專利名稱：一種腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體的講是一種腦膜炎檢測基因芯片及其制備工藝和使用方法。
背景技術(shù)：
腦膜炎是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其致病微生物種類多種多樣。僅常見的致病菌即近十種，治療不當(dāng)會危及生命，因而快速準(zhǔn)確的診斷對及時(shí)恰當(dāng)?shù)奶幹闷鹬陵P(guān)重要的作用。而不同種屬、甚至不同亞型的細(xì)菌致病力與耐藥性均不同，給臨床治療帶來很大困難。病毒性腦膜炎雖然在臨床癥狀上與之非常相近，卻是一種自限性疾病，抗生素治療幾乎無效。是細(xì)菌性還是病毒性腦膜炎，臨床醫(yī)生幾乎不可能做出肯定的診斷，屢屢處于兩難的境地。因此，患者必須住院觀察，予靜脈抗生素治療，直到腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果出來后再行處置。這個(gè)過程通常要花費(fèi)48到72小時(shí)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90％以上的腦膜炎都是由病毒引起的。這段時(shí)間不僅造成醫(yī)療護(hù)理人力物力的巨大浪費(fèi)，還可能導(dǎo)致誤治。而且少數(shù)病例是由真菌等其他微生物所致，更增加了臨床診斷的難度。
傳統(tǒng)檢測腦脊液的方法包括革蘭氏染色，基于抗體的免疫學(xué)檢測和細(xì)菌培養(yǎng)等。鏡檢簡單快速，卻需要有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)菌?？贵w檢測雖然速度較快，但一次只能檢測一種抗體，效率低。細(xì)菌培養(yǎng)將靈敏度提高了，培養(yǎng)時(shí)間卻成為不可逾越的障礙。而且抗生素的應(yīng)用還可以造成革蘭氏染色及細(xì)菌培養(yǎng)的假陰性結(jié)果。發(fā)明一種高效高靈敏度的腦脊液檢測方法成為必須。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其目的在于解決腦膜炎檢測中存在的效率低、診斷不準(zhǔn)確等方面存在的問題。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來加以實(shí)現(xiàn)的一種腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于該芯片是玻璃基片上分布有不同區(qū)域的微陣列，在每個(gè)微陣列區(qū)域中分別固定有常見的腦膜炎致病微生物的特異性探針。
探針的大小為15-30個(gè)堿基，設(shè)計(jì)61個(gè)探針，所設(shè)計(jì)的探針序列見后文；本發(fā)明制備工藝按如下步驟進(jìn)行(1)設(shè)計(jì)腦膜炎特異性探針和引物；
從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的腦膜炎致病微生物基因序列，根據(jù)所述的探針序列設(shè)計(jì)探針；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的腦膜炎致病微生物基因序列，設(shè)計(jì)如下PCR引物，針對病毒病原微生物基因片段進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增引物序列見后文；(2)、合成探針；(3)、制備芯片；用去離子水將合成的探針溶解，得到濃度為200mmol/l的溶液，在玻璃基片上進(jìn)行點(diǎn)樣；點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時(shí)；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次，吹干備用。
在合成探針的步驟中，探針5’端加氨基修飾。
點(diǎn)樣從幾十點(diǎn)到上千點(diǎn)，點(diǎn)的大小為50-100微米左右。
探針緩沖液為1xSSC，0.1％SDS；封閉液為1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
使用方法按如下步驟進(jìn)行(1).處理樣品；取病人腦脊液少量，分別提取DNA，備用；如需長時(shí)間放置，在-20℃下凍存；(2).PCR擴(kuò)增在反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物——Taq酶，相應(yīng)的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素Cy3標(biāo)記的dUTP擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個(gè)循環(huán)，(3).雜交；PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時(shí)，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1，洗滌3次。
(4).檢測；用掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果；
(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結(jié)果輸出。
3、優(yōu)點(diǎn)及效果基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時(shí)代特征的重大科技進(jìn)展之一，它是物理學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、精密機(jī)械與生命科學(xué)交叉綜合的高科技?；蛐酒傻牟皇请娮釉骷?，采用在位組合化學(xué)、微電子芯片光刻技術(shù)，或者利用其它方法將大量特定序列的DNA探針有序地固定在基片上，在與待測樣品DNA作用后，即可檢測到大量的生命信息，包括基因識別、基因突變和基因表達(dá)等。利用基因芯片可以快速、高效地獲取或處理大量的生命信息，它對生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷、新藥篩選和司法鑒定等具有革命性的推動作用。
本發(fā)明提供了一種腦膜炎檢測芯片。將已經(jīng)合成的特異性探針矩陣固定于基片表面，通過芯片與待測樣本DNA雜交，即可獲取大量與腦膜炎致病微生物相關(guān)的生物學(xué)信息。利用這種芯片，通過一次操作就可以同時(shí)完成腦膜炎致病微生物的檢測。該基因芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性高、信息量大的特點(diǎn)。如果將此芯片成功應(yīng)用于臨床，必將帶來極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施的具體步驟是1.設(shè)計(jì)腦膜炎特異性探針和引物從NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得可靠的腦膜炎致病微生物基因序列等，利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物和特異性的探針。針對病毒病原微生物(病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)61個(gè)探針鑒別病毒(hhv1、hhv2、hhv3、hhv4、hhv5、hhv6、hhv7、coxsackievirus a9、coxsackievirus b4、coxsackievirus b5、echovirus22、poliovirus、la cross、St.louis、venezuelanequine、west nile、western equine、Japanese B、central european、russian、Powassan、Dengue、Mumps、Measles、Adenovirus、LCMV、HIV-1、HIV-2、inluenza-a、inluenza-b、htlv-1、htlv-2、togavirus、Rickettsia typhi、Parvovirus B19)；細(xì)菌(Tropheryma whippelii、Borrelia afzelii、Bartonella henselae、Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melitensis、Brucella suis、Borreliaburgdorferi、Escherichia coli、Borrelia garinii、Streptococcus pneumoniae R6、Haemophilusinfluenzae Rd、Leptospira interrogans、Bacillus subtilis、Streptococcus milleri、Mycobacteriumtuberculosis、Mycoplasma PG50、Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae)；真菌(Cryptococcus)；原蟲(Acanthamoeba sp.、Naegleriajamiesoni、Toxoplasma gondii)病原微生物。
2.合成探針可以由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
3.制備芯片根據(jù)需要設(shè)定點(diǎn)樣程序，矩陣分布根據(jù)探針雜交動力學(xué)要求及點(diǎn)樣方便與否安排。用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l。使用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，用BioRobotics公司的點(diǎn)樣儀按預(yù)先設(shè)定好的程序進(jìn)行點(diǎn)樣。按照不同要求從幾十點(diǎn)到上千點(diǎn)，點(diǎn)的大小為50-100微米左右，點(diǎn)間距依點(diǎn)的數(shù)量而定。點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時(shí)。以探針緩沖液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
上述腦膜炎檢測芯片的應(yīng)用方法包括以下步驟1.處理樣品取病人腦脊液少量，分別用提取病毒、細(xì)菌、支原體、螺旋體等DNA的方法提取DNA，備用。如需長時(shí)間放置，在-20℃下凍存。
2.PCR擴(kuò)增在反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物，Taq酶，相應(yīng)的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素(Cy3)標(biāo)記的dUTP。擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec 30個(gè)循環(huán)72℃ 1min72℃ 5min3.雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時(shí)，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
4.檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果。
5.數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片分析結(jié)果輸出。
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明
實(shí)施例設(shè)計(jì)腦膜炎引物及特異性探針61個(gè)。探針的大小為15-30個(gè)堿基。由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
制備基因芯片用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，使用BioRobotics公司的點(diǎn)樣儀按預(yù)先設(shè)定好的程序進(jìn)行點(diǎn)樣。用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l。點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時(shí)。以探針緩沖液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
處理樣品取臨床檢測為患者的腦脊液少量，根據(jù)監(jiān)測項(xiàng)目的要求等分，分別按以下方法處理(1)100℃水浴10分鐘，驟然冷卻至0℃，13000G離心5分鐘，取上清備用。
(2)用溶菌酶溶解，氯仿抽提，乙醇沉淀法提取DNA，備用。
PCR擴(kuò)增以真菌性腦膜炎為例采用的引物序列分別是F3965`-TGAGAAACGGCTACCACATC C；R572CGTTCAGACC ACGGTCGTC-5`。
反應(yīng)總體積為20μl，在反應(yīng)管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.2μl，相應(yīng)的處理好的樣品0.8μl和上下游引物各2μl，dNTP0.8μl以及Cy3標(biāo)記的dUTP1.2μl，其余的用H2O。擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 40sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個(gè)循環(huán)；雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時(shí)，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果。數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片結(jié)果輸出。與臨床檢驗(yàn)結(jié)果比較，符合率100％。
腦膜炎檢測芯片引物及探針序列表腦膜炎診斷基因芯片探針表meningoencephalitisvirus probe SEQUENCEhhv1hhv1 F3455 5`-ACGGCGTCGC CCTGAAhhv2hhv2 F3455 5`-GGGGCGTTCC GCTCAAhhv3hhv3 F3262 5`-ACTTATCCC CACGAAAGTC Ghhv5hhv5 F1644 5`-TCTGTTCAACACCATTAATTTTCACThhv6hhv6 5`-CACAAACA TCCTTTATTA ATCCCGhhv7hhv7 5`-CACAAAGA GTCTTCATTA AGCCGcoxsackievirus a9F1145`-AGCAAT GCACCTCTGG TCAATa9，b4，b5 b45`-AGCAAAGAAACAATGGTCAATTACTb55`-AGTTAC ACACACTGAT CAACAGTGGenterovinus71 F1165`-GCAAC GCAAACCAGA TCAATAGechovirus22 F1115`-CCCATAGTAA CCAACACCTA AGACApoliovirusF114ACAAAAC CAAGTTCAAT AGAAGGGla cross F197AGCA TGATCAAAAC AGAGGSt.louis F2195`-CT GCTACGAGGC AACCTTGGvenezuelan equine F1285`-CGC TCGATGGCTA ACCTGAwest nile F2805`-G CAGACAAGGA GTGGTGGACAwestern equine western F8005`-AAGACACGACCAGCAGCACCeastern 5`-AAAACACGTCTAGT AGTACCATCACAAvenezuelan5`-ACACGACCGGCCGCTCJapanese BF1645`-GAGGAGG AAATGAAGGC TCAATcentral european F1075`-TGGA GCTCCGCTGT GGCrussian Russian F2725`-AGCAGCTCT TACGCTACAT GGAPowassan F3325`-CGTATGTTG TCAAGGTTGA GCCDengueF2185`-GGA CCCATGAAAT TGGTGATGMumps F3345`-GCTGTGGG AGTAATGAAT CAAGTTMeasles F1965`-AATGT GGAAGTTGGG AATGTCAAdenovirusF1415`-GGGGATGTCA AATTTTAGCT CCLCMV F3855`-TGGGGA AATCTGGACT GGAG5`-TGGGGA GCTCTGGACT GGAGHIV-1 F1445`-AGGGATG GAAAGGATCA CCGHIV-2 F6765`-GCTCCACGCTTGCTTGCTTAinluenza-aF1245`-ACGGTCAACAGGACACATCAATinluenza-bF1567 5`-TGATGAATGACTCAATGGCTAAGAhtlv-15`-AGTTTGTTCGTGGACCCTCGhtlv-2F1835`-AAAGGATGCC GAGTCTATAA AAGCtogavirus F3321 5`-TTTTCGTGGCACTTTGGCARickettsia typhi F1945`-GTGCCGAAAG AATTGGTTGA AT
5`-CACGGCTTTCATTAACCAACTTRabies virus F2575`-TGCAGTCTCC ACCTCAGCAAParvovirus B19 F7955`-TTTGCCAGGA ATGACTACAA AAGBacteriaprobeSEQUENCETropheryma whippeliiTrophF5965`-CGGAC CTGCGGTGGG TABorrelia afzeliiAfzelii F5965`-TGTGGAGCTA TGTTGGAAAC TATAFGBartonella henselae BartoF5965`-CTGGAACTGC CTTTGATACT GGBrucella abortusB-abor F5965`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella canis B-canis F5965`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella melitensis B-meli F5965`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella suis B-suis F5965`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBorrelia burgdorferiberg F5965`-CTGTGGAGCT ATGTTGGAAA CTATGEscherichia coliesch F5965`-TGGGAACTGC ATCTGATACT GGBorrelia gariniigarinii F5965`-CTGTGGAACT ATGTTGGAAA CTATATGTStreptococcus pneumoniae R6 group b F5965`-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTTHaemophilus influenzae Rd hae F5965`-AGGAATTGCA TTTCAGACTG GGLeptospira interrogans lep F5965`-CGCAGCCTGC ACTTGAAACBacillus subtilis list F5965`-GGGGAGGGTC ATTGGAAACTStreptococcus miilleri milleri F5965`-ATTGTAGGCT TTGGAAACTG TTTAAMycobacterium tuberculosis mycoga F5965`-GAGCGTGCGG GCGAFAMycoplasma PG50 mycopla F5965`-CAGTTGTATG CATTGGAAAC TATTAATNeisseriameningitidisnei F5965`-CGGGAACTGC GTTCTGAACTStaphylococcus aureus sta F5965`-GTGGAGGGTC ATTGGAAACT GStreptococcuspneumoniae strp-pneuF5965`-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTTFurngiprobeSequenceCryptococcus F4365`-CAAATTACCC AATCCCGACA CProtozoaprobeSEQUENCEacanthamoebAcanthamoeba sp.aF1759 5`-CCGTGCTTCT TAGAGGGACTGNaegleria jamiesoni naegleriaF1759 5`TTTGTCAGCT TCTTAAAGGG ACTTToxoplasma gondii Toxoplasma F1759 5`-CACTTCTTAG AGGGACTTTG CGT
腦膜炎診斷基因芯片引物表meningoencephalitisvirusprimer SEQUENCEhhv1 F3394 5`-TCCAAGCCCC GCAAGChhv2 R3686 CTTTGAGCTG CTTACAACGT ATC-5`hhv3primer SEQUENCEF3125 5`-TCGGGA CATGCCAAGT AAAGTR3335 CCGAC CTTGTTGCTT TTAGGhhv4primer SEQUENCEF2469 5`-C CGTAGCCCAT AATGGAACGR2939 GCGTGTAG GTGGTGGGG-5`hhv5primer SEQUENCEF1502 5`-TCAACACTA TGGCCGAGCT TTR1865 CAGTGG ATTGCGGCGT TAGTA-5`hhv6primer SEQUENCEhhv7 F2879 5`-GA TAAAACATAC GCGGTTCAGA GTR2954 GTAGTACG TAATATGGCG CTC-5`ENTEROVIRUScoxsackievirus primer SEQUENCEa9，b4，b5F35`-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTTC5`-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTACR475 GGGT CTTACGCCGA TTAGG-5`echovirus22 primer SEQUENCEF69 5`-AA AACCCTTTCC CAGCCTTGR165 GGAT ACGGACCAGG GGTGA-5`poliovirus primer SEQUENCEF35`-AAAACAGC TCTGGGGTTG TACCR185 GTGAA GACAAAGGGG CCACT-5`la crossprimer SEQUENCEF139 5`-G TGAAGCAAAA CCCATCCAAAR393 TATACAAA CGTCGCGTCT AAC-5`St.louisprimer SEQUENCEF132 5`-TGTCACAGT GATGGCACCA GAR318 CTCA CTGGGTTGTA AACAGACG
venezuelan equine primer SEQUENCEF80 5`-T TCCCCAGAAC CGACCCTR374 GTACCAGTA CTTTAACCTT AGAC-5`west nile primer SEQUENCEF62 5`-ATGGGTGGA TTTGGTTCTC GR348 AC CGTTTCCTTC GTAACTGT-5`western equineprimer SEQUENCEF578 5`-AGG GAGTTCGTAA ACAGATATTT GC5`-AGG GAGTTCGTAA ACAGTACCTT GR898 AGTAG TTTTCGCGAC ACTGATTC-5`Japanese Bprimer SEQUENCEF17 5`-TTAC AGCATTAGCC CCGACCR265 AAAGG TCCCCTTCGA AAACA-5`central european primer SEQUENCEF54 5`-CATGACC CTTGGAGTGG GGR224 CGTAGTCGG TATTTCCTCT GTAA-5`russian primer SEQUENCEF98 5`-ATG AGGACCATTG GGCCTCTR403 CGACGTAG TACCTACAGT AGT-5`Powassan primer SEQUENCEF102 5`-GCACGCCAA ATTGACCAACR443 CCGAGCCG CTGATACCAC TA-5`Dengueprimer SEQUENCEF150 5`-C GAGAAACCGC GTGTCAACR270 TATCGT AAGGATTCTA AAGATCGGTAMumps primer SEQUENCEF261 5`-GATCAAGGCT TGAGCAATCA GTTR390 ATTG CCATAGGAAT GGGGATGTTT-5`Measles primer SEQUENCEF145 5`-AACATC AAGCACCGCC TAAAAAR331 GCTCCTTCTA GGCACTTGAG GAdenovirusprimer SEQUENCEF95 5`-GGTATT CTAAACCCCG TTCAGCR231 TCAGGCCGAG TCACTGAGGA A
LCMV primer SEQUENCEF153 5`-CTCATCAT AATCACGAGC ATCAAAR525 CAGAGTTCAG ATGTGGAGTC GTAGT-5`HIV-1primer SEQUENCEF95`-A ACAGTACTAG ATGTGGGAGA TGCATR214 TT TAGAATCTCG GGAAATCTTG TTTT-5`hiv-2primer SEQUENCEF483 5`-GGACATGGGA GGAGCTGGTG GGGR770 AGAGGATCAG CGGCGGACCA-5`inluenza-a primer SEQUENCEF65 5`-TCCCTTATACTGGAGATCCTCCATR268 TGTTTGTCTG ACACAGGACC-5`inluenza-b primer SEQUENCEF1524 5`-ATTGAGGGACGTGATGCAGATR1701 TGGTAGGGGT TAAAGAAGAA AC-5`htlv-1 primer SEQUENCEF147 5`-CGCCACTTTG ATTTTATTCT TCCR480 CACGGTTAGT ACCTGGACGG-5`htlv-2 primer SEQUENCEF34 5`-AACTGAAACCAAGGCCCTGAR272 CCTAGGTAGG AGAGGTTCGC-5`togavirusprimer SEQUENCEF3245 5`-TGTGATCAAACTTCCTGGTATCAGAR3549 TCAATGTAGG ATCGGGGTGGG-5`Rickettsia typhi primer SEQUENCEF101 5`-CAAGCATAAC AATAGATTCA CCCTCR458 TGGATGGTTT TAATCGGGTT CAAAC-5`Rabies virus primer SEQUENCEF183 5`-GGAGATTACA GCCCCAACAA GAR453 ACATCAACCC CTGCCCAGTC-5`Parvovirus B19 primer SEQUENCEF661 5`-TTTGAAGAAG GCTATCATAT TCATGTR1031 CCCTCAGAT CGCCGTGTCC5`-
FungiCryptococcusprimer SEQU ENCEF396 5`-TGAGAAACGG CTACCACATC CR572 CGTTCAGACC ACGGTCGTC-5`Bacteriaprimer SEQUENCEF488 5`-CCA GCAGCCGCGG TAAR1077 A TTCAGGGCGT TGCTCGC-5`Protozoaprimer SEQUENCEF1461 5`-GGCTTAATTT GACTCAACAC GG5`-GGCTTAATTC GACTCAACAC GGR2098 TGGCGGG CAGCGAGG-5`
權(quán)利要求
1.一種腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有不同區(qū)域的微陣列，在每個(gè)微陣列區(qū)域中分別固定有常見的腦膜炎致病微生物的特異性探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于探針的大小為15-30個(gè)堿基，設(shè)計(jì)61個(gè)探針，所設(shè)計(jì)的探針序列如下meningoencephalitisvirus probeSEQUENCEhhv1 hhv1 F3455 5`-ACGGCGTCGC CCTGAAhhv2 hhv2 F3455 5`-GGGGCGTTCC GCTCAAhhv3 hhv3 F3262 5`-ACTTATCCC CACGAAAGTC Ghhv5 hhv5 F1644 5`-TCTGTTCAACACCATTAATTTTCACThhv6 hhv6 5`-CACAAACA TCCTTTATTA ATCCCGhhv7 hhv7 5`-CACAAAGA GTCTTCATTA AGCCGcoxsackievirusa9 F1114 5`-AGCAAT GCACCTCTGG TCAATa9，b4，b5b4 5`-AGCAAAGAAACAATGGTCAATTACTb5 5`-AGTTAC ACACACTGAT CAACAGTGGenterovirus71 F116 5`-GCAAC GCAAACCAGA TCAATAGechovirus22 F111 5`-CCCATAGTAA CCAACACCTA AGACApoliovirus F114 ACAAAAC CAAGTTCAAT AGAAGGGla cross F197 AGCA TGATCAAAAC AGAGGSt.louis F219 5`-CT GCTACGAGGC AACCTTGGvenezuelan equineF128 5`-CGC TCGATGGCTA ACCTGAwest nileF280 5`-G CAGACAAGGA GTGGTGGACAwestern equinewesternF800 5`-AAGACACGACCAGCAGCACCeastern 5`-AAAACACGTCTAGTAGTACCATCACAAvenezuelan 5`-ACACGACCGGCCGCTCJapanese B F164 5`-GAGGAGG AAATGAAGGC TCAATcentral european F107 5`-TGGA GCTCCGCTGT GGCrussian RussianF272 5`-AGCAGCTCT TACGCTACAT GGAPowassan F332 5`-CGTATGTTG TCAAGGTTGA GCCDengue F218 5`-GGA CCCATGAAAT TGGTGATGMumpsF334 5`-GCTGTGGG AGTAATGAAT CAAGTTMeasles F196 5`-AATGT GGAAGTTGGG AATGTCAAdenovirus F141 5`-GGGGATGTCA AATTTTAGCT CCLCMV F385 5`-TGGGGA AATCTGGACT GGAG5`-TGGGGA GCTCTGGACT GGAGHIV-1F144 5`-AGGGATG GAAAGGATCA CCGHIV-2F676 5`-GCTCCACGCTTGCTTGCTTAinluenza-a F124 5`-ACGGTCAACAGGACACATCAATinluenza-b F15675`-TGATGAATGACTCAATGGCTAAGAhtlv-15`-AGTTTGTTCGTGGACCCTCGhtlv-2 F183 5`-AAAGGATGCC GAGTCTATAA AAGCtogavirusF33215`-TTTTCGTGGCACTTTGGCARickettsia typhi F194 5`-GTGCCGAAAG AATTGGTTGA AT5`-CACGGCTTTCATTAACCAACTTRabies virus F257 5`-TGCAGTCTCC ACCTCAGCAAParvovirus B19 F795 5`-TTTGCCAGGA ATGACTACAA AAGBacteriaprobe SEQUENCETropheryma whippeliiTrophF596 5`-CGGAC CTGCGGTGGG TABorrelia afzeliiAfzelii F596 5`-TGTGGAGCTA TGTTGGAAAC TATATGBartonella henselae BartoF596 5`-CTGGAACTGC CTTTGATACT GGBrucella abortusB-abor F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella canis B-canis F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella melitensis B-meli F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella suis B-suis F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBorrelia burgdorferiberg F596 5`-CTGTGGAGCT ATGTTGGAAA CTATGEscherichia coliesch F596 5`-TGGGAACTGC ATCTGATACT GGBorrelia gariniigarinii F596 5`-CTGTGGAACT ATGTTGGAAA CTATATGTStreptococcus pneumoniae R6 group b F596 5`-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTTHaemophilus influenzae Rd hae F596 5`-AGGAATTGCA TTTCAGACTG GGLeptospira interrogans lep F596 5`-CGCAGCCTGC ACTTGAAACBacillus subtilis list F596 5`-GGGGAGGGTC ATTGGAAACTStreptococcus milleri milleri F596 5`-ATTGTAGGCT TTGGAAACTG TTTAAMycobacterium tuberculosis mycoga F596 5`-GAGCGTGCGG GCGATAMycoplasma PG50 mycopla F596 5`-CAGTTGTATG CATTGGAAAC TATTAATNeisseriameningitidisnei F596 5`-CGGGAACTGC GTTCTGAACTStaphylococcus aureus sta F596 5`-GTGGAGGGTC ATTGGAAACT GStreptococcuspneumoniae strp-pneuF596 5`-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTTFungiprobe SequenceCryptococcus F436 5`-CAAATTACCC AATCCCGACA CProtozoaprobe SEQUENCEacanthamoebAcanthamoeba sp.aF17595`-CCGTGCTTCT TAGAGGGACTGNaegleria jamiesoni naegleriaF17595`TTTGTCAGCT TCTTAAAGGG ACTTToxoplasma gondii Toxoplasma F17595`-CACTTCTTAG AGGGACTTTG CGT
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于本發(fā)明制備工藝按如下步驟進(jìn)行(1)設(shè)計(jì)腦膜炎特異性探針和引物；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的腦膜炎致病微生物基因序列，根據(jù)所述的探針序列設(shè)計(jì)探針；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的腦膜炎致病微生物基因序列，設(shè)計(jì)如下PCR引物，針對病毒病原微生物基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的同時(shí)標(biāo)記熒光素；擴(kuò)增引物序列如下meningoencephalitisvirusprimer SEQUENCEhhv1 F3394 5`-TCCAAGCCCC GCAAGChhv2 R3686 CTTTGAGCTG CTTACAACGT ATC-5`hhv3primer SEQUENCEF3125 5`-TCGGGA CATGCCAAGT AAAGTR3335 CCGAC CTTGTTGCTT TTAGGhhv4primer SEQUENCEF2469 5`-C CGTAGCCCAT AATGGAACGR2939 GCGTGTAG GTGGTGGGG-5`hhv5primer SEQUENCEF1502 5`-TCAACACTA TGGCCGAGCT TTR1865 CAGTGG ATTGCGGCGT TAGTA-5`hhv6primer SEQUENCEhhv7 F2879 5`-GA TAAAACATAC GCGGTTCAGA GTR2954 GTAGTACG TAATATGGCG CTC-5`ENTEROVIRUScoxsackievirus primer SEQUENCEa9，b4，b5F35`-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTTC5`-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTACR475 GGGT CTTACGCCGA TTAGG-5`echovirus22 primer SEQUENCEF69 5`-AA AACCCTTTCC CAGCCTTGR165 GGAT ACGGACCAGG GGTGA-5`poliovirus primer SEQUENCEF3 5`-AAAACAGC TCTGGGGTTG TACCR185 GTGAA GACAAAGGGG CCACT-5`la crossprimerSEQUENCEF139 5`-G TGAAGCAAAA CCCATCCAAAR393 TATACAAA CGTCGCGTCT AAC-5`St.louisprimerSEQUENCEF132 5`-TGTCACAGT GATGGCACCA GAR318 CTCA CTGGGTTGTA AACAGACGvenezuelan equine primerSEQUENCEF80 5`-T TCCCCAGAAC CGACCCTR374 GTACCAGTA CTTTAACCTT AGAC-5`west nile primerSEQUENCEF62 5`-ATGGGTGGA TTTGGTTCTC GR348 AC CGTTTCCTTC GTAACTGT-5`western equine primerSEQUENCEF578 5`-AGG GAGTTCGTAA ACAGATATTT GC5`-AGG GAGTTCGTAA ACAGTACCTT GR898 AGTAG TTTTCGCGAC ACTGATTC-5`Japanese B primerSEQUENCEF17 5`-TTAC AGCATTAGCC CCGACCR265 AAAGG TCCCCTTCGA AAACA-5`central europeanprimerSEQUENCEF54 5`-CATGACC CTTGGAGTGG GGR224 CGTAGTCGG TATTTCCTCT GTAA-5`russian primerSEQUENCEF98 5`-ATG AGGACCATTG GGCCTCTR403 CGACGTAG TACCTACAGT AGT-5`PowassanprimerSEQUENCEF102 5`-GCACGCCAA ATTGACCAACR443 CCGAGCCG CTGATACCAC TA-5`Dengue primerSEQUENCEF150 5`-C GAGAAACCGC GTGTCAACR270 TATCGT AAGGATTCTA AAGATCGGTAMumps primerSEQUENCEF261 5`-GATCAAGGCT TGAGCAATCA GTTR390 ATTG CCATAGGAAT GGGGATGTTT-5`Measles primer SEQUENCEF145 5`-AACATC AAGCACCGCC TAAAAAR331 GCTCCTTCTA GGCACTTGAG GAdenovirus primer SEQUENCEF95 5`-GGTATT CTAAACCCCG TTCAGCR231 TCAGGCCGAG TCACTGAGGA ALCMV primer SEQUENCEF153 5`-CTCATCAT AATCACGAGC ATCAAAR525 CAGAGTTCAG ATGTGGAGTC GTAGT-5`HIV-1primer SEQUENCEF95`-A ACAGTACTAG ATGTGGGAGA TGCATR214 TT TAGAATCTCG GGAAATCTTG TTTT-5`hiv-2primer SEQUENCEF483 5`-GGACATGGGA GGAGCTGGTG GGGR770 AGAGGATCAG CGGCGGACCA-5`inluenza-a primer SEQUENCEF65 5`-TCCCTTATACTGGAGATCCTCCATR268 TGTTTGTCTG ACACAGGACC-5`inluenza-b primer SEQUENCEF1524 5`-ATTGAGGGACGTGATGCAGATR1701 TGGTAGGGGT TAAAGAAGAA AC-5`htlv-1 primer SEQUENCEF147 5`-CGCCACTTTG ATTTTATTCT TCCR480 CACGGTTAGT ACCTGGACGG-5`htlv-2 primer SEQUENCEF34 5`-AACTGAAACCAAGGCCCTGAR272 CCTAGGTAGG AGAGGTTCGC-5`togavirusprimer SEQUENCEF3245 5`-TGTGATCAAACTTCCTGGTATCAGAR3549 TCAATGTAGG ATCGGGGTGGG-5`Rickettsia typhiprimer SEQUENCEF101 5`-CAAGCATAAC AATAGATTCA CCCTCR458 TGGATGGTTT TAATCGGGT TCAAAC-5Rabies virusprimer SEQUENCEF183 5`-GGAGATTACA GCCCCAACAA GAR453 ACATCAACCC CTGCCCAGTC-5`Parvovirus B19 primer SEQUENCEF661 5`-TTTGAAGAAG GCTATCATAT TCATGTR1031 CCCTCAGAT CGCCGTGTCC5`-FungiCryptococcusprimer SEQUENCEF396 5`-TGAGAAACGG CTACCACATC CR572 CGTTCAGACC ACGGTCGTC-5`Bacteriaprimer SEQUENCEF488 5`-CCA GCAGCCGCGG TAAR1077 A TTCAGGGCGT TGCTCGC-5`Protozoaprimer SEQUENCEF1461 5`-GGCTTAATTT GACTCAACAC GG5`-GGCTTAATTC GACTCAACAC GGR2098 TGGCGGG CAGCGAGG-5`(2)、合成探針；(3)、制備芯片；用去離子水將合成的探針溶解，得到濃度為200mmol/l的溶液，在玻璃基片上進(jìn)行點(diǎn)樣；點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時(shí)；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次，吹干備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于在合成探針的步驟中，探針5’端加氨基修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于點(diǎn)樣從幾十點(diǎn)到上千點(diǎn)，點(diǎn)的大小為50-100微米左右。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于探針緩沖液為1xSSC，0.1％SDS；封閉液為1％BSA，PH＝7，0.01mol/l PB。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進(jìn)行1.處理樣品；取病人腦脊液少量，分別提取DNA，備用；如需長時(shí)間放置，在-20℃下凍存；2.PCR引物擴(kuò)增在反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物——Taq酶，相應(yīng)的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素標(biāo)記的dUTP；擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個(gè)循環(huán)；3.雜交；PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時(shí)，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1，洗滌3次。4.檢測；用掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結(jié)果；5.數(shù)據(jù)分析將芯片分析結(jié)果輸出。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體地講是一種基因芯片——腦膜炎檢測芯片及其制備工藝和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多個(gè)不同區(qū)域的微陣列，在每個(gè)微陣列區(qū)域中，分別固定有常見的腦膜炎致病微生物的特異性探針。用相應(yīng)探針與經(jīng)擴(kuò)增并加入熒光標(biāo)記的致病微生物DNA雜交，經(jīng)掃描儀掃描芯片，并對雜交信號進(jìn)行處理分析，獲得有關(guān)信息。這種芯片能同時(shí)檢測細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲等多種微生物，具有診斷快速準(zhǔn)確、特異性高、信息量大的特點(diǎn)，對臨床診斷和流行病學(xué)篩查都有很大幫助。
文檔編號C12Q1/04GK1515688SQ0311145
公開日2004年7月28日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者趙雨杰, 魏誠佑, 何群, 侯偉健, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 潘忠誠, 王天驕, 馬佳明 申請人:趙雨杰, 魏誠佑, 何群, 侯偉健, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 潘忠誠, 王天驕, 馬佳明