專利名稱：一種用于呼吸道病毒監(jiān)測的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于呼吸道病毒監(jiān)測的基因芯片。用于病人標(biāo)本以及環(huán)境空氣中呼吸道傳播病毒的監(jiān)控，其建立的平臺技術(shù)也可用于涉及國家安全的反生物恐怖領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因芯片(gene chip)也叫DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray)、寡核苷酸陣列(oligonucleotide array)，是指采用原位合成(in situ synthesis)或顯微打印手段，將數(shù)以萬計的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫(yī)學(xué)診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為基因芯片技術(shù)?；蛐酒瑱z測技術(shù)的原理是基于核酸堿基配對的原則，類似于DNA的Southern Blot和RNA的Northern Blot，但是同時基因芯片檢測技術(shù)又結(jié)合了類似電子芯片的集成原理，通常在1平方厘米的支持物上可以結(jié)合成千上萬個探針，因此基因芯片技術(shù)實現(xiàn)了同時可以檢測成千上萬個信號，實現(xiàn)了一種任何其它技術(shù)所無法比擬的優(yōu)勢?；蛐酒夹g(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于以下各個方面1，序列測定2，細(xì)胞或組織基因表達(dá)譜分析3，新藥的篩選4，腫瘤及各種傳染病的診斷呼吸道病毒習(xí)慣上是指一群能侵犯呼吸道的病毒，并不是分類學(xué)上的名稱。據(jù)統(tǒng)計，急性呼吸道感染中90％-95％是病毒所致，其中許多病毒具有感染力強，傳播快，潛伏期短，發(fā)病急，病后免疫力不能持久等特點，其危害對人群是極其巨大的，其氣溶膠形式的傳播是人們防不勝防，迫切需要對呼吸道病毒進(jìn)行監(jiān)測。但是由于引起呼吸道感染的病毒種類繁多，就目前已知的就有幾十種，包括正粘病毒的流感病毒各型及各個亞型；副粘病毒科的副流感病毒I-IV型，呼吸道合胞病毒，仙臺病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人偏肺病毒；披膜病毒科的風(fēng)疹病毒；冠狀病毒科人冠狀病毒229E，人冠狀病毒OC43，人SARS病毒；小RNA病毒科鼻病毒，人柯薩奇病毒，人ECHO病毒；腺病毒科腺病毒各型以及皰疹病毒科HHV-6。新的病毒還在不斷出現(xiàn)，例如新近出現(xiàn)的SARS病毒就是一個典型的例子。
目前呼吸道感染病毒的檢測主要有三種方法，一是血清學(xué)檢測方法，二是檢測病毒的核酸，三是病毒的直接培養(yǎng)觀察。但是上述檢測方法還具有極大的局限性，一是一次只能檢測一種單一的病毒，二是檢測方法的特異性和靈敏度還有一定局限性，三是病毒培養(yǎng)的方法耗時，不適合于現(xiàn)場檢測。為了解決以上難題，本專利發(fā)明了一種快速高通量的病毒核酸基因芯片檢測技術(shù)，可以同時對所有的呼吸道感染病毒進(jìn)行大規(guī)模的監(jiān)控，同時可以監(jiān)控新的呼吸道病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前對呼吸道病毒監(jiān)測尚無有特異性的技術(shù)手段，可以在較少標(biāo)本量的情況下同時對多種病毒監(jiān)測。本發(fā)明涉及的內(nèi)容主要包括以下幾個方面1，呼吸道傳播病毒特異性檢測探針數(shù)據(jù)庫的建立。
利用生物信息學(xué)軟件和已經(jīng)發(fā)表的呼吸道病毒基因序列信息，設(shè)計每個病毒的特異性探針，探針長度為40-80bp，其Tm值相差不超過5℃，每個病毒包括一組檢測探針。同時設(shè)計目前與人類疾病相關(guān)的各個病毒科的科特異性檢測探針，用于檢測可能出現(xiàn)的新的病毒。該檢測探針數(shù)據(jù)庫包括42種病毒共計352條探針，相關(guān)檢測探針的資料可以向北京金迪克生物技術(shù)研究所索取，或向?qū)＠?lián)系人索取。
2，基因芯片的制備基因芯片的制作主要包括1、合成探針利用DNA合成儀合成。
2、探針處理5’端進(jìn)行氨基修飾，使其固化在醛基修飾的玻璃片基上。
3、芯片制備使用點樣儀在玻璃片基上按設(shè)計好的程序點樣。
每個特異性檢測探針在芯片的分布以及各種對照探針由軟件進(jìn)行設(shè)計控制，每個檢測探針在芯片上有4個平行點，每個病毒的一組探針在芯片上有2個平行矩陣，用于減少雜交過程的系統(tǒng)誤差。
2，樣品中病毒核酸的提取及其標(biāo)記建立來自不同的樣品的病毒核酸提取方法，具體使用INVITROGEN公司的TRIZOL提取試劑盒和QIAGEN公司的病毒核酸提取試劑盒，并且對條件進(jìn)行優(yōu)化。
病毒核酸的標(biāo)記主要包括病毒核酸的逆轉(zhuǎn)錄過程和標(biāo)記，具體包括1)第一步PCR在反應(yīng)管中加入5ul模板核酸，2ul10*PCR buffer，dNTP(10mM)0.6ul，primer(100pmol/μl)1ul，dH2O10.4ul，Tag(5U/μl)1μl?；靹?，離心。程序如下94℃ 5min94℃ 1min30℃ 5min0.1℃/s上升到72℃72℃ 3min5 cycles2)第二步PCR BTemplate 5μl10*PCR buffer 5μlPrimer-2(100pmol/μl) 2μldNTP(10mM)22μldH2O 34μlTag(5U/μl) 2μl混勻；離心程序如下94℃ 5min94℃ 1min40℃ 5min50℃ 1min72℃ 1min72℃ 5min30 cycles注摸板為第一步PCR產(chǎn)物3)第三步PCR標(biāo)記Template 5μl10*PCR buffer5μlPrimer-2(100pmol/μl)2μldNTP(10mM) 1μlCy3orCy5-dCTP1μldH2O34μlTag(5U/μl) 2μl混勻；離心。
程序如下94℃ 5min94℃ 1min40℃ 5min50℃ 1min
72℃ 1min72℃ 5min30 cycles注模板為第一步或第二步PCR產(chǎn)物3，基因芯片雜交在雜交艙內(nèi)將標(biāo)記好的樣本和點好探針的芯片雜交，雜交溫度為42℃，時間為6-8小時4，雜交信號的檢測及其分析清洗用0.2％的SDS和dH2O清洗芯片兩次，晾干。
掃描用GenePix 4100A掃描儀掃描芯片。
分析結(jié)果應(yīng)用GenePix 5.0分析信號強度。
本發(fā)明涉及的呼吸道病毒正粘病毒科流感病毒各型及各亞型；副粘病毒科呼吸道合胞病毒，副流感病毒I-IV型；仙臺病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人偏肺病毒；披膜病毒科風(fēng)疹病毒；冠狀病毒科人冠狀病毒229E，人冠狀病毒OC43，人SARS病毒以及各種動物冠狀病毒；小RNA病毒科鼻病毒各血清型，人柯薩奇病毒，人ECHO病毒；腺病毒科腺病毒各型及其各血清型；皰疹病毒科人皰疹病毒6型。還包括現(xiàn)有各個病毒科的科特異性探針，可以用于發(fā)現(xiàn)新的呼吸道病毒。
具體實施例方式
實施方案1標(biāo)本處理及核酸提取1、加入適量的TRIZOL裂解標(biāo)本；2、室溫靜置5min，按每1ml TRIZOL加入0.2ml氯仿，用手劇烈震動15sec，室溫靜置2-3min，12000g離心15min，吸取RNA水相或DNA中間相；3、與異丙醇混合，按每1ml TRIZOL加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10min，4℃ 12000g離心10min；吸取上清，按每1ml TRIZOL加入1ml75％乙醇，振蕩器震蕩，4℃ 12000g離心10min；5、棄上清，干燥，重溶于Rnase-free水配成的0.5％SDS中，55-60℃水浴10min，-70℃ 保存。
6、RNA反轉(zhuǎn)錄1)、Random Primer(100pmol/μl) 1μlRNA 1-2μl(1ng-1μg total RNA)dNTP(10mM) 1μldH2O 8μl混勻；離心；95℃ 10min2)、5*First buffer 4μlRnasin(40μ/μl)1μl混勻；離心；25℃ 10min3)、Superscript II 1μl混勻；離心；42℃ 1hr4)、取5μl電泳檢測；實施方案2標(biāo)記熒光染料1、第一步PCR在反應(yīng)管中加入5ul模板核酸，2ul10*PCR buffer，dNTP(10mM)0.6ul，primer(100pmol/μl)1ul，dH2O10.4ul，Tag(5U/μl)1μl?；靹?，離心。程序如下94℃ 5min
94℃ 1min30℃ 5min0.1℃/s上升到72℃72℃ 3min5 cycles2、第二步PCRTemplate 5μl10*PCR buffer 5μlPrimer-2(100pmol/μl) 2μldNTP(10mM)22μldH2O34μlTag(5U/μl)2μl混勻；離心程序如下94℃ 5min94℃ 1min40℃ 5min50℃ 1min72℃ 1min72℃ 5min30 cycles注摸板為第一步PCR產(chǎn)物3、第三步PCR標(biāo)記Template5μl10*PCR buffer 5μlPrimer-2(100pmol/μl) 2μldNTP(10mM) 1μlCy3orCy5-dCTP 1μldH2O 34μlTag(5U/μl) 2μl混勻；離心。
程序如下94℃ 5min94℃ 1min40℃ 5min50℃ 1min72℃ 1min72℃ 5min30 cycles注模板為第一步或第二步PCR產(chǎn)物實施方案3雜交在雜交艙內(nèi)將標(biāo)記好的樣本和點好探針的芯片雜交，雜交溫度為42℃，時間為6-8小時。
實施方案4清洗用0.2％的SDS和dH2O清洗芯片兩次，晾干。
實施方案5掃描及分析結(jié)果用GenePix 4100A掃描儀掃描芯片。應(yīng)用Genepix Pro 5.0提取數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。
實施方案6臨床標(biāo)本的監(jiān)測結(jié)果對收集于北京宣武醫(yī)院、北京佑安醫(yī)院30例SARS病人臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，病人檢測結(jié)果均為陽性(見附圖
呼吸道病毒監(jiān)測基因芯片)，說明監(jiān)測的結(jié)果是滿意的。
權(quán)利要求
1.一種用于呼吸道病毒監(jiān)測的基因芯片，其中包括多種呼吸道病毒監(jiān)測寡核苷酸探針和對照探針。
2.權(quán)力要求1所述的呼吸道病毒監(jiān)測基因芯片的探針的衍生探針及每種探針的互補探針或變體。
3.權(quán)力要求1所述的呼吸道病毒監(jiān)測基因芯片，其基質(zhì)為玻璃基片或其它相關(guān)片基。
4.權(quán)力要求1所述的呼吸道病毒監(jiān)測基因芯片包括但不限于以下呼吸道病毒正粘病毒科流感病毒各型及各亞型；副粘病毒科呼吸道合胞病毒，副流感病毒I-IV型；仙臺病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人偏肺病毒；披膜病毒科風(fēng)疹病毒；冠狀病毒科人冠狀病毒229E，人冠狀病毒OC43，人SARS病毒以及各種動物冠狀病毒；小RNA病毒科鼻病毒各血清型，人柯薩奇病毒，人ECHO病毒；腺病毒科腺病毒各型及其各血清型；皰疹病毒科人皰疹病毒6型。
5.權(quán)利要求1所述的呼吸道病毒監(jiān)測芯片還包括現(xiàn)有各個病毒科的科特異性探針，可以用于發(fā)現(xiàn)新的呼吸道病毒。
6.權(quán)力要求1所述的呼吸道病毒監(jiān)測基因芯片的制備方法，包括以下步驟
1)利用生物信息學(xué)軟件和已經(jīng)公布的病毒基因信息，設(shè)計各個病毒的特異性檢測探針數(shù)據(jù)庫，檢測性探針的長度為40-80bp；
2)利用化學(xué)修飾的方法對檢測探針進(jìn)行修飾并且利用自動化的芯片點樣儀制備呼吸道病毒監(jiān)測芯片。
7.權(quán)力要求1所述的呼吸道病毒監(jiān)測基因芯片的使用方法包括以下步驟1)將待測標(biāo)本按照不同的方法提取病毒核酸2)標(biāo)記病毒核酸3)將標(biāo)記的核酸同制備好的呼吸道病毒監(jiān)測芯片雜交4)清洗雜交芯片5)利用激光掃描儀進(jìn)行掃描，獲得各個檢測探針的雜交信號6)利用分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
8.呼吸道監(jiān)測芯片可應(yīng)用于但不局限于臨床標(biāo)本，生物制品，環(huán)境空氣的監(jiān)控。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及對病人標(biāo)本，環(huán)境空氣中多種呼吸道病毒同時進(jìn)行監(jiān)測。具體應(yīng)用基因芯片技術(shù)，通過生物學(xué)計算分析設(shè)計保守探針，制備基因檢測芯片，通過雜交，掃描分析建立一套同時對多種呼吸道病毒進(jìn)行靈敏、特異、快速監(jiān)測的技術(shù)平臺。可用于呼吸道病毒在各種生物制品、血液、食品、病人標(biāo)本等的監(jiān)測。同時本發(fā)明涉及的平臺技術(shù)也可用于事關(guān)國家安全和民眾健康的反生物恐怖領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1618983SQ20031011535
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者孫梅生, 舒躍龍, 王征, 侯云德 申請人:北京金迪克生物技術(shù)研究所