專利名稱：一種發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素的制備方法，尤其是指一種采用絲狀真菌三孢布拉氏霉進行發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝。
背景技術：
番茄紅素是類胡蘿卜素的一種，已被證明是一種天然抗氧化劑。據(jù)國外一些機構的研究報道表明，該產(chǎn)品對于預防和治療心血管類疾病、動脈硬化、腫瘤和男性不育等多種成人疾病，以及對增強人體免疫功能具有重要的生理意義。目前國內(nèi)對番茄紅素的生產(chǎn)尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝。這種方法比較簡單，產(chǎn)量高，成本低，對環(huán)境無污染。
本專利包括a.一級種培養(yǎng)；b.二級種培養(yǎng)；c.發(fā)酵；d.提取，其特征是一級種培養(yǎng)時，將保藏在土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上能代謝產(chǎn)生番茄紅素的三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，在24～30℃、160～180轉(zhuǎn)/分鐘條件下，進行振蕩培養(yǎng)44～48小時；在二級種的培養(yǎng)特時，將分別培養(yǎng)好的三孢布拉霉兩性菌種的一級種按1∶1的比例混合后，接入種子罐內(nèi)進行擴大培養(yǎng)，作為發(fā)酵用的種子，培養(yǎng)條件為溫度24～30℃，通風量1∶1，培養(yǎng)時間為24～48小時。
一級種與二級種的種子培養(yǎng)基為葡萄糖1～2％，淀粉2～4％，玉米漿3～7％及少量的微量元素，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.0～6.4。
在發(fā)酵時，采用普通發(fā)酵罐，將二級種通過無菌移種管道接入發(fā)酵罐中，溫度24～30℃，風量1∶1.5，在400～600轉(zhuǎn)/分攪拌的情況下，發(fā)酵96～120小時，在發(fā)酵至48小時時加入一些胺類或雜環(huán)類氮化合物抑制番茄紅素的環(huán)化。
胺類或雜環(huán)類氮化合物為砒啶或咪唑或煙堿或其衍生物類代謝阻斷劑。
發(fā)酵用的培養(yǎng)基為淀粉2～4％，豆餅粉2～4％，玉米漿3～7％及少量的微量元素，其余為水，單位重量百分數(shù)，PH6.4～6.7。
在提取時，先收集菌體采用離心或板框壓濾技術收集濕菌體，濕菌體經(jīng)70～80℃加熱真空干燥，獲得富含天然番茄紅素的干菌粉，再利用萃取劑萃取按萃取劑與干菌粉之比為1∶10的比例進行回流萃?。蝗缓蠼Y(jié)晶。
所述萃取劑為植物油或有機溶劑。
所述有機溶劑為6#溶劑油或丙酮或乙醚或石油醚或環(huán)己烷或正己烷或二硫化碳或乙酸乙酯。
將萃取濃縮液加入1倍體積的乙醇，置于0～10℃、經(jīng)24小時析出含40％番茄紅素的結(jié)晶粗品，將所得的粗品用氯仿溶解過濾后，加入2倍體積無水乙醇，在0～10℃的溫度下重結(jié)晶，得到含量在60～70％以上的番茄紅素純品，經(jīng)多次重結(jié)晶得到含量在90％以上的番茄紅素精品。
一級種采用搖瓶培養(yǎng)；二級種培養(yǎng)及發(fā)酵工序均采用普通生物反應器。
本發(fā)明的優(yōu)點是1.創(chuàng)造一種生產(chǎn)番茄紅素的新方法——發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。
2.克服了普通攪拌罐在發(fā)酵過程中攪拌軸對菌絲產(chǎn)生的剪切力，造成菌絲的斷裂、菌體自溶，發(fā)酵無法進行的弊端。
3.克服了絲狀真菌高粘度發(fā)酵時，由于氧的傳遞與利用困難導致產(chǎn)量極低的弊端。
4.采用普通攪拌罐對高粘度的絲狀真菌進行發(fā)酵，不僅大大降低了生產(chǎn)成本，也擴大了該項技術的推廣及應用的范圍。
5.本發(fā)明采用搖瓶一級種，接罐進行二級種的擴大培養(yǎng)后，再接入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的生產(chǎn)工藝，一方面減少了生產(chǎn)設備；另一方面縮短了發(fā)酵時間，降低了發(fā)酵過程中的能耗和生產(chǎn)成本；提高了設備的利用率。
具體實施例方式
實例1采用30升普通攪拌罐發(fā)酵制備天然番茄紅素1.一級種培養(yǎng)基為葡萄糖1％，淀粉3％，玉米漿7％及少量的微量元素硫酸鎂，其余為水，單位均為重量百分數(shù)，PH6.0，將保藏能合成番茄紅素的斜面三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的250m升三角燒瓶中，在24℃、160轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)48小時。
2.二級種培養(yǎng)基為葡萄糖2％，淀粉4％，玉米漿3％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，PH6.0，其余為水，單位為重量百分數(shù)，將培養(yǎng)好的一級種按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，1％的種量接入裝有種子培養(yǎng)基的1000m升三角燒瓶中，在24℃、160轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)48小時。
3.發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉2％，豆餅粉2％，玉米漿7％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.4，發(fā)酵罐為30升的普通攪拌罐，裝20升培養(yǎng)基，120℃滅菌40分鐘，按10％的種量接入已培養(yǎng)好的二級種，罐壓0.05兆帕，通風量1∶1，溫度24℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵120小時。在發(fā)酵至48小時時加入砒啶或其衍生物類代謝阻斷劑。
4.提取發(fā)酵液離心收集濕菌體，70℃真空干燥，得干菌粉900克。干菌粉用10升乙酸乙酯進行萃取，萃取液減壓濃縮后，加入無水乙醇進行冷凍結(jié)晶，2000轉(zhuǎn)/分離心收集粗結(jié)晶35.64克。將此粗品用5升氯仿溶解，并用砂芯漏斗過濾，加入2倍濾液體積的無水乙醇，冷凍結(jié)晶24小時，4000轉(zhuǎn)/分離心收集得到含有85％的番茄紅素純品13.42克。
實例2.采用50升普通攪拌罐發(fā)酵制備天然番茄紅素1.一級種培養(yǎng)基為葡萄糖2％，淀粉4％，玉米漿3％及少量的微量元素硫酸鎂，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.4，將保藏能代謝產(chǎn)生番茄紅素的斜面三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的250m升三角燒瓶中，在30℃、180轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)44小時。
2.二級種培養(yǎng)基為葡萄糖1％，淀粉2％，玉米漿7％及少量的微量元素硫酸鎂，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.4，將培養(yǎng)好的一級種按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，5％的種量接入10升種子罐中。種子罐中培養(yǎng)基裝量7升，120℃滅菌30分鐘，在30℃、攪拌轉(zhuǎn)速170轉(zhuǎn)/分，通風量1∶1，罐壓0.05兆帕的條件下，進行攪拌培養(yǎng)44小時。
3.發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉3％，豆餅粉4％，玉米漿3％及少量的微量元素硫酸鎂，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.7，發(fā)酵罐為50升的普通攪拌罐，裝35升培養(yǎng)基，120℃滅菌40分鐘，按15％的種量接入已培養(yǎng)好的二級種，罐壓0.05兆帕，通風量1∶1.5，溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵96小時。在發(fā)酵至48小時時加入咪唑或其衍生物類代謝阻斷劑。
4.提取同實例1。發(fā)酵液離心收集濕菌體，80℃真空干燥，得干菌粉1470克。干菌粉用15升石油醚進行回流萃取，萃取液減壓濃縮后，加入無水乙醇在10℃條件下結(jié)晶，2000轉(zhuǎn)/分離心收集粗結(jié)晶58.22克。將此粗品用10升氯仿溶解，并用砂芯漏斗過濾，加入2倍濾液體積的無水乙醇，冷凍結(jié)晶24小時，4000轉(zhuǎn)/分離心收集得到含有85％的番茄紅素純品21.93克。
實例3米用30升普通攪拌罐發(fā)酵制備天然番茄紅素1.一級種培養(yǎng)基為葡萄糖1.5％，淀粉2％，玉米漿5％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，其余為水，單位均為重量百分數(shù)，PH6.2，將保藏能合成番茄紅素的斜面三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的250毫升三角燒瓶中，在27℃、170轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)46小時。
2.二級種培養(yǎng)基為葡萄糖1.5％，淀粉3％，玉米漿5％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，PH6.2，其余為水，單位為重量百分數(shù)，將培養(yǎng)好的一級種按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，3％的種量接入裝有種子培養(yǎng)基的1000毫升三角燒瓶中，在26℃、180轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)46小時。
3.發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉3％，豆餅粉3％，玉米漿5％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.5，發(fā)酵罐為30升的普通攪拌罐，裝20升培養(yǎng)基，120℃滅菌40分鐘，按12％的種量接入已培養(yǎng)好的二級種，罐壓0.05兆帕，通風量1∶1，溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵110小時。在發(fā)酵至48小時加入煙堿或其衍生物類代謝阻斷劑。
4.提取發(fā)酵液離心收集濕菌體，75℃真空干燥，得干菌粉900克。干菌粉用10升丙酮進行萃取，萃取液減壓濃縮后，加入無水乙醇進行冷凍結(jié)晶，3000轉(zhuǎn)/分離心收集粗結(jié)晶35.64克。將此粗品用5升氯仿溶解，并用砂芯漏斗過濾，加入2倍濾液體積的無水乙醇，冷凍結(jié)晶24小時，4000轉(zhuǎn)/分離心收集得到含有85％的番茄紅素純品13.42克。
實例4采用30升普通攪拌罐發(fā)酵制備天然番茄紅素1.一級種培養(yǎng)基為葡萄糖2％，淀粉2％，玉米漿6％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，其余為水，單位均為重量百分數(shù)，PH6.3，將保藏能合成番茄紅素的斜面三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的250m升三角燒瓶中，在26℃、165轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)47小時。
2.二級種培養(yǎng)基為葡萄糖2％，淀粉4％，玉米漿4％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，PH6.1，其余為水，單位為重量百分數(shù)，將培養(yǎng)好的一級種按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，4％的種量接入裝有種子培養(yǎng)基的1000m升三角燒瓶中，在28℃、175轉(zhuǎn)/分的條件下，進行振蕩培養(yǎng)45小時。
3.發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉4％，豆餅粉4％，玉米漿7％及少量的微量元素磷酸二氫鉀，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.4，發(fā)酵罐為30升的普通攪拌罐，裝20升培養(yǎng)基，120℃滅菌40分鐘，按14％的種量接入已培養(yǎng)好的二級種，罐壓0.05兆帕，通風量1∶1.2，溫度25℃，攪拌轉(zhuǎn)速550轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵110小時。在發(fā)酵至48小時時加入砒啶。
4.提取發(fā)酵液離心收集濕菌體，78℃真空干燥，得干菌粉900克。干菌粉用10升植物油或6#溶劑油進行萃取，萃取液減壓濃縮后，加入無水乙醇進行冷凍結(jié)晶，3500轉(zhuǎn)/分離心收集粗結(jié)晶35.64克。將此粗品用5升氯仿溶解，并用砂芯漏斗過濾，加入2倍濾液體積的無水乙醇，冷凍結(jié)晶24小時，4000轉(zhuǎn)/分離心收集得到含有85％的番茄紅素純品13.42克。
權利要求
1.一種發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，包括a.一級種培養(yǎng)；b.二級種培養(yǎng)；c.發(fā)酵；d.提取，其特征是一級種的培養(yǎng)時，將保藏在土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上能代謝產(chǎn)生番茄紅素的三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，在24～30℃、160～180轉(zhuǎn)/分鐘條件下，進行振蕩培養(yǎng)44～48小時；在二級種的培養(yǎng)特時，將分別培養(yǎng)好的三孢布拉霉兩性菌種的一級種按1∶1的比例混合后，接入種子罐內(nèi)進行擴大培養(yǎng)，作為發(fā)酵用的種子，培養(yǎng)條件為溫度24～30℃，通風量1∶1，培養(yǎng)時間為24～48小時。
2.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是一級種與二級種的種子培養(yǎng)基為葡萄糖1～2％，淀粉2～4％，玉米漿3～7％及少量的微量元素，其余為水，單位為重量百分數(shù)，PH6.0～6.4。
3.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是在發(fā)酵時，采用普通發(fā)酵罐，將二級種通過無菌移種管道接入發(fā)酵罐中，溫度24～30℃，風量1∶1.5，在400～600轉(zhuǎn)/分攪拌的情況下，發(fā)酵96～120小時，在發(fā)酵至48小時時加入一些胺類或雜環(huán)類氮化合物抑制番茄紅素的環(huán)化。
4.根據(jù)權利要求3所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是胺類或雜環(huán)類氮化合物為砒啶或咪唑或煙堿或其衍生物類代謝阻斷劑。
5.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是發(fā)酵用的培養(yǎng)基為淀粉24％，豆餅粉2～4％，玉米漿3～7％及少量的微量元素，其余為水，單位重量百分數(shù)，PH6.4～6.7。
6.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是在提取時，先收集菌體采用離心或板框壓濾技術收集濕菌體，濕菌體經(jīng)70～80℃加熱真空干燥，獲得富含天然番茄紅素的干菌粉，再利用萃取劑萃取按萃取劑與干菌粉之比為1∶10的比例進行回流萃取；然后結(jié)晶。
7.根據(jù)權利要求6所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是萃取劑為植物油或有機溶劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是有機溶劑為6#溶劑油或丙酮或乙醚或石油醚或環(huán)己烷或正己烷或二硫化碳或乙酸乙酯。
9.根據(jù)權利要求7所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是將萃取濃縮液加入1倍體積的乙醇，置于0～10℃、經(jīng)24小時析出含40％番茄紅素的結(jié)晶粗品，將所得的粗品用氯仿溶解過濾后，加入2倍體積無水乙醇，在0～10℃的溫度下重結(jié)晶，得到含量在60～70％以上的番茄紅素純品，經(jīng)多次重結(jié)晶得到含量在90％以上的番茄紅素精品。
10.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝，其特征是一級種采用搖瓶培養(yǎng)；二級種培養(yǎng)及發(fā)酵工序均采用普通生物反應器。
全文摘要
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素的制備方法，尤其是指一種采用絲狀真菌三孢布拉霉進行發(fā)酵制備天然番茄紅素的工藝。本方法包括a.一級種培養(yǎng)；b.二級種培養(yǎng)；c.發(fā)酵；d.提取，其特征是一級種培養(yǎng)時，將保藏在土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上能代謝產(chǎn)生番茄紅素的三孢布拉霉兩性菌種，分別接入裝有種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，在24～30℃、160～180轉(zhuǎn)/分鐘條件下，進行振蕩培養(yǎng)44～48小時；在二級種的培養(yǎng)特時，將分別培養(yǎng)好的三孢布拉霉兩性菌種的一級種按1∶1的比例混合后，接入種子罐內(nèi)進行擴大培養(yǎng)，作為發(fā)酵用的種子，培養(yǎng)條件為溫度24～30℃，通風量1∶1，培養(yǎng)時間為24～48小時。本方法工藝簡單，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境無污染，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P5/00GK1528906SQ0313507
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月30日 優(yōu)先權日2003年9月30日
發(fā)明者單志萍, 孟妤, 陸茂林, 胡幼敏 申請人:江蘇省微生物研究所