專利名稱：一種新的乳腺癌相關蛋白及其特異性多克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤相關蛋白及其特異性多克隆抗體，更特別地，本發(fā)明涉及一種新的乳腺癌相關蛋白及其特異性多克隆抗體。本發(fā)明還涉及所述多克隆抗體的制備方法和用途。
背景技術：
目前我國的乳腺癌總體發(fā)病率在30/10萬以下，約為美國和北歐國家的1/4-1/3。但我國沿海地區(qū)如上海等城市發(fā)病率呈明顯上升趨勢(標化發(fā)病率由1974年的18.3/10萬上升到1997年的46/10萬)。乳腺癌已經(jīng)成為威脅我國女性健康與生命的最常見的惡性腫瘤之一。
研究表明，腫瘤相關的分子標志對腫瘤的診斷和治療起著重要的作用。雌激素受體(ER)和BRCA1等分子的表達，是臨床上應用比較廣泛的乳腺癌分子標志，對乳腺癌早期診斷，治療和預后有著重要的參考價值。但是，由于腫瘤細胞的異質性和發(fā)生機制的復雜性，目前已知的分子標志只能解決部分患者的早期診斷和治療指標的問題，因此尋找新的腫瘤相關蛋白，尤其是腫瘤標志分子，將為臨床早發(fā)現(xiàn)早診斷和早治療提供更多更可靠的靶分子，是腫瘤研究的重要內容。
1998年，M.J.Scanlan等人檢出一個直腸癌相關抗原蛋白片段，命名為SDCCAG16，(Int.J.Cancer 76(5)，652-658，1998)，而該蛋白的基因及其表達蛋白的功能至今沒有文獻報道。生物信息學分析顯示，SDCCAG16基因位于人X染色體(Xq26.1)，cDNA序列全長2509bp，編碼區(qū)長2313bp，編碼771個氨基酸的蛋白，分子量約為85.6KDa。
抗體技術是研究蛋白質功能和臨床檢測中重要的一環(huán)。抗體是機體在抗原刺激下所產(chǎn)生的特異性球蛋白，所以又稱為免疫球蛋白(Ig)。但免疫球蛋白并不都具有抗體活性。人類Ig，根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結構和抗原性的不同，可分為五類，即IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。抗體存在于血清、粘膜分泌液及其他體液中，由遺傳基因決定所產(chǎn)生的抗體稱為天然抗體，而由抗原激發(fā)免疫細胞產(chǎn)生的抗體稱為免疫抗體或稱特異性抗體。特異性抗體是免疫應答中的重要產(chǎn)物，因此亦是免疫學實驗中常用的試劑，對于抗原的分析鑒定和定量檢測極為重要，在各種免疫學診斷中應用極為廣泛。
由人工制備的特異性抗體分為三種類型，即多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。傳統(tǒng)的方法是將抗原注入人體(如預防接種注射疫苗)或動物，由人或動物體內B細胞產(chǎn)生抗體。由于抗原分子具有多種抗原決定簇，每一種決定簇可激活具有相應抗原受體的B細胞產(chǎn)生針對某一抗原決定簇的抗體。因此將抗原注入機體所產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇的混合抗體，故稱之為多克隆抗體。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的乳腺癌相關蛋白。
本發(fā)明的一個目的是提供一種上述蛋白在作為乳腺癌標志分子中的應用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種與本發(fā)明的新的乳腺癌相關蛋白第1位至340位氨基酸殘基組成的多肽特異性結合的多克隆抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種本發(fā)明的多克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的多克隆抗體在體外檢測待測樣品中是否存在本發(fā)明新的乳腺癌相關蛋白的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有本發(fā)明的多克隆抗體的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的多克隆抗體在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。
一方面，本發(fā)明提供一種新的乳腺癌相關蛋白。該蛋白由SDCCAG16基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。已知SDCCAG16基因的Genbank登記號GI16307121。生物信息學分析顯示，SDCCAG16基因位于人X染色體(Xq26.1)，cDNA序列全長2509bp，編碼區(qū)長2313bp(從29至2341)，編碼771個氨基酸的蛋白，分子量約為85.6KDa。
本發(fā)明人在大量實驗的基礎上，利用與SDCCAG16蛋白5’端(如SEQ IDNO2所述第1至340位)的氨基酸殘基組成的多肽特異性結合的多克隆抗體，運用免疫組織化學技術以該抗體檢測人乳腺癌病理組織中該蛋白的表達情況，結果在22例乳腺癌標本中，均為陽性結果，其中癌細胞染色陽性率(染色陽性癌細胞/所有癌細胞)的分布為9例為4+(＞75％)，5例為3+(50-75％)，5例為2+(25-50％)，3例為1+(1-25％)。此結果顯示SDCCAG16分子在乳腺癌中高表達，而在正常組織中低表達，以實驗證明其為乳腺癌相關蛋白，可作為新的乳腺癌標志分子。
本發(fā)明提供了SDCCAG16蛋白在作為乳腺癌相關蛋白，尤其是乳腺癌標志分子中的應用。用SDCCAG16抗體檢測SDCCAG16抗原為基礎，進一步研究SDCCAG16抗原在腫瘤細胞的分期、分級中的表達，可能為乳腺癌和其它癌病變的診斷和治療提供新的線索和靶分子，具有一定的臨床應用前景。在本發(fā)明的一個實施方式中，采用與如SEQ ID NO2所示的乳腺癌相關蛋白特異性結合的多克隆抗體，體外檢測待測樣品中是否存在SEQID NO2所述的乳腺癌相關蛋白，其中存在SEQ ID NO2所述的乳腺癌相關蛋白的待測樣品為與乳腺癌相關，需進一步鑒定。
在本發(fā)明的一個實施方式中，其中所述體外檢測方法包括1)將待測樣品與本發(fā)明所述的多克隆抗體接觸，所述的多克隆抗體與待測樣品中的SDCCAG16蛋白特異性結合，由此形成免疫復合物；并且2)檢測是否存在免疫復合物。
另一方面，本發(fā)明提供一種多克隆抗體，該多克隆抗體與SEQ ID NO2所示第1至340位氨基酸殘基組成的多肽特異性結合。本文所述的“抗體的特異性”是指多克隆抗體對相應抗原或近似抗原物質的識別能力。特異性高，抗原的識別能力就強?！岸嗫寺】贵w與抗原特異性結合”是指多克隆抗體特異性識別靶抗原并與靶抗原的不同抗原表位或抗原決定簇結合的特性。多克隆抗體與單克隆抗體不同，單克隆抗體是均質的，所有的單克隆抗體識別相應靶抗原的同一抗原表位，并且所有的單克隆抗體在結合特性方面的結構和功能是相同的；而多克隆抗體為異質的，所有的多克隆抗體不是來源于單一克隆，因此在結合機制及結構方面都有變化。在本發(fā)明中多克隆抗體是有好處的，一方面，由于所有的多克隆抗體對靶抗原是高度特異性的，另一方面，由于靶抗原上具有大量的抗原表位，而多克隆抗體與靶抗原的不同抗原表位結合，所以使多克隆抗體與靶抗原的結合產(chǎn)生協(xié)同效果，從而更好地識別靶抗原。
本領域普通技術人員已知，可以直接采用如SEQ ID NO2第1至340氨基酸殘基組成的多肽作為抗原，獲得本發(fā)明的多克隆抗體。也可以將本發(fā)明如SEQ ID NO2第1至340氨基酸殘基組成的多肽與已知的標簽形成重組蛋白作為抗原，獲得本發(fā)明的多克隆抗體。所述的標簽選自，但不限于，組氨酸標簽(His標簽)、谷胱苷肽-S-轉移酶標簽(GST標簽)、HA標簽、HSV標簽、Myc標簽和VSV-G-標簽。在本發(fā)明的一個實施方式中，采用GST與如SIQ ID NO2所示第1至340位氨基酸殘基組成的多肽形成的重組蛋白。
本發(fā)明的抗原可以按本領域技術人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明如SEQ ID NO2第1至340位氨基酸序列可以按Steward andYoung(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學技術合成。也可以先合成多個片段，然后連在一起形成更大的片段。優(yōu)選本發(fā)明的抗原通過基因工程的方法獲得。利用在原核生物或真核生物中表達含有編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸序列。
雖然本發(fā)明SDCCAG16蛋白的序列已經(jīng)公開，但是發(fā)明人在大量實驗的基礎上，發(fā)現(xiàn)上述包含3’端序列的全長SDCCAG16蛋白或其部分序列，不能在原核生物中表達，尤其是當包含如SEQ ID NO2所示第340個氨基酸序列以后的序列時，不能在原核生物中表達，而其5’端的1-340氨基酸序列在原核生物中是可溶性表達。
在本發(fā)明的一個實施方式中，將如SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽作為抗原免疫動物，獲得所述的多克隆抗體，并且所述如SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽是在原核生物中表達的。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，首先將SDCCAG16蛋白cDNA的5’末端如SEQ ID NO1所示29至1049核苷酸序列共1021bp克隆到原核表達載體pGEX4T-1(購自Pharmacia)中(pGEX4T-1/F1)，使其讀碼框架一致，利用BL-21(DE3)(購自Invitrogen)菌株表達GST重組蛋白。
本領域普通技術人員熟知適用于表達本發(fā)明的抗原的載體。這樣的市售載體包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)等?？筛鶕?jù)所選用的適當啟動子和待表達的結構基因序列來選擇適當?shù)妮d體。當然，可以在真核細胞中表達本發(fā)明的抗原，這時應使用適用于真核細胞的載體，例如pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)等。
可使用任何適當?shù)乃拗骷毎磉_本發(fā)明的抗原?？商岬降倪m當宿主的例子有原核細胞如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等；低等真核細胞如酵母細胞；昆蟲細胞如果蠅和中國家蠶細胞；植物細胞；高等真核細胞如哺乳動物細胞如CHO、COS細胞。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括人細胞系，如Hela、293和U937細胞系，以及COS、CHO和BHK細胞系。轉導、轉化或轉染的方法是本領域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化鈣轉染法、脂質體轉染法、電穿孔法或微粒轟擊法等。為了活化啟動子、選擇轉化體或擴增所需的基因，可以在適當修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉導、轉染或轉化的宿主細胞。培養(yǎng)中所使用的溫度、pH等培養(yǎng)條件一般都是由所選用的表達特定蛋白質的宿主細胞決定的，并且這些條件都是本領域技術人員熟知的。為了大量獲得重組蛋白，可以采用誘導型啟動子，并利用誘導物誘導基因的表達。實質上，“誘導物”可以是任何能誘導宿主中基因表達的物質，可以化學物質或環(huán)境刺激，如，暴露于特定波長的光下。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，采用的誘導物為IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的多克隆抗體對谷胱苷肽-S-轉移酶與SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽形成的重組蛋白特異性結合，而對谷胱苷肽-S-轉移酶沒有特異性。所述的多克隆抗體主要為IgG。
抗血清的效價可根據(jù)抗體的不同性質，分別采用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴散、單向免疫擴散、溶血實驗、凝集反應、酶聯(lián)免疫吸附實驗及放射免疫分析等進行測定。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的多克隆抗體分子量約為150kD，用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測其抗體效價為10-5至10-6。
本發(fā)明提供一種本發(fā)明的多克隆抗體的制備方法，所述制備方法包括將谷胱苷肽-S-轉移酶與SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽形成的重組蛋白作為抗原，免疫動物，取血，分出抗血清并純化制得，制得的多克隆抗體與SEQ ID NO2所示的多肽特異性結合，而對谷胱苷肽-S-轉移酶沒有特異性。
在本發(fā)明的多克隆抗體的制備方法中，供免疫用的動物可為哺乳類和禽類，包括，但不限于，家兔、山羊或綿羊、馬、騾和豚鼠等。動物種類的選擇主要是根據(jù)抗原的特性和所要獲得抗體的量和用途。對本發(fā)明的蛋白質抗原，大部分動物均適合，優(yōu)選家兔和山羊，更優(yōu)選家兔。對于難以獲得的抗原，且抗體需要量少，可用純系小鼠制備。免疫用動物應選適齡、健壯，最好為雄性。由于動物個體的免疫應答能力差異較大，每批免疫宜同時使用數(shù)只動物。
抗原的免疫劑量依照給予抗原的種類、免疫次數(shù)、注射途徑以及受體動物的種類、免疫周期及所要求的抗體特性等而不同。劑量過低不能形成足夠強的免疫刺激，但劑量過高，又有可能造成免疫耐受。在一定范圍內，抗體效價隨注射抗原的劑量而增高。蛋白質抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般而言，小鼠首次抗原劑量為5-400μg/次；大鼠為10μg-1mg/次；兔為10μg-5mg/次，優(yōu)選50-100μg。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法；反之，欲獲得高效價的抗血清，宜采用大劑量抗原長程免疫法。對本發(fā)明的可溶性抗原?？杉佑米魟?，以增強抗原的免疫原性或改變免疫反應的類型，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應答。如不加佐劑，則抗原劑量應加大約10-20倍。佐劑有弗氏(Freund’s)佐劑、脂質體佐劑及氫氧化鋁佐劑等。其中最常用的是弗氏佐劑，根據(jù)其組成分為完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)兩種。IFA通常由羊毛脂1份、石蠟油5份組成，每毫升IFA中加入1-20mg卡介苗即為CFA。
本發(fā)明的可溶性抗原可采用背部、足掌、淋巴結周圍、耳后等處皮內或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2-4周。常規(guī)免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫；再以抗原加IFA作2-5次加強免疫，每次間隔2-6周，皮下或腹腔注射加強免疫。完成免疫程序后，先取少量血清測試抗體效價達到要求時，即可從動物心臟穿刺(豚鼠及家兔)，頸靜脈或頸動脈放血(家兔、羊及馬匹)，待血液凝固后，離心沉淀分離出血清，加入0.1％疊氮鈉作為防腐劑。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，提供了一種本發(fā)明的多克隆抗體的制備方法，其中，所述抗原由原核細胞表達，制備性SDS-PAGE膠純化，純度達電泳級；免疫動物時，將抗原與等體積完全弗氏佐劑混勻進行初次免疫，再次免疫時以不完全弗氏佐劑取代弗氏佐劑，兩次免疫時間間隔2至4周，之后每隔一個月加強免疫一次并于加強后10天內取耳靜脈血，用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測其抗體效價，當抗體效價為10-5至10-6時，免疫后8至10天，取血，其中每次免疫量為1μg抗原量/g動物體重至1μg抗原量/10g動物體重；離心收集上清，制得多克隆抗體。通過上述方法獲得的抗體，可以用常規(guī)方法純化，例如鹽析、凝膠過濾、親合色譜層析等方法。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的多克隆抗體的用途，在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多克隆抗體在體外檢測待測樣品中是否存在SDCCAG16蛋白中的用途，其中所述體外檢測包括1)將待測樣品與本發(fā)明所述的多克隆抗體接觸，所述的多克隆抗體與待測樣品中的SDCCAG16蛋白特異性結合，由此形成免疫復合物；并且2)檢測是否存在免疫復合物。
所述的待測樣品可以直接來自病人的病灶組織或周圍組織，也可以來自石蠟切片。可以將待測樣品預處理，以符合檢測的需要。
檢測是否存在免疫復合物的方法可以采用本領域普通技術人員已知的方式檢測，例如熒光、發(fā)光、放射性或化學發(fā)光化合物或酶標記。這些標記的精確特性并不是特別關鍵，但是它應該能夠通過其本身或與一種或多種額外物質結合(如酶的底物)，產(chǎn)生外源方法可檢測的信號。
在本發(fā)明的一個實施方式中，采用Westen Blot方式檢測樣品中是否存在SDCCAG16蛋白(參見實施例3)。本發(fā)明的一個實施方式中，利用本發(fā)明的多克隆抗體，采用免疫組化方法體外檢測待測樣品中是否存在SDCCAG16蛋白(參見實施例4)。免疫組化方法常用的酶與ELISA檢測使用的酶基本上相同，包括，但不限于，辣根過氧化物酶(Horse RadishPeroxidase，HRP)和堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatease，AP)，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，優(yōu)選辣根過氧化物酶。本領域普通技術人員已知，針對不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于，鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)等。堿性磷酸酶的底物一般采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)。對于酶標IgG二抗及三抗等，現(xiàn)已有商品出售，可以直接商購獲得。
本發(fā)明另一個方面提供一種藥物組合物，其含有本發(fā)明的多克隆抗體和必要時的藥物可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的多克隆抗體可以與藥物可接受的賦形劑或載體結合形成藥物組合物。藥物可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料，例如，包括但不限于鹽水、緩沖鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適于胃腸外、舌下、腦池內、陰道內、腹膜內、直腸內、頰內、腫瘤內或表皮給藥。
胃腸外給藥包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、關節(jié)內注射和輸注。適于胃腸外給藥的藥物組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑等佐劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。
表皮給藥包括在皮膚、黏膜上、以及在肺和眼的表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。在適于吸入的組合物中，本發(fā)明多克隆抗體被壓縮或含于壓縮氣體如氮氣或液化氣體推進劑中。優(yōu)選地，本發(fā)明多克隆抗體不溶于液化推進介質中。
直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選為栓劑，它可以通過將本發(fā)明的多克隆抗體與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合制備，所述賦形劑或載體在室溫為固態(tài)，在體溫下為液態(tài)，因此在直腸或陰道腔內熔化并釋放出活性化合物。
當以上述或其他方式進行治療時，治療有效量的本發(fā)明多克隆抗體可以是本發(fā)明多克隆抗體的單獨形式，使用或不使用藥物可接受的賦形劑。治療有效量指以適宜的治療方式對治療腫瘤有效的本發(fā)明多克隆抗體的量。對任何特定患者的具體治療有效劑量取決于許多因素，包括所治療的疾病和氣其嚴重程度；所用多克隆抗體的活性；所用的特定組合物；患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況；給藥時間；給藥途徑；多克隆抗體的排泄速度；治療的持續(xù)時間聯(lián)合或同時服用的其他藥物等。
在本發(fā)明的大量實驗的基礎上，本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的多克隆抗體在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。本發(fā)明制備的多克隆抗體可以與本發(fā)明的新的乳腺癌相關蛋白SDCCAG16特異性結合，而乳腺癌相關蛋白SDCCAG16在22例乳腺癌標本中，均為陽性結果；另外，顯示SDCCAG16分子在乳腺癌中高表達，而在正常組織中低表達。


圖1為誘導原核表達蛋白圖。其中，Marker為分子量標準，BL-21為表達菌株裂解液，GST-B為對照菌株誘導前，GST-A為對照菌株誘導后，F(xiàn)1-B為融合蛋白誘導前，F(xiàn)1-A為融合蛋白誘導后。
圖2A與圖2B顯示抗體特異性檢測結果。圖2A為抗體；圖2B為抗原吸附抗體。其中，WP為全細胞裂解液，NP1為核蛋白20ug，NP2為核蛋白40ug，CP為細胞漿蛋白。
圖3A與圖3B顯示運用免疫組織化學方法研究SDCCAG16在乳腺癌的表達情況。圖3A為癌組織標本(標本號38195-A，↑顯示癌細胞團呈陽性染色)，圖3B為正常組織標本(標本號38195-C，↑顯示正常細胞染色)。
具體實施例方式
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1重組蛋白的誘導、表達及純化1、表達質粒的構建采用Clontech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)2并參照其說明書，從Hela細胞cDNA文庫中得到與1A6/DRIM(柯楊等，化學致癌作用靶基因的分離與測序，中國科學，1996，2685-91，Schwirzke，M.等，Differential geneexpression in mammary carcinoma cell linesindentification of DRIM，a new gene down-regulated in metastasis.Anticancer Research.1998，181409-1422.)結合的蛋白SDCCAG16的cDNA序列全長。然后采用PCR技術(引物5’GAATTC-ATGACTGCGAACCGGCTTGCAGA 3’，5’CTCGAG-GGCTACCTGGAGTTTCTGTGTCA3’北京奧科生物技術公司合成，Taq酶購自Promega公司)擴增SDCCAG 5’端29-1049(F1)序列并克隆到pGEX4T-1(Pharmacia公司)原核表達載體的相應多克隆位點，使其讀碼框一致，經(jīng)測序完全正確后，用于原核表達GST融合蛋白。
2、觀察目的基因是否在大腸桿菌中表達以及IPTG的誘導濃度2.1在將表達質粒pGEX4T-1/F1轉化入BL21(DE3)和(購自Invitrogen)菌株的平板上挑取單個克隆，接種于含氨芐青霉素(50ug/ml)的10ml LB培養(yǎng)基(USB公司)中，37℃，225rpm，搖床上搖至OD值1.0左右。
2.2取四個搖菌管，分別加入上述菌液2ml，并編好號碼，剩余的2ml存于4℃?zhèn)溆?。?、2、3號管中分別加入IPTG至終濃度為0.1mM、0.5mM、1mM，4號管不加IPTG作為對照。37℃，225rpm，搖床上搖6小時左右。
2.3從1、2、3、4號管中分別取1ml菌液放入標記好的4個1.5mlEP管中，10000rpm，離心3分鐘，沉淀細菌，徹底棄去培養(yǎng)液。沉淀加100ul1×上樣緩沖液(見《分子克隆》第二版p884)。加蛋白質分子量標準，各樣品上樣15ul，另外加無轉化質粒的大腸桿菌BL21(DE3)樣品作對照，行SDS-PAGE膠電泳，并用考馬斯亮蘭染色，觀察目的蛋白是否表達，0.1Mm、0.5mM、1mM IPTG(sigma公司)誘導時目的基因目的蛋白的表達量，誘導表達的蛋白分子量是否與預期相同。
結果如圖1所示，誘導表達的GST/SDCCAG16-F1重組蛋白分子量與預期相同，蛋白分子量約為65Kd。
3、觀察目的蛋白的表達是否可溶用上述已經(jīng)確定表達目的蛋白的菌液1ml加入到含氨芐青霉素(50ug/ml)的50ml LB中，20-30℃，225rpm搖床上搖至OD值約為2.0；加100mM IPTG至終濃度為0.1mM，繼續(xù)按原條件培養(yǎng)2h；7700g，4℃離心10min，收集細菌，棄上清；用1ml細胞裂解液溶解細菌沉淀，用堿變性法分離細菌中可溶性成分及包涵體成分；用蛋白質分子量標準、IPTG未誘導樣品、IPTG誘導樣品、細菌超聲后上清和初純化的包涵體提取物成分，行SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮蘭染色，觀察誘導表達的目的蛋白是否可溶(表達的蛋白在上清中即為可溶)。
結果本發(fā)明所得蛋白為可溶性蛋白。
4、重組蛋白的大量誘導挑取單克隆陽性表達菌，接種于100ml LB(Amp+)培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；次日以LB(Amp+)稀釋至1000ml，繼續(xù)培養(yǎng)至OD＝1左右，加IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)6小時；4℃，5000rpm離心10分鐘；沉淀以1×PBS洗滌后，分裝(200ml菌液沉淀/管)，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 5、提取重組蛋白將上述PBS洗滌后沉淀加10ml細菌裂解液，冰浴20分鐘；冰上間歇超聲裂菌，20HZ，超聲30秒，至菌液不粘；加10ul Triton×100至終濃度為1％，冰浴10分鐘；4℃，15000rpm離心25分鐘，留取上清；加入漂洗后的GST-sepharose(Pharmacia公司)200ul，室溫混合15分鐘；500g×10min，4℃離心，去上清，收集珠子，用1ml的1mM PMSF/PBS或PBS洗珠子并轉移至1.5ml離心管，500g×10min，3次，棄上清，每次混勻5min；加100ul洗脫液(還原型谷胱苷肽Pharmacia公司)，室溫10min后離心取上清。上清定量，分裝-70℃凍存或如下純化。
6、SDS-PAGE制備膠及電洗脫純化重組蛋白SDS-PAGE制備膠的灌制洗凈制備膠玻璃板兩塊，準備好邊條3根，邊條兩面涂少許凡士林，將玻璃板墊好并夾住。用1％瓊脂糖封閉已夾好的兩塊玻璃的底邊和周邊；配10％分離膠60ml，5％濃縮膠15ml；灌膠分離膠灌至玻璃板的2/3處，濃縮膠占分離膠的1/5，上面留有上樣區(qū)域≥3cm；初純化外源蛋白加等量2×SDS-PAGE上樣緩沖液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，20％甘油，200mM DTT，4％SDS，0.2％溴酚藍。(2×SDS上樣緩沖液950ul+50ulβ-巰基乙醇))，沸水煮5min后上樣，100V電泳6-7小時；電泳畢，用冷0.1MKCl浸泡膠2-3分鐘，切下目的條帶放入確保不漏的透析袋內；將透析袋置于水平電泳洗脫裝置內，60V洗脫過夜，次日100V繼續(xù)洗脫1小時，然后反轉電極向相反方向洗脫3-5分鐘；吸出透析帶內液體，蔗糖包埋濃縮，PBS透析。
實施例2抗血清、多克隆抗體的制備和鑒定1、抗體檢測用試劑ELISA用液①ELISA包被液0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)；0.1M NaHCO3，500ml；0.1M Na2CO3，30ml；調pH至9.5。
②ELISA洗液0.05％Tween-20，用PBS(pH7.4)配制。
③ELISA封閉液及抗體稀釋液1％BSA，用PBS(pH7.4)配制。
④ELISA底物反應液OPD 3.4mg；PBS(pH7.4)10ml；30％H2O25ul。
⑤ELISA反應終止液12.5％ H2SO4。
2、抗血清、多克隆抗體的制備和鑒定2.1動物雄性，6-8W日本長耳白兔4只，2500g/只。
2.2抗原GST/SDCCAG16-F1重組蛋白由原核表達，制備性SDS-PAGE膠純化，純度達電泳級，50ug/只/次。
2.3免疫程序及途徑初次免疫SDCCAG16抗原與等體積完全弗氏佐劑充分混勻，形成油包水，于兔背部皮內多點注射；四周后第一次加強免疫，SDCCAG16抗原與不完全弗氏佐劑等體積混勻，背部皮內多點注射；之后每隔一個月加強免疫一次并于加強后第10天取耳靜脈血，用ELISA法測抗體效價；當抗體效價達10-5或10-6時，于末次加強免疫后第8-10天放血，收集血清；抗血清的收集將收集的血于4℃靜置3-4小時，5,000rpm離心10分鐘，收集上清。-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 3、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體滴度ELISA包被液稀釋純化GST/SDCCAG16-F1抗原，濃度為5ug/ml，包被96孔軟板，50ul/孔，4℃過夜；0.05Tween20-PBS洗2遍，1％BSA封閉，200ul/孔，室溫1-2小時或4℃過夜；0.05％Tween20-PBS洗2遍，加入不同稀釋度的抗血清(10-3，10-4，10-5，10-6)和正常兔血清(10-3)，50ul/孔，室溫1小時；0.05％Tween20-PBS洗5遍，加羊抗兔HRP(1∶1000)50ul/孔，室溫1小時；PBS洗5遍，加OPD顯色液100ul/孔，避光顯色，顯色后加終止液50ul/孔，觀察結果亦可用ELISA Reader測OD492nm。
4、Western Blot檢測多克隆抗體特異性取不同量核蛋白或漿蛋白行8％SDS-PAGE電泳，電泳結束后，小心取膠，按膠的大小裁剪硝酸纖維素膜或PVDF膜和濾紙，并浸泡于電轉緩沖液中15min，(PVDF膜需用甲醇溶液泡1-2min)；安裝轉移裝置先將兩層濾紙放在海綿上，依次放置纖維素膜、凝膠及兩層濾紙，使每層之間不留氣泡，夾緊塑料支架放入電泳槽內，使硝酸纖維素膜一側對正極、膠對陰極；接通電源，4℃、70V轉膜2小時；轉移結束后，取出NC膜，用麗春紅染色(麗春紅S(ponceauS)2g/l、三氯乙酸30g/l、磺基水楊酸30g/l)1-2min，蒸餾水沖洗至條帶清晰可見，做好分子量標記；5％脫脂奶粉封閉4℃過夜或室溫1小時；用0.5％Tween20-PBS洗滌后加SDCCAG16特異抗體(1∶500或1∶1000)4℃過夜或37℃1小時；用0.5％Tween20-PBS洗3次，時間分別為15分鐘、5分鐘和5分鐘，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(購自北京中山生物公司)，室溫作用1小時；用0.5％Tween20-PBS洗3次后按ECLTM(Western blotting detection reagents，購自amersham pharmacia biotech)說明書方法進行化學發(fā)光、X光片曝光、洗片。
結果參見圖2A和圖2B，從圖中可見，抗體可以識別內源SDCCAG16抗原，該抗原分布于細胞核和細胞漿中，抗體有較好的特異性。
實施例3運用免疫組織化學方法研究SDCCAG16在乳腺癌的表達情況1、標本來源本實驗所用的病理診斷明確的乳腺組織，其中，所用的病理診斷明確的乳腺組織(癌組織標本22例、癌旁組織標本11例、正常組織標本11例)。正常組織均為相應手術癌標本的遠端組織。石蠟組織切片標本來自北京腫瘤醫(yī)院病理科，均為近年內存檔標本。
2、免疫組織化學實驗步驟石蠟切片常規(guī)脫蠟至水(二甲苯，60min，3次；100％乙醇，3min，2次；95％乙醇，3min；75％乙醇，3min；蒸餾水沖洗，1×PBS再洗一次)；1％H2O2阻斷內源性過氧化物酶室溫，10min；抗原微波修復切片放入修復液(9ml 0.1M枸櫞酸溶液和41ml 0.1M枸櫞酸鈉溶液液加入450ml水中，溶液pH應為6.0)中92℃-98℃至少維持10min后室溫冷卻20-30min；1×PBS洗3次每次5min，10％正常羊血清37℃封閉1小時或4℃過夜；吸去羊血清(勿洗)，加入本發(fā)明的多克隆抗體(一抗)(1∶200)4℃過夜；1×PBS洗3次每次5min，加入生物素標記的羊抗鼠二抗(北京中山生物公司)，37℃作用30min至1小時；1×PBS洗3次每次5min，加入辣根過氧化物酶標記的三抗鏈霉卵白素(HRP-Strepavidin)(北京中山生物公司)，37℃作用30min至1小時；1×PBS洗3次每次5min，DAB避光顯色5-10min(DAB 5mg；PBS 10ml；30％H2O25ul)，鏡下觀察有信號時可用自來水沖洗終止反應，10％蘇木精復染(自來水沖洗)，1％鹽酸-酒精分色(可滴片并直接泡在1×PBS里然后用水沖)；逐級酒精脫水、二甲苯透明(75％乙醇，3min；95％乙醇，3min；100％乙醇，3min，2次；二甲苯，3min，2次)；中性樹膠加蓋玻片封片。
結果圖3A為癌組織標本(標本號38195-A，其中，箭頭↑顯示癌細胞團呈陽性染色)，圖3B為正常組織標本(標本號38195-C，↑顯示正常細胞染色)。
3、利用免疫組織化學方法研究SDCCAG16在乳腺癌的表達情況將癌組織22例，與之相應的癌旁組織標本11例、正常組織標本11例，分別按照如上所述免疫組織化學實驗步驟提供的方法研究SDCCAG16在乳腺癌的表達情況。
結果見表1。
表1、癌細胞染色陽性率的分布

結論免疫組織化學檢測乳腺癌標本22例，均為陽性結果，參見圖3A與圖3B，其中癌細胞染色陽性率的分布為9例標本中為4+(＞75％)，5例為3+(50-75％)，5例為2+(25-50％)，3例為1+(＜25％)。此結果顯示SDCCAG16分子在乳腺癌中高表達，而在正常組織中低表達。用SDCCAG16抗體檢測SDCCAG16抗原為基礎，進一步研究SDCCAG16抗原在腫瘤細胞的分期、分級中的表達的意義，可能為乳腺癌和其它癌病變的診斷和治療提供新的線索和靶分子，具有一定的臨床應用前景。
序列表<110>北京市腫瘤防治研究所<120>一種新的乳腺癌相關蛋白及其特異性多克隆抗體<130>D0311025F<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2509<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(29)..(2 344)<223>
<400>1gtccatgtga gagaagctgg ctgctgaa atg act gcg aac cgg ctt gca gag 52Met Thr Ala Asn Arg Leu Ala Glu1 5agc ctt ctg gct ttg agc caa cag gaa gaa cta gcg gat ttg cca aaa100Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gln Gln Glu Glu Leu Ala Asp Leu Pro Lys10 15 20gac tac ctc ttg agt gag agt gaa gat gag ggg gac aat gat gga gag148Asp Tyr Leu Leu Ser Glu Ser Glu Asp Glu Gly Asp Asn Asp Gly Glu25 30 35 40aga aag cat caa aag ctt ctg gaa gca atc agt tcc ctt gat gga aag196Arg Lys His Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Gly Lys45 50 55aat agg cgg aaa ttg gct gag agg tct gag gct agt ctg aag gtg tca244Asn Arg Arg Lys Leu Ala Glu Arg Ser Glu Ala Ser Leu Lys Val Ser60 65 70gag ttc aat gtc agt tct gaa gga tca gga gaa aag ctg gtc ctt gca292Glu Phe Asn Val Ser Ser Glu Gly Ser Gly Glu Lys Leu Val Leu Ala75 80 85gat ctg ctt gag cct gtt aaa act tca tct tct ttg gcc act gtg aaa340Asp Leu Leu Glu Pro Val Lys Thr Ser Ser Ser Leu Ala Thr Val Lys90 95 100aag caa ctg agt aga gtc aaa tca aag aag aca gtg gag tta cct ctg388
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Ser Thr Trp Asn Thr Gln Arg Ala Phe Gln Lys Leu Thr Thr Pro Lys705 710 715 720Val Val Thr Lys Pro Gly His Ile Ile Asn Pro Ile Lys Ala Glu Asp725 730 735Val Gly Tyr Arg Ser Ser Ser Arg Ser Asp Leu Ser Val Ile Gln Arg740 745 750Asn Pro Lys Arg Ile Thr Thr Arg His Lys Lys Gln Leu Lys Lys Cys755 760 765Ser Val Asp770
權利要求
1.一種新的乳腺癌相關蛋白，該蛋白由SDCCAG16基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.如權利要求1所述的蛋白在作為乳腺癌標志分子中的應用。
3.如權利要求2所述的蛋白在作為乳腺癌標志分子中的應用，其中采用與SEQ ID NO2所示的乳腺癌相關蛋白有特異性結合的多克隆抗體，體外檢測待測樣品中是否存在SEQ ID NO2所示的乳腺癌相關蛋白，其中存在SEQ ID NO2所示的乳腺癌相關蛋白的待測樣品為與乳腺癌相關，需進一步鑒定。
4.一種多克隆抗體，該多克隆抗體與SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽特異性結合。
5.如權利要求4所述的多克隆抗體，其中將如SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽作為抗原免疫動物，獲得所述的多克隆抗體，并且所述如SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽是在原核生物中表達的。
6.如權利要求4所述的多克隆抗體，該多克隆抗體對谷胱苷肽-S-轉移酶與SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽形成的重組蛋白特異性結合，而對谷胱苷肽-S-轉移酶沒有特異性。
7.一種如權利要求4至6任一項所述的多克隆抗體的制備方法，所述制備方法包括將谷胱苷肽-S-轉移酶與SEQ ID NO2第1至340位氨基酸殘基組成的多肽形成的重組蛋白作為抗原，免疫動物，取血，分出抗血清并純化制得，制得的多克隆抗體與SEQ ID NO2所示的多肽特異性結合，而對谷胱苷肽-S-轉移酶沒有特異性。
8.如權利要求4至6任一項所述的多克隆抗體在體外檢測待測樣品中是否存在SDCCAG16蛋白中的用途，其中所述體外檢測包括1)將待測樣品與如權利要求4至6任一項所述的多克隆抗體接觸，所述的多克隆抗體與待測樣品中的SDCCAG16蛋白特異性結合，由此形成免疫復合物；并且2)檢測是否存在免疫復合物。
9.一種藥物組合物，其包含如權利要求4至6任一項的多克隆抗體和必要時藥物可接受的載體或賦形劑。
10.如權利要求4至6任一項的多克隆抗體在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的乳腺癌相關蛋白SDCCAG16及與SDCCAG16蛋白5’端如SEQ ID NO2所示第1至340位的氨基酸殘基組成的多肽特異性結合的多克隆抗體。本發(fā)明還涉及所述多克隆抗體的制備方法和用途。
文檔編號C12P21/00GK1618809SQ200310115388
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權日2003年11月21日
發(fā)明者柯楊, 杜曉娟, 寧濤, 趙軍, 楊琳 申請人:北京市腫瘤防治研究所