專利名稱：病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體的講是一種基因芯片——病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎是一種發(fā)病率極高、對人類健康危害極大的傳染性疾病，目前發(fā)現(xiàn)的就有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七種類型，以及由這些病毒感染引起的肝硬化、肝癌等。我國是肝炎的高發(fā)區(qū)，全國僅乙型肝炎病毒感染者達1.3億以上，每年的發(fā)病率在6000萬人次。有資料表明，乙型肝炎特定基因變異與病毒耐藥有很大相關(guān)性。因此，對病毒性肝炎快速、有效的診斷是預(yù)防和治療肝炎的必要條件。
目前在臨床上已開展的實驗室診斷方法主要有三大類，即組織培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法(酶聯(lián)免疫吸附ELISA和放射免疫法RIA)以及基因診斷技術(shù)(斑點雜交和聚合酶鏈反應(yīng)PCR)。這些方法對病毒性肝炎的診斷起到了非常積極的作用，但存在不足之處(1)組織培養(yǎng)法對實驗室條件要求高，周期長，而且只能區(qū)分病毒的種；(2)ELISA和RIA檢驗往往只能間接推測病毒在體內(nèi)的感染狀況，不能直接判斷病毒是否存在以及存在數(shù)量；(3)PCR和斑點雜交雖可直接檢測病毒基因組本身，甚至可以用來分析基因型和變異株，但由于對儀器、試劑及場地等要求條件較高，以及方法學(xué)上尚有欠妥之處，難以標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致符合率差等原因而被國家暫時取消，并且從目前已獲得的結(jié)果看，各實驗室之間利用基因診斷技術(shù)檢測肝炎病毒的結(jié)果很難取得一致，也缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；(4)而且，所有這些方法都有一大缺陷，就是效率低。一次只能檢測一種病原體或某種病原體的一項指標(biāo)。而現(xiàn)實的情況是，多種肝炎病毒可同時存在并感染人體。為此，急需發(fā)展一種標(biāo)準(zhǔn)化的程序和方法，并能夠一次性地診斷出所感染的微生物的種類，以利于正確、快速地采取治療措施。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其目的在于解決病毒性肝炎的檢測對實驗室條件、儀器、試劑要求高、檢測效率低、診斷不準(zhǔn)確等方面存在的問題。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來加以實現(xiàn)的一種病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，依次分別固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七種類型的病毒型肝炎及其常見亞型的具有診斷意義的探針。
在該芯片的微陣列中，設(shè)有質(zhì)控探針和多個乙肝耐藥分析探針。
探針的大小為15-20個堿基，設(shè)計75個探針，所設(shè)計的探針序列見下文；本發(fā)明制備工藝按如下步驟進行(1)、病毒性肝炎特異性探針和引物；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的病毒基因序列以及耐藥特征序列，根據(jù)所述的探針序列設(shè)計探針；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的病毒基因序列以及耐藥特征序列，為了準(zhǔn)確診斷甲型肝炎，用引物5`-GTTGCTGTACAAAACCT，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`反轉(zhuǎn)錄擴增甲型肝炎病毒670-890 cDNA序列，選擇5`-caaatgctatgttgtccactgagtc，5`-caaatgccatgttgtccactg甲型肝炎病毒cDNA序列最為寡核苷酸探針，檢測所有的甲型肝炎病毒；用引物5`-GTGCCATTTGTTCAGTG，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`擴增乙型肝炎病毒的部分S基因686-991片斷，利用33個寡核苷酸探針鑒別乙肝病毒acute、chronic、adr、adyw、carcinoma、negtive、anti-drug、adw2、adw、wild、ayw基因亞型。為了提高丙型病毒性肝炎的檢測靈敏度，采用巢式PCR對丙型肝炎病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，用兩對引物5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`，5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`擴增丙型肝炎病毒33-290序列片斷；用寡核苷酸探針5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC、5`-TGGATCAACCCGCTCAATG鑒別丙型病毒肝炎病毒特征序列；用引物5`-CCTTCAGCGAACAGAG、TGAATAGCAGGGGTGT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增丁型肝炎病毒321-502cDNA序列片斷，用十個寡核苷酸探針鑒別丁肝病毒Acute、Quebec、Venezuela、Italy、C.A.P、African、Smalian、TW2476基因亞型；用引物5`-CGGTCAGCCGTCTG、CGAACCGCACTGGT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增戊型肝炎病毒的cDNA 5212-5415基因片斷，選取四個寡核苷酸探針鑒別戊肝Chinese、JRA1、Indian基因亞型；用引物5`-TGGTAGGTCGTAAATCC、ACTGTTCCTGGTCACC-5`反轉(zhuǎn)錄擴增庚型肝炎病毒cDNA136-401基因片斷，選取五條寡核苷酸探針鑒別Iowan、China、HGVCN、USA、PNF2161庚肝病毒的基因亞型；篩選引物5`-CTGCAATCCATGTATGAT、ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增TTV病毒cDNA1393-1697序列片斷，用寡核苷酸探針5`-AGCAACAACATGGGCATCATAC、5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC識別TTV病毒基因序列。
(2)、合成探針；(3)、制備芯片；用去離子水將合成的探針溶解，得到濃度為200mmol/l的溶液，在玻璃基片上進行點樣；點好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次，吹干備用。
對待測血樣的預(yù)處理過程中，PCR擴增引物序列見下文；在合成探針的步驟中，探針5’端加氨基修飾。
點樣從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右。
探針緩沖液為1xSSC，0.1％SDS；封閉液為1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
使用方法按如下步驟進行(1).處理樣品；取病人腦脊液少量，分別提取DNA，備用；如需長時間放置，在-20℃下凍存；(2).PCR擴增在反應(yīng)管中加入擴增反應(yīng)混合物——Taq酶，相應(yīng)的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素Cy3標(biāo)記的dUTP；擴增條件如下94℃5min94℃30sec56℃30sec72℃1min72℃5min以上步驟為30～35個循環(huán)；(3).雜交；PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
(4).檢測；用掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果；(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結(jié)果輸出。
3、優(yōu)點及效果基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進展之一，它是物理學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、精密機械與生命科學(xué)交叉綜合的高科技?；蛐酒傻牟皇请娮釉骷?，采用在位組合化學(xué)、微電子芯片光刻技術(shù)，或者利用其它方法將大量特定序列的DNA探針有序地固定在基片上，在與待測樣品DNA作用后，即可檢測到大量的生命信息，包括基因識別、基因突變和基因表達等。利用基因芯片可以快速、高效地獲取或處理大量的生命信息，它對生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷、新藥篩選和司法鑒定等具有革命性的推動作用。
本發(fā)明提供了一種病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片。將已經(jīng)合成的特異性探針以矩陣的形式固定于基片表面，通過芯片與待測樣本DNA雜交，即可獲取大量與肝炎病毒相關(guān)的生物學(xué)信息。利用這種芯片，通過一次操作就可以同時完成七種肝炎病毒型及其亞型的檢測，并對常用藥物進行耐藥特性分析。該基因芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性高、信息量大的特點。如果將此芯片成功應(yīng)用于臨床，必將帶來極大的經(jīng)濟效益和社會效益。
具體實施例方式本發(fā)明實施的具體步驟是1.設(shè)計病毒特異性探針和引物從NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得可靠的病毒基因序列以及耐藥特征序列等，利用生物信息學(xué)生物軟件設(shè)計引物和特異性的探針。
用生物信息學(xué)相關(guān)軟件嚴(yán)格篩選探針序列。為了準(zhǔn)確診斷甲型肝炎，用引物5`-GTTGCTGTACAAAACCT，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`反轉(zhuǎn)錄擴增甲型肝炎病毒670-890cDNA序列，選擇5`-caaatgetatgttgtccactgagtc，5`-caaatgccatgttgtccactg甲型肝炎病毒cDNA序列最為寡核苷酸探針，檢測所有的甲型肝炎病毒。用引物5`-GTGCCATTTGTTCAGTG，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`擴增乙型肝炎病毒的部分S基因686-991片斷，利用33個寡核苷酸探針鑒別乙肝病毒acute、chronic、adr、adyw、carcinoma、negtive、anti-drug、adw2、adw、wild、ayw基因亞型。為了提高丙型病毒性肝炎的檢測靈敏度，采用巢式PCR對丙型肝炎病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，用兩對引物5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`，5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`擴增丙型肝炎病毒33-290序列片斷。用寡核苷酸探針5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC、5`-TGGATCAACCCGCTCAATG鑒別丙型病毒肝炎病毒特征序列。用引物5`-CCTTCAGCGAACAGAG、TGAATAGCAGGGGTGT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增丁型肝炎病毒321-502 cDNA序列片斷，用十個寡核苷酸探針鑒別丁肝病毒Acute、Quebec、Venezuela、Italy、C.A.P、African、Smalian、TW2476基因亞型。用引物5`-CGGTCAGCCGTCTG、CGAACCGCACTGGT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增戊型肝炎病毒的cDNA 5212-5415基因片斷，選取四個寡核苷酸探針鑒別戊肝Chinese、JRA1、Indian基因亞型。用引物5`-TGGTAGGTCGTAAATCC、ACTGTTCCTGGTCACC-5`反轉(zhuǎn)錄擴增庚型肝炎病毒cDNA 136-401基因片斷，選取五條寡核苷酸探針鑒別Iowan、China、HGVCN、USA、PNF2161庚肝病毒的基因亞型。篩選引物5`-CTGCAATCCATGTATGAT、ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增TTV病毒cDNA1393-1697序列片斷，用寡核苷酸探針5`-AGCAACAACATGGGCATCATAC、5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC識別TTV病毒基因序列。
2.合成探針由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
3.制備基片根據(jù)需要設(shè)定點樣程序，矩陣分布根據(jù)探針雜交動力學(xué)要求及點樣方便與否安排。用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l。使用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，用BioRobotics公司的點樣儀按預(yù)先設(shè)定好的程序進行點樣。按照不同要求從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右，點間距依點的數(shù)量而定。點好的芯片于37℃下水化12小時，然后在80℃下烘干2小時。以探針緩沖液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝70.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
上述病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片的應(yīng)用方法包括以下步驟1.處理樣品取待檢血樣100℃水浴10分鐘，驟然冷卻至0℃，13000G離心5分鐘，取上清備用。如需長時間放置，在-20℃下凍存。
2.PCR或RT-PCR擴增在反應(yīng)管中加入擴增反應(yīng)混合物，相應(yīng)的Taq酶(乙型肝炎病毒)和/或反轉(zhuǎn)錄酶，處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素(Cy3)標(biāo)記的dUTP。擴增條件如下(反轉(zhuǎn)錄條件42℃ 30min)94℃5min94℃30sec
56℃40sec72℃1min72℃5min以上步驟為30個循環(huán)；3.雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在50℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
4.檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果。
5.數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件檢芯片結(jié)果輸出。
以下結(jié)合具體的實施例對發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明實施例1設(shè)計肝炎病毒引物及特異性探針75個。探針的大小為15-20個堿基。由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
制備基因芯片用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，使用BioRobotics公司的點樣儀按預(yù)先設(shè)定好的程序進行點樣。用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l。點好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時。以探針緩沖液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
處理血樣取臨床檢驗結(jié)果為乙肝患者(S抗原陽性、e抗原陽性、c抗原陽性)靜脈血3-5毫升，100℃水浴10分鐘，驟然冷卻至0℃，13000G離心5分鐘，取上清備用。
PCR擴增采用的引物序列是5`-GTGCCATTTGTTCAGTG、GGATAACTAACCTTTCACA-5`反應(yīng)總體積為20μl，在反應(yīng)管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.2μl，處理好的樣品0.8μl和上下游引物各2μl，dNTP0.8μl以及Cy3標(biāo)記的dUTP1.2μl，其余的用H2O。擴增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec
56℃ 40sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個循環(huán)；雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果。
數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片結(jié)果輸出。與臨床檢驗結(jié)果比較，符合率100％。
實施例2探針引物設(shè)計以及芯片制作同實施例1。
處理血樣取臨床檢驗結(jié)果為丙肝患者(丙肝抗原陽性)靜脈血3-5毫升，用華美公司丙肝檢測試劑盒抽提丙肝病毒RNA，備用。
RT-PCR擴增采用的引物序列是5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`反應(yīng)總體積為20μl，在反應(yīng)管中加入10X buffer 2μl，MgCl24μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.75μl，處理好的樣品0.8μl和引物2.5μl，dNTP2.0μl，其余的用H2O。
42℃下反應(yīng)45min，然后95℃下10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
PCR擴增采用的引物序列是5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`反應(yīng)總體積為20μl，在反應(yīng)管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.5μl，上一步反應(yīng)產(chǎn)物8.0μl和上下游引物各2.5μl，dNTP0.4μl以及Cy3標(biāo)記的dUTP1.2μl，其余的用H2O。擴增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec72℃ 30sec72℃ 5min以上步驟為35個循環(huán)；
雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果。
數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片結(jié)果輸出。與臨床檢驗結(jié)果比較，符合率100％。
病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片引物及探針序列表病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片引物序列表甲肝引物 SequnceSeq No.
primer1.15`-TCCACATTTGGATTGG670primer1.2GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5` 890乙肝引物 SequnceSeq No.
primer2.35`-GTGCCATTTGTTCAGTG 686primer2.4GGATAACTAACCTTTCACA-5` 991丙肝引物 SequnceSeq No.
outer Primer3.3 5`-GGCGACACTCCACCATAGATC 6outer Primer3.4 TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5` 329iner primer3.5 5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG33iher primer3.6 AACACCATGACGGACTATCCCA-5` 290丁肝引物 SequnceSeq No.
primer4.15`-CCTTCAGCGAACAGAG321primer4.2TGAATAGCAGGGGTGT-5`502戊肝引物 SequnceSeq No.
primer5.15`-CGGTCAGCCGTCTG 5212primer5.2CGAACCGCACTGGT-5` 5415庚肝引物 SequnceSeq No.
Primer6.15`-TGGTAGGTCGTAAATCC 136Primer6.2ACTGTTCCTGGTCACC-5`401TTV引物 SequnceSeq No.
Premer7.15`-CTGCAATCCATGTATGAT 1393Premer7.2ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`1697病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片探針序列表甲肝探針 SequnceSeq No.Gene typeProbe1.1 5`-caaatgctatgttgtccactgagtc 797HAVProbe1.2 5`-caaatgccatgttgtccactg 797HAV乙肝探針Seq No.
ProbeSequnce611 Gene typeProbe2.1 5`-ATCCCATCATCCTGGGCTTT611 acute，adr，adyw，carcin
oma，negtive，Probe2.25`-CCCATCATCTTTGGCTTTCG611 anti-drugProbe2.35`-ATCCCATCGTCCTGGGCT 611 anti-drug，adw2Probe2.45`-ATCCCATCATCTTGGGCTTTC 611 chronic，adw，wildProbe2.55`-ATCCCATCATCTTGGGGTTTC 623 aywProbe2.65`-TGGGCTTTCGGAAAATTCC 623 adywacute，adr，carcinoma，nProbe2.75`-TGGGCTTTCGCAAGATTCC 623 egtive，Probe2.85`-TTGGCTTTCGCAAGATTCCT623 anti-druganti-drug，adw，adw2，wProbe2.95`-TGGGCTTTCGCAAAATACCT623 ildProbe2.10 5`-TGGGCTTTCGCAAAATTC 656 chronic，adw，wildProbe2.11 5`-TCAGCCCGTTTCTCTTGGC 656 adywProbe2.12 5`-CAGCCCGTTTCTCCTGGC 652 carcinomaProbe2.13 5`-GGCCTCGGTCCGTTTCTC negtiveadr，careinoma，adyw，chroniProbe2.14 5`-TGGTTCGTAGGGCTTTCCC 701 c，adw，adw2，wild，anti-drugProbe2.15 5`-AGTGGTTCGCAGGGCTTTC 730 acute，ayw，negtiveacute，negtive，carcinoma，adyw，chronic，adw，Probe2.16 5`-GCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGT 730 wildProbe2.17 5`-CTTTCAGTTATATGGATGATCTGGTATT730 aywProbe2.18 5`-CTTTCAGCTATATGGATGATGTGGT 730 adw2Probe2.19 5`-CTTTCAGTTATANGGATGACGTGG730 anti-drugProbe2.20 5`-GCTTTCAGCTATATAGATGATGTGGTA 769 anti-drugProbe2.21 5`-TCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTT769 adywacute，carcinoma，negtiProbe2.22 5`-TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 769 ve，ayw，adw，wildProbe2.23 5`-TCTGTGCAACATCTTGAGTCCC 769 chronicProbe2.24 5`-TCTGTACAGCATCGTGAGTCCC 769 adw2Probe2.25 5`-TCTGTACAACATCTTGAATCCCTTT 931 adrProbe2.26 5`-CACAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAA 931 adywProbe2.27 5`-TTAAAACTCAAACAATGTTTTCGGA 931 acute，negtiveProbe2.28 5`-CTAAAACTCAAGCAATGTTTTCGAA 931 adrProbe2.29 5`-CTCAAAATTAAGCAATGTTTTCGAA 931 carcinomaProbe2.30 5`-CAAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAA 931 chronicProbe2.31 5`-CACAAACTCAAACACTGTTTTAGAAAA 931 aywProbe2.31 5`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAAA 931 adwProbe2.32 5`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGA 931 wildProbe2.33 5`-CAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAAA adw2丙肝探針SequnceSeq No.Gene typeProbe3.15`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC 272HCV
Probe3.25`-TGGATCAACCCGCTCAATG 187HCV丁肝探針SequnceSeq No.Gene typeProbe4.15`-GAGCGCATCGCAGAGGG336Quebec hdvProbe4.25`-GAGCGCATCGCGAGAGG336Venezuela hdvProbe4.35`-GGGGCGCATCGCGA 336Acute hdvProbe4.45`-GAGCGCTCGGGTGGTAGG 336Italy hdvprobe4.55`-AGCTCTGACGCGCGAGG336TW2667Probe4.65`-GACCCTGGTACCGGGGG336VenzuelaProbe4.75`-AGGCGCTTCGAGCGGTA336C.A.PProbe4.85`-AGACTCTCTTCCCGGTGGGA 336AfricanProbe4.95`-GGCTCTCTCACGCGGTAGG 336SmalianProbe4.10 5`-GAGCTCCCTCCTCCTCCTTC 336TW2476戊肝探針Sequnce Seq No.Gene typeProbe5.15`-GGACCTCGTGTTCGCCAAC 5363HDVProbe5.25`-GCCCTCGGCAGCCAAT 5369ChineseProbe5.35`-CCTCGACAGCCGCCCC 5372JRA1Probe5.45`-GACCTCGCGTTCGCCAA5363Indian庚肝探針SequnceSeq No. Gene typeProbe6.15`-AGCCCGTCACCCACCTG296Iowan，ChinaProbe6.25`-GCCCGTAACCCGCCTG 296SerumProbe6.35`-GCCCATTACCCACCTGGG 296HGVCNProbe6.45`-AGCCCGTTACCCACCTGG 296USA，PNF2161Probe6.55`-TACGGTCCACGTCGCCC330HGVTTV探針Sequnce Seq No. Gene typeProbe7.15`-AGCAACAACATGGGCATCATAC 1560TTVProbe7.25`-AGCAACAACATGGGGATCATAC 1560pTZVT41權(quán)利要求
1.一種病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，依次分別固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七種類型的病毒型肝炎及其常見亞型的具有診斷意義的探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于在該芯片的微陣列中，設(shè)有質(zhì)控探針和多個乙肝耐藥分析探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于探針的大小為15-20個堿基，設(shè)計75個探針，所設(shè)計的探針序列如下甲肝探針Sequnce Seq No.Gene typeProbe1.15`-caaatgctatgttgtccactgagtc 797HAVProbe1.25`-caaatgccatgttgtccactg 797HAV乙肝探針Seq No.Probe Sequnce 611 Gene typeacute，adr，adyw，carcinProbe2.15`-ATCCCATCATCCTGGGCTTT 611 oma，negtive，Probe2.25`-CCCATCATCTTTGGCTTTCG 611 anti-drugProbe2.35`-ATCCCATCGTCCTGGGCT611 anti-drug，adw2Probe2.45`-ATCCCATCATCTTGGGCTTTC 611 chronic，adw，wildProbe2.55`-ATCCCATCATCTTGGGGTTTC 623 aywProbe2.65`-TGGGCTTTCGGAAAATTCC 623 adywacute，adr，carcinoma，nProbe2.75`-TGGGCTTTCGCAAGATTCC 623 egtive，Probe2.85`-TTGGCTTTCGCAAGATTCCT 623 anti-druganti-drug，adw，adw2，wProbe2.95`-TGGGCTTTCGCAAAATACCT 623 ildProbe2.10 5`-TGGGCTTTCGCAAAATTC656 chronic，adw，wildProbe2.11 5`-TCAGCCCGTTTCTCTTGGC 656 adywProbe2.12 5`-CAGCCCGTTTCTCCTGGC652 carcinomaProbe2.13 5`-GGCCTCGGTCCGTTTCTCnegtiveadr，carcinoma，adyw，chroniProbe2.14 5`-TGGTTCGTAGGGCTTTCCC 701 c，adw，adw2，wild，anti-drugProbe2.15 5`-AGTGGTTCGCAGGGCTTTC 730 acute，ayw，negtiveacute，negtive，carcinoma，adyw，chronic，adw，Probe2.165`-GCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGT 730wildProbe2.175`-CTTTCAGTTATATGGATGATCTGGTATT730aywProbe2.185`-CTTTCAGCTATATGGATGATGTGGT 730adw2Probe2.195`-CTTTCAGTTATANGGATGACGTGG730anti-drugProbe2.205`-GCTTTCAGCTATATAGATGATGTGGTA 769anti-drugProbe2.215`-TCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTT769adywacute，carcinoma，negtiProbe2.225`-TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 769ve，ayw，adw，wildProbe2.235`-TCTGTGCAACATCTTGAGTCCC 769chronicProbe2.245`-TCTGTACAGCATCGTGAGTCCC 769adw2Probe2.255`-TCTGTACAACATCTTGAATCCCTTT 931adrProbe2.265`-CACAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAA 931adywProbe2.275`-TTAAAACTCAAACAATGTTTTCGGA 931acute，negtiveProbe2.285`-CTAAAACTCAAGCAATGTTTTCGAA 931adrProbe2.295`-CTCAAAATTAAGCAATGTTTTCGAA 931carcinomaProbe2.305`-CAAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAA 931chronicProbe2.315`-CACAAACTCAAACACTGTTTTAGAAAA 931aywProbe2.315`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAAA 931adwProbe2.325`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGA 931wildProbe2.335`-CAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAAAadw2丙肝探針 SequnceSeq No.Gene typeProbe3.1 5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC272HCVProbe3.2 5`-TGGATCAACCCGCTCAATG 187HCV丁肝探針 SequnceSeq No.Gene typeProbe4.1 5`-GAGCGCATCGCAGAGGG336Quebec hdvProbe4.2 5`-GAGCGCATCGCGAGAGG336Venezuela hdvProbe4.3 5`-GGGGCGCATCGCGA 336Acute hdvProbe4.4 5`-GAGCGCTCGGGTGGTAGG 336Italy hdvprobe4.5 5`-AGCTCTGACGCGCGAGG336TW2667Probe4.6 5`-GACCCTGGTACCGGGGG336VenzuelaProbe4.7 5`-AGGCGCTTCGAGCGGTA336C.A.PProbe4.8 5`-AGACTCTCTTCCCGGTGGGA 336AfricanProbe4.9 5`-GGCTCTCTCACGCGGTAGG 336SmalianProbe4.105`-GAGCTCCCTCCTCCTCCTTC 336TW2476戊肝探針 SequnceSeq No.Gene typeProbe5.1 5`-GGACCTCGTGTTCGCCAAC 5363HDVProbe5.2 5`-GCCCTCGGCAGCCAAT 5369ChineseProbe5.3 5`-CCTCGACAGCCGCCCC 5372JRA1Probe5.45`-GACCTCGCGTTCGCCAA5363Indian庚肝探針Sequnce Seq No.Gene typeProbe6.15`-AGCCCGTCACCCACCTG296Iowan，ChinaProbe6.25`-GCCCGTAACCCGCCTG 296SerumProbe6.35`-GCCCATTACCCACCTGGG 296HGVCNProbe6.45`-AGCCCGTTACCCACCTGG 296USA，PNF2161Probe6.55`-TACGGTCCACGTCGCCC330HGVTTV探針 Sequnce Seq No.Gene typeProbe7.15`-AGCAACAACATGGGCATCATAC 1560TTVProbe7.25`-AGCAACAACATGGGGATCATAC 1560pTZVT416
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于本發(fā)明制備工藝按如下步驟進行(1)、設(shè)計病毒性肝炎特異性探針和引物；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的病毒基因序列以及耐藥特征序列，根據(jù)所述的探針序列設(shè)計探針；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的病毒基因序列以及耐藥特征序列，為了準(zhǔn)確診斷甲型肝炎，用引物5`-GTTGCTGTACAAAACCT，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`反轉(zhuǎn)錄擴增甲型肝炎病毒670-890 cDNA序列，選擇5`-caaatgctatgttgtccactgagtc，5`-caaatgccatgttgtccactg甲型肝炎病毒cDNA序列最為寡核苷酸探針，檢測所有的甲型肝炎病毒；用引物5`-GTGCCATTTGTTCAGTG，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`擴增乙型肝炎病毒的部分S基因686-991片斷，利用33個寡核苷酸探針鑒別乙肝病毒acute、chronic、adr、adyw、carcinoma、negtive、anti-drug、adw2、adw、wild、ayw基因亞型。為了提高丙型病毒性肝炎的檢測靈敏度，采用巢式PCR對丙型肝炎病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，用兩對引物5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`，5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`擴增丙型肝炎病毒33-290序列片斷；用寡核苷酸探針5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC、5`-TGGATCAACCCGCTCAATG鑒別丙型病毒肝炎病毒特征序列；用引物5`-CCTTCAGCGAACAGAG、TGAATAGCAGGGGTGT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增丁型肝炎病毒321-502cDNA序列片斷，用十個寡核苷酸探針鑒別丁肝病毒Acute、Quebec、Venezuela、Italy、C.A.P、African、Smalian、TW2476基因亞型；用引物5`-CGGTCAGCCGTCTG、CGAACCGCACTGGT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增戊型肝炎病毒的cDNA 5212-5415基因片斷，選取四個寡核苷酸探針鑒別戊肝Chinese、JRA1、Indian基因亞型；用引物5`-TGGTAGGTCGTAAATCC、ACTGTTCCTGGTCACC-5`反轉(zhuǎn)錄擴增庚型肝炎病毒cDNA136-401基因片斷，選取五條寡核苷酸探針鑒別Iowan、China、HGVCN、USA、PNF2161庚肝病毒的基因亞型；篩選引物5`-CTGCAATCCATGTATGAT、ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`反轉(zhuǎn)錄擴增TTV病毒cDNA1393-1697序列片斷，用寡核苷酸探針5`-AGCAACAACATGGGCATCATAC、5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC識別TTV病毒基因序列；擴增及擴增同時標(biāo)注熒光素；(2)、合成探針；(3)、制備芯片；用去離子水將合成的探針溶解，得到濃度為200mmol/l的溶液，在玻璃基片上進行點樣；點好的芯片于37C下水化3天，然后在80C下烘干2小時；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次，吹干備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于對待測血樣的預(yù)處理過程中，PCR擴增引物序列如下甲肝引物 Sequnce Seq No.primer1.15`-TCCACATTTGGATTGG 670primer1.2GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5` 890乙肝引物 Sequnce Seq No.primer2.35`-GTGCCATTTGTTCAGTG686primer2.4GGATAACTAACCTTTCACA-5` 991丙肝引物 Sequnce Seq No.outer Primer3.3 5`-GGCGACACTCCACCATAGATC6outer Primer3.4 TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`329iner primer3.5 Y-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG 33iner primer3.6 AACACCATGACGGACTATCCCA-5` 290丁肝引物 Sequnce Seq No.primer4.15`-CCTTCAGCGAACAGAG 321primer4.2TGAATAGCAGGGGTGT-5` 502戊肝引物 Sequnce Seq No.primer5.15`-CGGTCAGCCGTCTG5212primer5.2CGAACCGCACTGGT-5`5415庚肝引物 Sequnce Seq No.Primer6.15`-TGGTAGGTCGTAAATCC 136Primer6.2ACTGTTCCTGGTCACC-5` 401TTV引物 Sequnce Seq No.Premer7.15`-CTGCAATCCATGTATGAT1393Premer7.2ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5` 1697
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于在合成探針的步驟中，探針5’端加氨基修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于點樣從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于探針緩沖液為1xSSC，0.1％SDS；封閉液為1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進行(1).處理樣品；取病人腦脊液少量，分別提取DNA，備用；如需長時間放置，在-20℃下凍存；(2).PCR引物擴增在反應(yīng)管中加入擴增反應(yīng)混合物——Taq酶，相應(yīng)的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素Cy3標(biāo)記的dUTP；擴增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30～35個循環(huán)；(3).雜交；PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。(4).檢測；用掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果；(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結(jié)果輸出。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體地講是一種基因芯片——病毒性肝炎集成診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七種類型的肝炎病毒型及亞型的特異性探針，同時另設(shè)有質(zhì)控探針和多個乙型肝炎耐藥分析探針。利用相應(yīng)探針與經(jīng)擴增并加入熒光標(biāo)記的肝炎病毒DNA或cDNA雜交，經(jīng)掃描儀掃描芯片，并對雜交信號進行分析，獲得有關(guān)信息。這種芯片能同時檢測七種病毒性肝炎，并分析其亞型及耐藥特性，具有診斷快速準(zhǔn)確、特異性高、信息量大的特點，對臨床診斷和流行病學(xué)篩查都有很大幫助。
文檔編號C12Q1/04GK1515689SQ0311145
公開日2004年7月28日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者趙雨杰, 何群, 侯偉健, 張玉魁, 王紹成, 潘忠誠, 王天驕, 馬佳明, 馬汝海 申請人:趙雨杰, 何群, 侯偉健, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 潘忠誠, 王天驕, 馬佳明