專利名稱：產(chǎn)生含有人粒細(xì)胞集落刺激因子的乳的轉(zhuǎn)基因山羊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山羊受精卵，其包含一種核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體以乳腺組織特異性方式表達(dá)人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)基因；本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生含有hG-CSF的乳的轉(zhuǎn)基因山羊。
背景技術(shù)：
hG-CSF是一種生物活性糖蛋白，其表達(dá)是由內(nèi)部刺激觸發(fā)的，例如細(xì)菌感染或癌癥治療，以刺激造血干細(xì)胞例如粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞地生長(zhǎng)和分化，而當(dāng)宿主是健康的時(shí)候，其在宿主血液中的濃度是極微量的。
由于從人體中獲得hG-CSF還不是切實(shí)可行的，已經(jīng)嘗試使用大腸桿菌或動(dòng)物細(xì)胞制備hG-CSF。用大腸桿菌生產(chǎn)的hG-CSF在體內(nèi)的活性不穩(wěn)定，及安全性未核實(shí)。另外，使用大腸桿菌生產(chǎn)hG-CSF的方法是不經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)樾枰嘿F的設(shè)備和復(fù)雜的純化程序，使用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)hG-CSF的方法也具有同樣問(wèn)題。
因此，需要開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)生物活性hG-CSF的方法。近年來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于使用轉(zhuǎn)基因牛，山羊或豬作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)生物活性蛋白，乳蛋白和膠原蛋白的成功嘗試(美國(guó)專利No.5633076，5849992和5895833)。通過(guò)這種方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與在人體內(nèi)產(chǎn)生的相應(yīng)的野生型相同，而這種生產(chǎn)成本比使用大腸桿菌或動(dòng)物細(xì)胞的方法低1000-2000倍。WO 97/19589揭示了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因矮小山羊的方法，但實(shí)際生產(chǎn)生物活性蛋白的方法未得以證實(shí)。
本發(fā)明人嘗試開(kāi)發(fā)一種通過(guò)使用本發(fā)明人在韓國(guó)專利申請(qǐng)No.97-9601(韓國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.98-73991)中所揭示的乳腺組織特異性表達(dá)系統(tǒng)用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)hG-CSF的方法。發(fā)明概述
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的提供了一種山羊受精卵，其包含一種核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體以乳腺組織特異性方式表達(dá)hG-CSF基因。
本發(fā)明的其它目的包括
一種制備所述山羊受精卵的方法；
一種從導(dǎo)入所述核酸構(gòu)建體的山羊中提取完整受精卵的方法；
一種產(chǎn)生含有hG-CSF的乳的轉(zhuǎn)基因山羊；
一種從山羊受精卵中制備轉(zhuǎn)基因山羊的方法；
一種使用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)hG-CSF的方法；
一種從轉(zhuǎn)基因山羊中生產(chǎn)的含有hG-CSF的乳組合物；和
一種包含所述這樣產(chǎn)生的hG-CSF的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種山羊受精卵，其包含一種核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列和編碼hG-CSF的核酸序列。
本發(fā)明的其它方面涵蓋了
一種制備山羊受精卵的方法，包括將核酸構(gòu)建體微注射入完整的山羊受精卵中；
一種制備完整山羊受精卵的方法，包括同步化一種雌性山羊，使其超排卵，將超排卵的雌性山羊與雄性山羊交配，從交配的雌性山羊中回收受精卵，特征在于進(jìn)行同步化步驟是將諾甲醋孕酮和雌二醇給予雌性山羊，在雌性山羊中插入一種含有諾甲醋孕酮的植入物，以及除去此植入物；進(jìn)行超排卵步驟是以預(yù)定的時(shí)間間隔相繼給予雌性山羊以組合劑量的孕馬血清促性腺激素(PMSG)和卵泡刺激激素(FSH)，分劑量的FSH，和組合劑量的FSH和人絨毛膜促性腺激素(hCG)；
一種由山羊受精卵產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因山羊，其產(chǎn)生含有hG-CSF的乳；
一種制備轉(zhuǎn)基因山羊的方法，包括將山羊的受精卵移至一個(gè)雌性山羊體內(nèi)，并使山羊受精卵發(fā)育直至生產(chǎn)；
一種生產(chǎn)hG-CSF的方法，包括從轉(zhuǎn)基因山羊中產(chǎn)生乳，并從乳中回收hG-CSF；
一種包含hG-CSF的乳組合物，是從轉(zhuǎn)基因山羊中產(chǎn)生的；
從轉(zhuǎn)基因山羊中產(chǎn)生的hG-CSF；和
一種藥物組合物，其包含hG-CSF和一種藥物適當(dāng)?shù)妮d體。附圖簡(jiǎn)述
本發(fā)明的上述目的和特點(diǎn)通過(guò)以下闡述的優(yōu)選實(shí)施方案并結(jié)合附圖將是顯而易見(jiàn)的，其中


圖1是產(chǎn)生同步和超排卵山羊的圖式；
圖2是示出在轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA中導(dǎo)入表達(dá)盒的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)果；
圖3是示出在轉(zhuǎn)基因山羊的基因組DNA中導(dǎo)入表達(dá)盒的Southern印跡分析結(jié)果；
圖4是示出hG-CSF在轉(zhuǎn)基因山羊乳清中表達(dá)的Western印跡結(jié)果；
圖5是示出由轉(zhuǎn)基因山羊乳清誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞增殖圖式。發(fā)明詳述
用于制備本發(fā)明轉(zhuǎn)基因山羊受精卵的核酸構(gòu)建體含有山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列和編碼hG-CSF基因的核苷酸序列。hG-CSF的表達(dá)是由在乳腺組織中特異激活的山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子控制的。hG-CSF基因和山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子在GenBank中有公開(kāi)，登記號(hào)分別為X03656和M 90559，并可以分別得自人體和山羊組織，或使用常規(guī)DNA合成方法合成(Sambrook，J.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(1989))。除了山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子和hG-CSF基因之外，核酸構(gòu)建體還可以包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。核酸構(gòu)建體例如是一個(gè)表達(dá)盒pGbc-hGCSF(SEQ IDNO1)，其中山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列是從山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子至山羊β-酪蛋白基因的外顯子I的翻譯起始密碼子之前的核苷酸，而且其控制位于其下游的hG-CSF基因的表達(dá)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因山羊可以通過(guò)將核酸構(gòu)建體微注射入山羊的完整的單細(xì)胞階段受精卵中而制備。微注射可以根據(jù)常規(guī)方法在倒置顯微鏡下用顯微操作器進(jìn)行(操作小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(1994))。本發(fā)明的受精卵例如是Caprahircus aegagrus胚胎/pGbc-bGCSF，其產(chǎn)生自一種韓國(guó)本地種Caprahircus aegagrus，并包含表達(dá)盒pGbc-bGCSF。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，這種轉(zhuǎn)基因受精卵于1999年12月28日保藏在韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究中心(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韓國(guó))，保藏號(hào)KCTC0718BP。然而，受精卵不限于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因山羊受精卵。
用于微注射步驟中的單細(xì)胞階段受精卵，是通過(guò)同步化一雌性山羊，使其超排卵，將此超排卵的雌性山羊與雄性山羊交配，并從交配的雌性山羊中回收受精卵而制備的。
優(yōu)選地，同步化和超排卵步驟可以根據(jù)圖1所示進(jìn)行進(jìn)行同步化步驟是肌注適當(dāng)數(shù)量的諾甲醋孕酮和雌二醇，以及將一個(gè)含有適量諾甲醋孕酮的植入物插入耳中，并在插入后的第13或14天除去此植入物；進(jìn)行超排卵步驟是在除去植入物之前60小時(shí)開(kāi)始，每12小時(shí)注射1次PMSG，F(xiàn)SH和hCG，共8次。注射時(shí)間表包括第一次給予PMSG和FSH；在第二次至第七次給予FSH；第八次給予FSH和hCG。在第八次與FSH一起注射hCG，可以有效地使超排卵增強(qiáng)以及調(diào)節(jié)排卵時(shí)間。這種方法特別適用于制備Capra hircusaegagrus的完整受精卵。
交配和回收步驟可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行。在將超排卵的雌性山羊與雄性山羊交配后，回收受精卵可以如下進(jìn)行在除去植入物后72-76小時(shí)，通過(guò)注射麻醉劑如甲苯噻嗪或利多卡因?qū)⒔慌涞拇菩陨窖蚵樽?，交配的山羊在注射之前禁?4小時(shí)；將其背部朝下；局部麻醉腹部中線；從腹部中線作切口，取出卵巢，輸卵管和子宮；在輸卵管漏斗中插入一個(gè)導(dǎo)管；將含有胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)導(dǎo)入導(dǎo)管中，以從子宮流至輸卵管；獲得完整的受精卵。
可以根據(jù)常規(guī)方法，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因山羊受精卵移植入一個(gè)雌性山羊(受體)中，并使其發(fā)育直至生產(chǎn)。移植可以如下進(jìn)行將受體山羊禁食24小時(shí)；在受體山羊腹中線作切口取出卵巢，輸卵管和子宮；將現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因受精卵的導(dǎo)管插入輸卵管漏斗中，如此可以將受精卵移至輸卵管中?？梢杂糜诒景l(fā)明的受體山羊選自那些處于自發(fā)的或激素如PMSG誘導(dǎo)的發(fā)情期動(dòng)物。優(yōu)選同步發(fā)情期模式中的受體。可以移植的轉(zhuǎn)基因受精卵的數(shù)目是2-4個(gè)/受體山羊。受體山羊的妊娠可以在移植后大約40天，通過(guò)超聲診斷設(shè)備識(shí)別。移植的受精卵發(fā)育至生產(chǎn)以獲得轉(zhuǎn)基因山羊，其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞包含所述核酸構(gòu)建體，然后繁殖轉(zhuǎn)基因山羊。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因山羊中的存在情況可以通過(guò)常規(guī)方法鑒別，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或Southern印跡分析。另外，hG-CSF在轉(zhuǎn)基因山羊中的表達(dá)，可以通過(guò)常規(guī)方法鑒別，例如使用其乳蛋白進(jìn)行Western印跡分析或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。
在交配后，轉(zhuǎn)基因山羊在乳腺組織中特異地產(chǎn)生hG-CSF并在乳中釋放hG-CSF。這樣產(chǎn)生的hG-CSF在體內(nèi)呈現(xiàn)保持良好的生物活性，并刺激粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。本領(lǐng)域熟知hG-CSF在預(yù)防和治療一些疾病方面是有效的，例如由骨髓移植所致白細(xì)胞減少癥，惡性淋巴瘤，急性白血病，肺癌，卵巢癌，睪丸癌，脊髓發(fā)育不良，營(yíng)養(yǎng)不良性貧血和先天性中性粒細(xì)胞減少癥。
藥物配方可以根據(jù)任何常規(guī)方法制備。在制備配方中，活性配料優(yōu)選與載體混合或用其稀釋，或裝入載體中，可以是膠囊，小袋或其它容器形式。當(dāng)載體作為稀釋劑時(shí)，其可以是固體，半固體或液體材料，作為活性配料的運(yùn)載體，賦形劑或介質(zhì)。因此，配方可以是片劑，藥丸，粉末，小袋，酏劑，懸浮液，乳液，乳液，糖漿，氣霧劑，軟或硬質(zhì)凝膠膠囊，無(wú)菌可注射乳液，無(wú)菌包裝的粉末等。
適當(dāng)?shù)妮d體，賦形劑和稀釋劑例如是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯樹(shù)膠，海藻酸鹽，凝膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羥苯甲酸酯，丙基羥苯甲酸酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。配方另外可包括充填劑，抗粘合劑，潤(rùn)滑劑，濕潤(rùn)劑，香料，乳化劑，防腐劑等。本發(fā)明的組合物可以這樣配制，以在將其以本領(lǐng)域熟知的任何方法給予哺乳動(dòng)物后，能迅速，持續(xù)或延遲釋放活性配料。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)各種途徑給予，包括通過(guò)口服，經(jīng)皮，皮下，靜脈內(nèi)及肌內(nèi)給予。在人體情況下，hG-CSF的典型日劑量為大約75-600mg/kg體重，優(yōu)選100-400mg/kg體重，并可以單劑或分劑量給予。
然而，應(yīng)意識(shí)到實(shí)際給予的活性配料的數(shù)量應(yīng)當(dāng)根據(jù)各種相關(guān)因素加以確定，包括各個(gè)患者的治療狀態(tài)，選擇的給藥途徑，年齡，性別和體重，及患者癥狀的程度；因此上述劑量不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
以下實(shí)施例進(jìn)一步例證了本發(fā)明而無(wú)限制之意。實(shí)施例1構(gòu)建載體pGbc-hGCSF
質(zhì)粒pGbc-S含有產(chǎn)生自韓國(guó)本地產(chǎn)山羊(Capra hircusaegagrus)的β-酪蛋白基因的一部分，這部分是從啟動(dòng)子至外顯子I(韓國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.99-73991)，將該質(zhì)粒用HindIII裂解，并將所得混合物用1∶1(v/v)苯酚和氯仿的混合物提取，在95％乙醇中沉淀，并溶解于蒸餾水中，獲得含有山羊β-酪蛋白基因從啟動(dòng)子至外顯子I部分的DNA片段。將此DNA片段用DraI裂解，并將所得混合物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。從瓊脂糖凝膠中切下1239bp的條帶，并用Geneclean II試劑盒純化(Bio101，美國(guó))，獲得DNA片段1。
將山羊(Capra hircus aegagrus)的基因組DNA進(jìn)行PCR，使用引物CAS-F1(SEQ ID NO2)和CAS-R1(SEQ ID NO3)，并將PCR產(chǎn)物用DraI和HindIII裂解并經(jīng)電子提取，獲得DNA片段2。
將DNA片段1和2與開(kāi)環(huán)的pBluescript II(Stratagene，美國(guó))連接，所述開(kāi)環(huán)是用SalI，Hind III和小牛堿性磷酸酶處理獲得的。在所得質(zhì)粒的HindIII和EcoRI位點(diǎn)中，插入DNA片段pRC/RSV，其含有hG-CSF基因，后接牛生長(zhǎng)激素(Invitrogen，荷蘭)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，如此獲得載體pGbc-hGCSF。
將載體pGbc-hGCSF用BssHII和KpnI裂解，并將所得混合物在瓊脂糖凝膠上電泳，相繼用Geneclean II試劑盒(BIO101)和Elutip-d(Schleicher和Schuell，德國(guó))純化，用透析溶液(10mM Tris-Cl(Ph7.2)和0.1M EDTA)透析，然后用0.22um濾膜(Nalgene，美國(guó))過(guò)濾，獲得表達(dá)盒pGbc-hGCSF。將這樣獲得的表達(dá)盒用透析溶液稀釋為終濃度為4μg/ml。實(shí)施例2回收山羊受精卵
根據(jù)圖1所示進(jìn)度表，將由Konju Sabisung育種場(chǎng)提供的3年齡雌性韓國(guó)本地產(chǎn)山羊(Capra hircus aegagrus)，經(jīng)肌內(nèi)注射2ml含有3.0mg諾甲醋孕酮和5.0mg雌二醇的芝麻油。在除去耳毛及將耳部消毒后，使用Synchromate-B槍將植入物Synchromate-B(SanofiAnimal Health，美國(guó))插入消毒的耳部，然后在插入后第13或14天經(jīng)手術(shù)除去，以同步發(fā)情。
將5.6mg FSH(Ovagen，免疫化學(xué)制品，新西蘭)分成8劑，并如圖1所示從60小時(shí)開(kāi)始每12小時(shí)肌內(nèi)注射至山羊第一次注射0.7mg FSH和0.7mg PMSG(Pregnecol，Horizon Technology，澳大利亞)，第二次至第七次注射0.7mg FSH，在第八次注射0.7mg FSH和100IU hCG。使排卵的雌性山羊與雄性山羊(Capra hircusaegagrus)交配12小時(shí)。
在除去植入物后72-76小時(shí)，將2％甲苯噻嗪溶液(Rompun，Bayer，韓國(guó))肌內(nèi)注射至雌性山羊，此山羊在注射前已經(jīng)禁食24小時(shí)，并將此雌性山羊背部朝下定位。將10ml 2％的利多卡因注射至腹中線，以局部麻醉，并在腹中線作一個(gè)長(zhǎng)度為4-6cm的切口，以取出卵巢，輸卵管和子宮。將一個(gè)內(nèi)徑為1.0mm的聚乙烯導(dǎo)管插入輸卵管漏斗部并固定，將含有胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)通過(guò)導(dǎo)管導(dǎo)入，以反向從子宮流入輸卵管，以回收完整受精卵。將此完整的受精卵貯存于改良的合成輸卵管液中(mSOFTakahashi Y.等，獸類學(xué)37963-978(1991))，直至進(jìn)行以下微注射步驟。測(cè)試實(shí)施例1FSH和hCG對(duì)排卵和受精卵回收時(shí)間的作用(1)FSH與hCG的組合對(duì)排卵的影響
為測(cè)試hCG與FSH組合對(duì)韓國(guó)本地產(chǎn)山羊排卵的影響，重復(fù)實(shí)施例2的步驟，并進(jìn)行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，這組是在第8次只使用0.7mgFSH而沒(méi)有hCG，其余相同。在除去植入物后70-76小時(shí)，確定排卵率(排卵的山羊與全部山羊的數(shù)目比)，排卵點(diǎn)(每個(gè)排卵山羊的排卵卵泡的平均數(shù)目)，回收率(回收的卵母細(xì)胞與排卵卵泡的數(shù)目比)和受精率(具有原核的受精卵與回收的卵母細(xì)胞的數(shù)目比)。
結(jié)果示于表1。
表1hCG與FSH組合對(duì)排卵的影響
a、b是有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的(P＜0.05)
從表1可以看出，F(xiàn)SH+hCG組的排卵率(100％)高于FSH組(36.4％)，提示FSH和hCG組合在誘導(dǎo)排卵中是有效的。另一方面，在FSH+hCG組和FSH組中觀測(cè)的受精率相似，提示hCG對(duì)受精無(wú)傷害。因此，hCG可以用于增強(qiáng)排卵率而不阻止受精。
與只用FSH可以有效誘導(dǎo)其它種屬山羊排卵的報(bào)道(Selgrath J.P.等，獸類學(xué)34，1195-1205(1990)；Ebert，K.M.等，生物/技術(shù)12，699-702(1994)；和Gootwine，E.等，獸類學(xué)48，485-499)相反，F(xiàn)SH誘導(dǎo)的韓國(guó)本地產(chǎn)山羊的排卵率僅為36.4％。通過(guò)hCG和FSH組合在韓國(guó)本地產(chǎn)山羊中觀測(cè)的排卵率，可以歸因于韓國(guó)本地產(chǎn)山羊的固有生理特性所致。(2)當(dāng)組合給予hCG和FSH時(shí)，確定回收受精卵的最佳時(shí)間
為確定適于微注射的具有原核的單細(xì)胞階段受精卵的最佳回收時(shí)間，重復(fù)實(shí)施例2的步驟，除了受精卵的回收時(shí)間是在除去植入物后62-68，70-76和78-84小時(shí)。在解剖顯微鏡下觀測(cè)受精卵的發(fā)育階段。
結(jié)果示于表2。
表2當(dāng)組合給予FSH和hCG時(shí)，在各種回收時(shí)間內(nèi)受精卵的發(fā)育階段
c在除去植入物后經(jīng)過(guò)的時(shí)間
從表2中可以看出，在62-68小時(shí)回收的受精卵處于單細(xì)胞階段，受精率為30％。在70-76小時(shí)回收的受精卵中，受精率高得多(70％)，雖然形成了一些2細(xì)胞和4細(xì)胞階段的受精卵。在78-84小時(shí)回收的受精卵的單細(xì)胞階段受精卵含量更低。
因此，為獲得適于微注射的單細(xì)胞階段受精卵，需要在除去植入物后70-76小時(shí)回收受精卵。實(shí)施例3將表達(dá)盒微注射入山羊受精卵中
將在實(shí)施例2中獲得的受精卵在12000rpm離心7分鐘，以觀測(cè)每個(gè)單細(xì)胞階段受精卵的原核。在裝備微操作器(Leitz，德國(guó))的DIC倒置顯微鏡下(Leitz，德國(guó))，將1-2pl含有4μg/ml實(shí)施例1中獲得表達(dá)盒pGbc-hGCSF的DNA溶液，微注射入單細(xì)胞階段受精卵的雄性原核中。為使微注射期間pH的變化最小，使用TL-HEPES培養(yǎng)基(Hagen，D.R.，J.Anim.Sci.，69，1147-1150(1991))。將微注射的受精卵在mSOF培養(yǎng)基中，在37℃在5％CO2下培養(yǎng)直至移植。選擇經(jīng)過(guò)上述處理存活的單細(xì)胞階段受精卵。
這個(gè)受精卵稱為Capra hircus aegagrus 胚胎/pGbc-bGCSF，于1999年12月28日保藏在韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究中心(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韓國(guó))，保藏號(hào)KCTC 0718BP。實(shí)施例4將微注射的受精卵經(jīng)手術(shù)移植至受體山羊中
將自發(fā)發(fā)情期的1-3年齡的受體山羊(Capra hircus aegagrus)禁食24小時(shí)，然后將每個(gè)受體山羊的腹中線局麻，并切開(kāi)以取出卵巢，輸卵管和子宮。將在實(shí)施例3中獲得的單細(xì)胞-4細(xì)胞階段的受精卵，使用無(wú)菌導(dǎo)管經(jīng)輸卵管漏斗移植，所述導(dǎo)管是內(nèi)徑為0.5mm，外徑為0.8mm，長(zhǎng)度為20cm的聚乙烯管。每個(gè)受體接受的受精卵數(shù)目為2-4個(gè)。在移植后30天，受體山羊的妊娠情況用超聲診斷設(shè)備(Sonorex，Medison，韓國(guó))在移植后30天識(shí)別。使受精卵發(fā)育至生產(chǎn)以獲得25個(gè)子代山羊。測(cè)試實(shí)施例2對(duì)比自發(fā)發(fā)情的受體和激素誘導(dǎo)發(fā)情的受體的妊娠率和子代產(chǎn)生率
將在實(shí)施例3中獲得的微注射的受精卵，通過(guò)重復(fù)實(shí)施例4的步驟，分別移植至自發(fā)發(fā)情的和激素誘導(dǎo)發(fā)情的受體山羊中。激素應(yīng)答發(fā)情的受體山羊是通過(guò)重復(fù)實(shí)施例2的同步化步驟，隨后根據(jù)在除去植入物后48小時(shí)山羊?qū)に氐膽?yīng)答程度，肌內(nèi)注射400-600IU的PMSF而制備的。檢測(cè)其妊娠率和子代產(chǎn)生率。結(jié)果示于表3。
表3微注射的受精卵在移植后的妊娠率和子代產(chǎn)生率
從表3中可以看出，自發(fā)發(fā)情組的排卵點(diǎn)低于激素處理組，而自發(fā)發(fā)情組的妊娠率高于激素處理組。實(shí)施例5鑒別轉(zhuǎn)基因山羊(1)分離基因組DNA
從實(shí)施例4中獲得的10-30天齡的山羊中，切下每個(gè)山羊的一部分耳部組織，大小為0.5cm，然后移至一個(gè)15ml試管中，加入4ml裂解溶液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，0.1mM EDTA和0.5％SDS)。將所得混合物在55℃保持16小時(shí)以裂解組織。
將裂解的組織細(xì)胞經(jīng)苯酚提取和乙醇沉淀，根據(jù)Sambrook等所述方法進(jìn)行(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(1989))，以獲得純化的基因組DNA。將純化的DNA溶解于蒸餾水中至終濃度為0.5μg/ml。(2)PCR
將在(1)中獲得的1ul每個(gè)子代的基因組DNA進(jìn)行PCR，使用引物GB2(SEQ ID NO4)和GCSF2(SEQ ID NO5)或引物GB2(SEQID NO4)和GCSF3(SEQ ID NO6)。PCR是在94℃溫育4分鐘，以變性DNA；并重復(fù)30次熱循環(huán)，每次循環(huán)包括94℃1分鐘，55℃1分鐘，及72℃1分鐘。將這樣獲得的PCR產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺測(cè)序凝膠進(jìn)行電泳，隨后放射自顯影。引物GB2(SEQ ID NO4)具有β-酪蛋白基因有義鏈的5’部分(從1621-1640位核苷酸)的核苷酸序列，引物GCSF2(SEQ ID NO5)和GSF3(SEQ ID NO6)具有互補(bǔ)于hG-CSF有義鏈的3’部分的核苷酸序列(分別從第511-530位核苷酸，和第681-698位核苷酸)。
將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果示于圖2，其中泳道1-7是代表性子代山羊的PCR產(chǎn)物；泳道(-)，親代野生型山羊；泳道(+)，親代野生型山羊基因組DNA和質(zhì)粒pGbc-hGCSF的混合物。在圖2的第6泳道上，可以觀測(cè)到一條480bp的條帶，這是使用引物GB2(SEQ ID NO4)和GCSF2(SEQ ID NO5)經(jīng)PCR獲得的，和一條540bp的條帶，這是使用引物GB2(SEQ ID NO4)和GCSF3(SEQ ID NO6)經(jīng)PCR獲得的。這證實(shí)了泳道6的子代是導(dǎo)入表達(dá)盒pGbc-hGCSF的轉(zhuǎn)基因山羊。(3)Southern印跡分析
將在(1)中獲得的10μg子代基因組DNA用HindIII裂解，并將所得片段在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，并移至一個(gè)尼龍膜上，根據(jù)Sambrook等所述方法(如前)。將吸附DNA的尼龍膜用預(yù)雜交溶液(6×SSC，5×Denhardt’s試劑和0.5％SDS)，在68℃預(yù)雜交2小時(shí)，然后用32P標(biāo)記的hG-CSF探針雜交，所述探針是使用〔α-32P〕dCTP通過(guò)隨機(jī)引發(fā)hG-CSF基因的HindIII/NeaI片段而制備的。
在完成反應(yīng)后，將尼龍膜相繼用2×SSC/0.1％SDS溶液在室溫沖洗，用等體積的溶液在65℃沖洗10分鐘，及用1×SSC/0.1％SDS溶液在65℃沖洗10分鐘。將一個(gè)X光膠片置于尼龍膜上，并在-70℃曝光3天，然后顯影。
結(jié)果示于圖3，其中泳道1-7代表子代山羊的基因組DNA；泳道(-)，親代野生型山羊的基因組DNA；泳道(+)，親代野生型山羊基因組DNA和質(zhì)粒pGbc-hGCSF的混合物。圖3的結(jié)果提示泳道6的子代是導(dǎo)入表達(dá)盒pGbc-hGCSF的轉(zhuǎn)基因山羊。
通過(guò)重復(fù)上述步驟，在全部25個(gè)子代山羊中鑒別兩個(gè)轉(zhuǎn)基因山羊。實(shí)施例6對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊乳中含有的hG-CSF進(jìn)行Western印跡分析
在將實(shí)施例5中獲得的轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生后代之后，在第2天(初乳)和第5天收集乳。在乳中加入等體積的1×PBS，并將所得混合物在4℃保持1小時(shí)，然后在13000rpm離心15分鐘，獲得上清(乳清)。將2ul上清進(jìn)行15％SDS-PAGE。分別使用商購(gòu)的衍生自大腸桿菌的rHuG-CSF(Kirin，日本)和衍生自CHO細(xì)胞的rHuG-CSF(Jugai，日本)作為對(duì)照組，及親代野生型山羊的乳清，重復(fù)進(jìn)行上述步驟。將在凝膠上分離的蛋白質(zhì)移至硝基纖維素膜上(Amersham pharmacia biotech，美國(guó))是根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行(蛋白質(zhì)方法，Daniel Mbollag和Stuart J.Edelstein，Wiley-Liss，1991)。將此膜用封閉溶液(含有3％脫脂奶的1×PBS)在搖床中處理1小時(shí)。將此膜用一種溶液處理1小時(shí)，所述溶液是在搖床中通過(guò)用10ml封閉溶液將抗hG-CSF小鼠IgG(R&D系統(tǒng)，美國(guó))稀釋1000倍，并用300ml的1×PBS進(jìn)一步稀釋3倍而制備的。將此膜用10ml溶液處理1小時(shí)，所述溶液是用封閉溶液將辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗小鼠IgG抗體稀釋1000倍而制備的。將此膜用1×PBS處理5分鐘，共3次，并使用ECL試劑盒顯影(Amersham pharmaciabiotech，美國(guó))。
結(jié)果示于圖4，其中泳道1是50ng的rHuG-CSF；泳道2是100ng的大腸桿菌rHuG-CSF；泳道3是50ng CHO rHuG-CSF；泳道4是100ng的CHO rHuG-CSF；泳道5是轉(zhuǎn)基因山羊第2天的1μl乳清；泳道6是轉(zhuǎn)基因山羊第5天的1μl乳清；泳道S是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道(-)是親代野生型山羊的乳清。從圖4中可以看出在轉(zhuǎn)基因山羊的乳中存在一條大約18kDa蛋白質(zhì)的條帶，這與商購(gòu)的hG-CSF相同。另外，在第5天的乳清中該條帶密度比第2天乳清的強(qiáng)。這提示乳清中hG-CSF濃度為50-100ug/ml。因此，轉(zhuǎn)基因山羊在乳中釋放大量hG-CSF。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因山羊乳中hG-CSF濃度
為確定轉(zhuǎn)基因山羊乳中hG-CSF濃度，將在實(shí)施例6中獲得的轉(zhuǎn)基因山羊乳用緩沖溶液(20mM Trizma base pH7.4和1mM EDTA稀釋4倍，并在4℃以27000xg離心20分鐘，共進(jìn)行3次，以除去脂質(zhì)和糖。上清(乳清)中hG-CSF濃度使用商購(gòu)的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA(Cat#DCS50，R&D系統(tǒng)，美國(guó))確定。實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因山羊乳中包含的hG-CSF的活性
將源自人體骨髓的HL-60細(xì)胞(ATCC CCL-240)在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃在5％CO2的條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞數(shù)目調(diào)節(jié)為2.2×105個(gè)細(xì)胞/ml，并加入DMSO至終濃度為1.25％(v/v)。在低蒸發(fā)的96孔平板(NUNC，Denmark)的每個(gè)孔中加入90μl細(xì)胞培養(yǎng)物(大約2×104個(gè)細(xì)胞)，并在37℃在5％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。
將實(shí)施例6獲得的轉(zhuǎn)基因山羊的乳清，親代野生型山羊的乳清和商購(gòu)的hG-CSF(Choongwae Pharm公司)，均用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至hG-CSF終濃度為500ng/ml，并用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行相繼2倍稀釋。
將2μg商購(gòu)的hG-CSF(Choongwae Pharm公司)加入10ml親代野生型山羊的乳清中，獲得一種混合物，并將10μl的此混合物加入含有HL-60細(xì)胞的孔中，并在37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
為檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞的增殖度，將每個(gè)培養(yǎng)物均用CellTiter96TM處理(Cat#G4100，Promega，美國(guó))，并在670nm波長(zhǎng)測(cè)定其光密度。
結(jié)果示于圖5，其中●代表商購(gòu)的hG-CSF；■代表商購(gòu)的hG-CSF和親代野生型山羊乳清的混合物；▲代表轉(zhuǎn)基因山羊乳清；代表轉(zhuǎn)基因山羊乳清。從圖5中可以看出，轉(zhuǎn)基因山羊乳清的細(xì)胞增殖活性與商購(gòu)的hG-CSF相同，而親代野生型山羊的乳清對(duì)細(xì)胞增殖活性沒(méi)有影響。另外，HL-60細(xì)胞的增殖通過(guò)轉(zhuǎn)基因山羊的乳清中含有的hG-CSF誘導(dǎo)，其與已知的hG-CSF相同。
本發(fā)明參考優(yōu)選的實(shí)施方案已經(jīng)進(jìn)行了闡述和例證，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道在不偏離所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明加以改變和修改。
序列表
序列表<110>韓美藥品株式會(huì)社等<120>產(chǎn)生含有人粒細(xì)胞集落刺激因子的乳的轉(zhuǎn)基因山羊<130>PCA10106/HMY<150>KR2000-3187<151>2000-01-24<160>6<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>3686<212>DNA<213>人工序列<220><223>表達(dá)盒pGbc-hGCSF<220>啟動(dòng)子<221><222>(7)..(1763)<223>山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列<220><221>終止子<222>(3391)..(3679)<223>牛生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)錄終止區(qū)<220><221>基因<222>(1788)..(3390)<223>hG-CSF基因<400>1gagctcttta gtatattgtt aaggatttct tgatcaagat tttacctact tttctggtcc60aattggtgag agacagtcat aaggaaatgc tgtgtttatt gcacaatatg taaagcatct120tcctgagaaa ataaaaggga aatgttgaat gggaaggata tgctttcttt tgtattcctt180ttctgagaaa tcagactttt tcacctgtgg ccttggcaca aaagctaaca aataaaggca240tatgaagtag ccaaggcctt ttctagtata tctatgacac tgagttcatt tcatcattta300ttttcctgac ttcctcctgg gtccatatga gcagtcttag aatgaatatt agctgaataa360tccaaataca tagtagatgt tgatttgggt tttctaagca atccaagact tgtatgacag420taagatgtat taccatccaa caacacacat ctcagcatga tataaatgca aggtatattg480tgaagaaaaa tttttaatta tgtcaaagtg cttactttag aaggtcatct atctgtccca540aagctgtgaa 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cttgctttaa20<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GCSF3<400>6ctctcaccca cctcactc 18
權(quán)利要求
1.一種山羊受精卵，其包含一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體含有一個(gè)山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列和一個(gè)編碼人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的山羊受精卵，其中山羊是Capra hircus aegagrus。
3.權(quán)利要求1的山羊受精卵，其中核酸構(gòu)建體是表達(dá)載體pGb-hGCSF(SEQ ID NO1)。
4.權(quán)利要求3的山羊受精卵，其是Capra hircus aegagrus胚胎/pGbc-bGCSF(KCTC 0718BP)。
5.一種制備權(quán)利要求1的山羊受精卵的方法，包括將含有山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列和編碼hG-CSF的核苷酸序列的一種核酸構(gòu)建體微注射至完整的山羊受精卵中。
6.一種制備完整山羊受精卵的方法，包括同步化一個(gè)雌性山羊，使其超排卵，將超排卵的雌性山羊與雄性山羊交配，并從交配的雌性山羊中回收受精卵，特征在于同步化步驟是通過(guò)將諾甲醋孕酮和雌二醇給予雌性山羊，將含有諾甲醋孕酮的植入物插入雌性山羊中以及除去植入物而進(jìn)行；所述超排卵步驟通過(guò)以預(yù)定的時(shí)間間隔相繼給予雌性山羊以組合劑量的孕馬血清促性腺激素(PMSG)和卵泡刺激素(FSH)，分劑量的FSH和組合劑量的FSH和人絨毛膜促性腺激素(hCG)而進(jìn)行。
7.權(quán)利要求6的方法，其中山羊是Capra hircus aegagrus；而且在同步化步驟中，給予PMSG和FSH是在除去植入物之前60小時(shí)進(jìn)行的，F(xiàn)SH是在給予PMSG和FSH之后每12小時(shí)給予一次，共6次，而FSH和hCG是在此之后12小時(shí)給予的。
8.一種產(chǎn)生含有hG-CSF的乳的轉(zhuǎn)基因山羊，其是由權(quán)利要求1-4的任一種山羊受精卵發(fā)育的。
9.一種制備權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因山羊的方法，包括將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的山羊受精卵移至一個(gè)雌性山羊中，并使受精卵發(fā)育直至生產(chǎn)。
10.一種生產(chǎn)hG-CSF的方法，包括從權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因山羊中產(chǎn)生乳，并從乳中回收hG-CSF。
11.一種含有hG-CSF的乳組合物，其產(chǎn)自權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因山羊。
12.通過(guò)權(quán)利要求10的方法產(chǎn)生的hG-CSF。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求12的hG-CSF和一種藥物適當(dāng)?shù)妮d體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因山羊，其是從一種山羊受精卵發(fā)育而來(lái)，其包含一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體含有山羊β－酪蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列和編碼hG－CSF的核苷酸序列，該轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生含有高濃度生物活性hG－CSF的乳。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1396805SQ0180407
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2001年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月24日
發(fā)明者陳承嫄, 李斗秀, 宋臺(tái)憲, 崔仁榮, 俞昱濬, 高正浩, 具滋信, 申相泰, 李喆祥, 方南洙, 具德本, 吳建奉, 樸貞宣, 尹佑識(shí), 鄭菊冬, 金善正, 韓龍萬(wàn), 李景廣 申請(qǐng)人:韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社, 韓國(guó)生命工學(xué)研究院, 韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院