致病力
[0051] 以DMEM培養(yǎng)液將6株克隆毒和HEN0701P1作適當(dāng)稀釋，并添加青霉素-鏈霉素 至100IU/mL，分別以腦內(nèi)和皮下兩種方式接種3w小鼠。傳代克隆毒株，分別以0. 05mL (含 106pfu)腦內(nèi)接種和0· lmL(含2X106pfu)皮下接種小鼠，各7只；HEN0701以103pfu腦內(nèi) 接種和2 X 104pfu皮下接種小鼠，各7只；同時以DMEM0. 05mL腦內(nèi)接種和0. lmL皮下接種7 只小鼠作對照。皮下接種小鼠，接種前以接種針穿刺腦膜。接種后觀察2w。6株克隆株皮 下接種，小鼠全部存活，無傷殘。通過腦內(nèi)接種，8S2和10S3組全部存活，且無傷殘；9S1組 7只均存活，但其中一只后腿癱瘓；10S1組6只存活，1只死亡，無傷殘；10S2組5只存活，2 只死亡，存活小鼠中有一只后腿癱瘓；8S1組7只小鼠全部死亡。HEN0701株通過腦內(nèi)和皮 下接種小鼠，3d后開始出現(xiàn)死亡，至lid全部死亡。對照組小鼠腦內(nèi)和皮下接種，均存活。 以上結(jié)果顯示，經(jīng)過細(xì)胞傳代和純化，6株克隆株都喪失了對3周小鼠的腦外毒力，但僅有 8S2和10S3喪失了對3周小鼠的腦內(nèi)毒力，而8S1、9S1、10S1和10S2保留有腦內(nèi)毒力。
[0052] 為了進(jìn)一步比較8S2和10S3的毒力，以0. lmL病毒液（含2 X 106pfu)腹部皮下 接種8只7d乳鼠，將同窩剩余的3-4只乳鼠接種0. lmL DMEM作對照，接種前以接種針穿刺 腦膜。接種后3w，8S2組5只存活，3只死亡；10S3組8只均存活。這表明，10S3比8S2毒 力要弱。
[0053] 實施例210S3全基因組的克隆
[0054] 根據(jù)Genbank中登錄號為FJ495189的JEV HEN0701株全基因組序列，設(shè)計合成4 對引物，分別作為RT和PCR引物。從JEV致弱株10S3感染上清中提取病毒基因組RNA，反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其作為PCR模板，利用4對引物進(jìn)行PCR擴增，獲得4個cDNA片段，將4 個cDNA片段分別克隆入pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0載體中，挑選陽性克隆并測定克隆cDNA序列。 利用DNAStar中的SeqMan軟件，將測得序列進(jìn)行拼接，獲得全長病毒基因組序列。并用 DNAStar中的MegAlign軟件將測得的10S3基因組序列與HEN0701進(jìn)行比對分析。具體過 程如下：
[0055] 2. 1引物設(shè)計
[0056] 根據(jù)Genbank中登錄號為FJ495189的JEV HEN0701株全基因組序列，設(shè)計合 成 4 對引物，分別命名為：PJEF1/PJER2913、PJEF2371/PJER5675、PJEF5455/PJER9204、 PJEF8791/PJER10965。具體引物序列見下表1 :
[0057] 表110S3全基因組cDNA片段擴增引物
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組質(zhì)粒，其特征在于，包含：乙型腦炎病毒弱毒株10S3的全長基因 cDNA序 列，該弱毒株10S3的全長基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種重組質(zhì)粒，其特征在于，包含：乙型腦炎病毒弱毒株10S3的全長基因 cDNA序列 內(nèi)部引入標(biāo)記性酶切位點的全長cDNA序列，該弱毒株10S3的全長基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述弱毒株10S3的全長基因 cDNA序 列內(nèi)部引入的標(biāo)記性酶切位點是通過定點突變將該弱毒株10S3的全長基因第9291位堿基 C突變成G而引入的SacII酶切位點。
4. 一種感染性克隆弱毒株，其特征在于，所述感染性克隆弱毒株是通過將權(quán)利要求1 所述重組質(zhì)粒線性化，再將該線性化的全長cDNA體外轉(zhuǎn)錄成RNA后轉(zhuǎn)染細(xì)胞而獲得的感染 性乙型腦炎病毒。
5. -種感染性克隆弱毒株，其特征在于，所述感染性克隆弱毒株是通過將權(quán)利要求2 所述重組質(zhì)粒線性化，再將該線性化的全長cDNA體外轉(zhuǎn)錄成RNA后轉(zhuǎn)染細(xì)胞而獲得的感染 性乙型腦炎病毒。
6. -種乙型腦炎病毒弱毒株，其特征在于，所述乙型腦炎病毒弱毒株的全長基因 cDNA 序列如SEQ ID NO. 1所示。
7. 權(quán)利要求4或5所述的感染性克隆弱毒株在制備預(yù)防乙型腦炎的疫苗中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求6所述的乙型腦炎病毒弱毒株在制備預(yù)防乙型腦炎的疫苗中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求5所述的感染性克隆弱毒株在制備區(qū)分乙型腦炎感染性克隆弱毒株與自 然感染毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10. -種區(qū)分乙型腦炎的感染性克隆弱毒株與自然感染毒株的檢測試劑盒，其特征在 于，包含：針對引入的標(biāo)記性酶切位點設(shè)計的特異性引物、標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶。
【文檔編號】C12N15/63GK104152476SQ201310355065
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】鄭浩, 童光志, 鄭旭晨, 童武, 馬志永, 郭亦非 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所