專利名稱：五碳糖和糖醇的生產(chǎn)的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在重組宿主中經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)五碳的醛糖和酮糖以及糖醇的方法。特別地，本發(fā)明涉及如下重組宿主，它們經(jīng)改造增強(qiáng)了戊糖磷酸途徑中間物的產(chǎn)生，或者增強(qiáng)了木糖醇、D-阿拉伯糖醇、D-阿拉伯糖、D-來(lái)蘇糖、核糖醇、D-核糖、D-核酮糖、D-木糖和/或木酮糖中一種或多種的產(chǎn)生，并涉及利用這些宿主生產(chǎn)它們的方法。
背景技術(shù)：
五碳糖和五碳糖醇作為增甜劑有多種用途。例如，木糖醇被廣泛用作一種不造成齲齒的替代增甜劑。D-核酮糖和D-木酮糖、以及除木糖醇之外的糖醇，也可以以游離單糖的形式用作增甜劑，或者用作寡糖的組分。在此方面，葡糖-木酮糖，蔗糖地一種結(jié)構(gòu)接近類似物，可以很容易地從蔗糖和D-木酮糖進(jìn)行合成(Kitaoka，K.，等，Oyo Toshitsu Kagaku41(2)165-72(1994))。
五碳糖和五碳糖醇也可以用于藥物和功能性食品成分等的有機(jī)和酶促合成。D-阿拉伯糖和D-來(lái)蘇糖從結(jié)構(gòu)上都與D-核糖(核苷/核苷酸的天然糖組分)非常相似，并且是許多藥物和藥物制劑的成分。
五碳糖和五碳糖醇可以作為微生物如細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)碳源。另外，在酶的實(shí)驗(yàn)室分析中它們被用作生化試劑，即以五碳糖和糖醇作為底物，以及在糖和糖醇的色譜分析中用作標(biāo)準(zhǔn)物。
如果一種糖能夠通過(guò)一種非重組微生物或動(dòng)物宿主進(jìn)行酶促合成，就說(shuō)這種糖是“天然合成的”。天然合成的五碳糖及其相應(yīng)醇的前體通常是戊糖磷酸途徑(PPP)中的糖中間物。以5-磷酸化或非磷酸化的形式存在的這些中間物本身作為其它各種有用化合物的化學(xué)前體是極有價(jià)值的。這些化合物包括，例如，核苷和核黃素(從PPP代謝物D-核糖5-磷酸衍生得到)，以及葉酸、泛醌和各種芳香氨基酸(從PPP代謝物D-赤蘚糖4-磷酸衍生得到)。這些氨基酸又是類黃酮和生物堿的前體。因此，能夠提高原材料如己糖向所需的PPP糖中間物如核糖-5-P、核酮糖-5-P或木酮糖-5-P轉(zhuǎn)化，并由此也提高所需下游代謝物產(chǎn)量的方法和宿主，將具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這些化合物可以被提取或分離出來(lái)，就此或作為其它代謝/或化學(xué)反應(yīng)的前體在體內(nèi)或體外用于生產(chǎn)出有用的產(chǎn)物。
美國(guó)專利5,798,237(Picataggio，S.K.等)報(bào)道了一種使用木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因進(jìn)行遺傳工程改造后能夠發(fā)酵含有木糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)得到乳酸的重組乳桿菌(Lactobacillus)。
Jeffries等人報(bào)道了為了有效地從木糖產(chǎn)生乙醇在酵母中進(jìn)行的木糖發(fā)酵遺傳工程。Jeffries，T.W.等，“在酵母中進(jìn)行的木糖發(fā)酵遺傳工程”(Genetic Engineering of Xylose Fermentation in Yeasts)，http//calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/bioprocessing/xoferm/xoferm.html。此酵母的特點(diǎn)是具有指導(dǎo)碳流從五碳糖木糖進(jìn)入二碳終產(chǎn)物醇(乙醇)的能力，這最可能經(jīng)過(guò)的途徑涉及PPP轉(zhuǎn)酮酶，該酶沿著促使碳流遠(yuǎn)離PPP中間物累積的方向起作用。
Aristidou，A.等.，WO 99/46363報(bào)道的酵母中，通過(guò)過(guò)表達(dá)NAD谷氨酸脫氫酶或蘋果酸酶，改進(jìn)了與吡啶核苷酸連接的脫氫酶反應(yīng)的偶聯(lián)，該酵母不僅顯示出可以更高效率地從木糖產(chǎn)生乙醇，而且也顯示出提高了從木糖產(chǎn)生木糖醇的量。
然而，目前幾乎沒(méi)有人從相反方向?qū)ξ⑸镞M(jìn)行修飾，以改變碳流方向使之遠(yuǎn)離糖酵解或乙醇的形成進(jìn)入PPP途徑，并累積PPP中間物以及由它們衍生的糖或糖醇。例如，U.S.5,281,531(Miyagawa，K.等)報(bào)道了在一種芽孢桿菌屬(Bacillus)宿主中生產(chǎn)D-核糖的方法，其中葡糖酸操縱子(它是編碼有關(guān)葡糖酸吸收和代謝的蛋白)被部分或完全修飾以使葡糖酸操縱子可以進(jìn)行高度表達(dá)。具體地，gntR基因被缺失或滅活，并且啟動(dòng)子被另一個(gè)啟動(dòng)子所代替。
利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)通過(guò)發(fā)酵已經(jīng)從葡萄糖生產(chǎn)出D-核糖(U.S.專利No.3,607,648)。對(duì)利用從自然界中分離的一些細(xì)菌，通過(guò)葡萄糖發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)D-木酮糖和D-核酮糖的方法也已有描述(加拿大專利840981)。
U.S.3,970,522(Sasajima，K.-I.等)報(bào)道了在具有高2-脫氧葡萄糖氧化活性的芽孢桿菌屬菌株中生產(chǎn)D-核糖。在一個(gè)菌株內(nèi)，芽孢桿菌還缺失轉(zhuǎn)酮酶和D-核酮糖磷酸3-差向異構(gòu)酶中的至少一種酶。
Onishi等發(fā)展了一種多階段方法用于生產(chǎn)木糖醇，其中首先利用嗜高滲酵母發(fā)酵葡萄糖得到阿拉伯糖醇。然后利用不同的菌株，在第二步發(fā)酵中將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化成D-木酮糖。最后，利用第三種菌株在第三步發(fā)酵中，通過(guò)發(fā)酵將D-木酮糖還原成木糖醇(Onishi，H.和Suzuki，T.，Appl.Microbiol.181031-1035(1969)).。
Harkki等發(fā)展了一種將葡萄糖轉(zhuǎn)化成木糖醇的單階段發(fā)酵方法，并首先提出直接對(duì)PPP途徑進(jìn)行修飾以便在單個(gè)宿主中從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇(U.S.專利No.5,631,150)。
上述許多微生物方法所利用的細(xì)菌菌株都是從自然界分離得到的。大多數(shù)方法沒(méi)有教導(dǎo)進(jìn)一步提高微生物天然能力以生產(chǎn)這些糖或糖醇或者擴(kuò)大有用發(fā)酵產(chǎn)物的譜系的方法。盡管Harkki等人的研究(U.S.5,631,150)對(duì)獲得代謝工程宿主的方法和在這些宿主中生產(chǎn)木糖醇的方法(尤其是通過(guò)過(guò)表達(dá)PPP的氧化階段的基因)進(jìn)行了描述，但明顯地，增加經(jīng)過(guò)PPP途徑的代謝流量的其它方法將不僅有益于五碳糖的生產(chǎn)，也有益于任何來(lái)源于PPP的產(chǎn)物或產(chǎn)物前體的生產(chǎn)。
發(fā)明概述
在研究葡萄糖向木糖醇的生物轉(zhuǎn)化的同時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩種產(chǎn)生木糖醇的新途徑。本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)各種五碳糖(醛糖和酮糖)以及糖醇，包括木糖醇的生產(chǎn)，可以通過(guò)利用六碳糖如葡萄糖作為碳源并利用如下微生物宿主來(lái)增強(qiáng)，所述微生物中PPP途徑中的一個(gè)或多個(gè)酶促步驟或其它的所需酶促步驟通過(guò)代謝工程的方法在遺傳上缺失、添加、增強(qiáng)或否則修飾。具體地，本發(fā)明提供能夠增加進(jìn)入PPP途徑的己糖碳流的宿主，并提供一系列用于利用這些宿主生產(chǎn)所需糖或糖醇，尤其是木糖醇的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在遺傳修飾的宿主中通過(guò)順序地將木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成木糖醇-1-磷酸(例如，利用木糖醇1-磷酸脫氫酶)生產(chǎn)木糖醇的新路線。例如利用適當(dāng)?shù)牧姿崦笇⒛咎谴?1-磷酸轉(zhuǎn)化成木糖醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在遺傳修飾宿主中生產(chǎn)阿拉伯糖醇，此阿拉伯糖醇是利用阿拉伯糖醇-5-磷酸脫氫酶從核酮糖-5-磷酸產(chǎn)生的。本發(fā)明還涉及一種新的葡萄糖吸收機(jī)制，它通過(guò)過(guò)表達(dá)枯草芽孢桿菌glcUgdh的操作子，導(dǎo)致葡萄糖和來(lái)源于葡萄糖的中間物進(jìn)入戊糖磷酸的流量增加。本發(fā)明還涉及經(jīng)過(guò)遺傳修飾增強(qiáng)了glcUgdh操作子的表達(dá)的宿主。
除遺傳修飾之外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)可以利用發(fā)酵條件進(jìn)一步增加和調(diào)整根據(jù)本發(fā)明方法由特定宿主產(chǎn)生的五碳碳水化合物的譜系。
因此本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵六碳糖(優(yōu)選葡萄糖)，在單一微生物宿主中經(jīng)過(guò)遺傳修飾并工程化的途徑生產(chǎn)五碳糖和糖醇(尤其是木糖醇)、以及其它的PPP中間物或來(lái)源于它們的產(chǎn)物的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼木糖醇磷酸脫氫酶(XPDH)、或阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶(APDH)的純化的和/或分離的多核苷酸，用于表達(dá)和維持它們的重組載體和宿主，以及這些構(gòu)建體對(duì)于在重組微生物宿主中生產(chǎn)木糖醇和/或阿拉伯糖醇所具有的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及純化的和/或分離的由這些多核苷酸編碼的XPDH或APDH蛋白，或者含有由這些宿主產(chǎn)生的該XPDH或APDH蛋白的制備物，以及該XPDH或APDH特別是在木糖醇和/或阿拉伯糖醇的生產(chǎn)中的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用這些多核苷酸和表達(dá)它們的本發(fā)明重組載體和宿主制備XPDH或APDH的方法，以及該XPDH或APDH尤其是對(duì)于在遺傳修飾的宿主中生產(chǎn)戊糖磷酸中間物以及來(lái)源于它們的產(chǎn)物(例如分別地木糖醇或阿拉伯糖醇)所具有的用途。
附圖簡(jiǎn)述
附

圖1.在質(zhì)粒p131中枯草芽孢桿菌rpi基因區(qū)域的限制性圖譜。
附圖2.質(zhì)粒p131Cm-2的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖3.質(zhì)粒pBS的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖4.質(zhì)粒pBS(AR2T)的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖5.質(zhì)粒pBS(AR2T)-Kan的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖6.質(zhì)粒pGT21的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖7.質(zhì)粒pGT23的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖8.質(zhì)粒pGT24和pGTK24的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖9.質(zhì)粒pGTK24(MXD2)的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖10.質(zhì)粒pTKTE1的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。
附圖11.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的pAOS 63的遺傳圖譜。
附圖12.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的pAOS 67的遺傳圖譜。
附圖13.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的pAOS 64的遺傳圖譜。
附圖14.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的pAOS 66的遺傳圖譜。
附圖15.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B995的遺傳圖譜。
附圖16.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B1068的遺傳圖譜。
附圖17.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B1154的遺傳圖譜。
附圖18.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B1449的遺傳圖譜。
附圖19.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B1003的遺傳圖譜。
附圖20.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B1187的遺傳圖譜。
附圖21.顯示有相關(guān)表達(dá)盒和限制性位點(diǎn)的B1011的遺傳圖譜。
附圖22.PGI1和PGI1，IDP2缺陷型菌株在不同葡萄糖濃度中的生長(zhǎng)。
附圖23.質(zhì)粒pGTK74的構(gòu)建。
附圖24(A和B).附圖24A質(zhì)粒pGTK74(LRXPDH)的構(gòu)建。附圖24B質(zhì)粒pGTK74 BHDH2)的構(gòu)建。
附圖25(A和B).附圖25A質(zhì)粒pGTK24(GDOP)的構(gòu)建。附圖25B質(zhì)粒pGTK74(GDOP)的構(gòu)建。
附圖26.在轉(zhuǎn)化了BD170[pGTK24(GDOP)]的枯草芽孢桿菌菌株和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照菌株中的葡萄糖吸收(1％葡萄糖)速率(cpm比min)。
附圖27(A和B).附圖27A表達(dá)載體pGTK74(APDH)的構(gòu)建。附圖27B表達(dá)載體pGTK74(BHDH)的構(gòu)建。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
許多糖可以既以D-構(gòu)型又以L-構(gòu)型存在。如果沒(méi)有明確的說(shuō)明，并且如果所列的糖或糖醇能夠以D-構(gòu)型和L-構(gòu)型存在，那么旨在指所列的糖或糖醇的D-構(gòu)型。
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)具有D-構(gòu)型的糖以及相應(yīng)的糖醇，優(yōu)選5-碳糖和糖醇，最優(yōu)選木糖醇的方法，該方法通過(guò)代謝利用葡萄糖或其它合適碳源，尤其是通過(guò)對(duì)它們進(jìn)行發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供方法以提高流入戊糖磷酸途徑中間物核酮糖-5-P、木酮糖-5-P和核糖-5-P以及由此流入它們的衍生產(chǎn)物中的碳源如葡萄糖。本發(fā)明還提供了應(yīng)用于此方法的經(jīng)過(guò)遺傳修飾的宿主，以及制備這些宿主的方法。
根據(jù)本發(fā)明，所需糖或糖醇的生產(chǎn)是在經(jīng)過(guò)一定方式的遺傳修飾的微生物宿主中，通過(guò)從前體代謝產(chǎn)生糖或糖醇來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中微生物宿主的遺傳修飾導(dǎo)致，與宿主經(jīng)過(guò)遺傳修飾之前在相同條件和相同時(shí)間下產(chǎn)生的所需糖或糖醇的量比較，所需糖或糖醇的產(chǎn)生增強(qiáng)。此產(chǎn)生的增強(qiáng)可以反映生產(chǎn)總量或生產(chǎn)率的提高或比生產(chǎn)力的提高。該遺傳修飾可以例如通過(guò)失活一種或多種基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述基因編碼的酶能夠降解或者利用所需要的產(chǎn)物，或能夠抑制或阻遏所需產(chǎn)物在宿主中的產(chǎn)生。這種失活通常會(huì)導(dǎo)致宿主缺少靶基因的表達(dá)產(chǎn)物，或者缺少如下這樣一種基因的表達(dá)產(chǎn)物，這種基因的表達(dá)是與失活基因的功能可操作連接的。一種物質(zhì)如蛋白質(zhì)或酶的“缺少”是指與失活之前宿主表達(dá)的蛋白質(zhì)或酶的水平相比較，失活后宿主中含有的蛋白質(zhì)或酶的水平減少，并且包括由于基因失活完全缺失這種蛋白質(zhì)或酶的宿主。
遺傳修飾也可以例如通過(guò)過(guò)表達(dá)一種或多種其它基因來(lái)完成，所述這些基因編碼能增加尤其是在遺傳修飾宿主的培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的量的蛋白質(zhì)，尤其是酶。還可以對(duì)宿主進(jìn)行遺傳修飾使之包含既能提高產(chǎn)量又能減少所需糖或糖醇降解的一組修飾。另外，也可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)臈l件下對(duì)經(jīng)過(guò)遺傳修飾的微生物宿主進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步提高所需糖或糖醇在本發(fā)明宿主中的產(chǎn)量。
其合成可以按照本發(fā)明的方法進(jìn)行增強(qiáng)的糖(碳水化合物)的實(shí)例包括，尤其是，天然產(chǎn)生的具有D-構(gòu)型的糖，特別是具有D-構(gòu)型的五碳醛糖。本發(fā)明的方法不包括生產(chǎn)D-核糖的具體方法(美國(guó)專利3,607,648，3,970,522)。
“代謝途徑”是指在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列兩種或多種酶反應(yīng)，其中一種酶反應(yīng)的產(chǎn)物成為下一個(gè)化學(xué)反應(yīng)的底物。在代謝途徑的每一步，都形成中間代謝化合物并且其被用作下一步的底物。這些化合物被稱為“代謝中間物”。每一步的產(chǎn)物也被稱為“代謝物”。特定途徑的中間物可以以途徑名稱來(lái)提及。例如戊糖磷酸途徑(PPP)中的中間物可被稱為PPP中間物。
在最簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下經(jīng)過(guò)遺傳修飾的宿主，與工程化之前在同等培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的糖中間物的量進(jìn)行比較，該修飾后的宿主能夠在指定的時(shí)段內(nèi)產(chǎn)生增加量的一種或多種特異性PPP糖中間物。PPP糖中間物指是PPP途徑中間物的糖，尤其是指D-核糖-5-磷酸(D-核糖-5-P)，核酮糖-5-磷酸(核酮糖-5-P)，D-木酮糖-5-磷酸(D-木酮糖-5-P)，D-景天庚酮糖-7-磷酸(D-景天庚酮糖-7-P)，D-甘油醛-3-磷酸(D-甘油醛-3-P)和D-赤蘚糖-4磷酸(D-赤蘚糖-4-P)。本發(fā)明也涉及制備這些宿主的方法，和利用這些宿主生產(chǎn)，提取和純化一種或多種所列糖的方法，以便以粗細(xì)胞提取物、部分純化(優(yōu)選無(wú)細(xì)胞)或分離的形式提供這些糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)過(guò)遺傳修飾的宿主，它能夠產(chǎn)生增加量的一種或多種特異性糖或糖醇，尤其是五碳糖或糖醇，在本發(fā)明的重組宿主中上述所列的一種或多種PPP糖中間物是這些糖或糖醇的代謝前體，該增加量是在指定的時(shí)段內(nèi)與工程化之前在同等培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的糖中間物的量進(jìn)行比較而言的。尤其是，該宿主經(jīng)過(guò)工程化能夠使D-阿拉伯糖醇(也稱D-arabinitol)、D-阿拉伯糖、D-來(lái)蘇糖、核糖醇、D-核糖、D-核酮糖、木糖醇、D-木糖、和D木酮糖中的一種或多種的產(chǎn)量增加。本發(fā)明也涉及制備這類宿主的方法，和利用此宿主生產(chǎn)、提取和純化一種或多種所列糖或糖醇的方法，以便以粗細(xì)胞提取物、部分純化(優(yōu)選無(wú)細(xì)胞)或分離的形式提供這些糖或糖醇。
PPP途徑的中間物可以作為其它糖的代謝前體。例如，許多微生物(細(xì)菌和真菌，包括酵母)以核酮糖-5-P作為核酮糖的前體。具有或者經(jīng)過(guò)工程化后具有核酮糖還原酶(NADPH)形式的阿拉伯糖醇脫氫酶的微生物，能夠從核酮糖產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇。核酮糖也可以作為D-阿拉伯糖(通過(guò)利用L-巖藻糖異構(gòu)酶的途徑)和核糖醇(經(jīng)過(guò)核糖醇脫氫酶)的前體。因此，此處所用的術(shù)語(yǔ)“核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物”包括核酮糖、核糖醇、D-阿拉伯糖醇及D-阿拉伯糖和核糖醇，以及它們的混合物，但并不限制于這些實(shí)例。
木酮糖-5-P也可以作為包括木酮糖在內(nèi)的幾種重要產(chǎn)物的前體，這些產(chǎn)物又可以作為D-來(lái)蘇糖(經(jīng)過(guò)甘露糖異構(gòu)酶)和D-木糖(經(jīng)木糖異構(gòu)酶)的前體。因此，此處所用的術(shù)語(yǔ)“木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物”包括木酮糖、D-來(lái)蘇糖、和D-木糖、以及它們的混合物，但并不限制于這些實(shí)例。
例如，遺傳修飾導(dǎo)致木酮糖-5-P相對(duì)量提高的菌株可以進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳修飾，以得到木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物如木糖醇的產(chǎn)量增加的菌株。類似地，經(jīng)遺傳修飾提高了核糖-5-P的量或者提高了流向核糖-5-P的碳流的菌株，可以進(jìn)行進(jìn)一步修飾以提高核糖-5-P衍生產(chǎn)物的產(chǎn)量，尤其是核苷酸和核黃素的產(chǎn)量，或D-赤蘚糖-4-P及其產(chǎn)物如葉酸、泛醌和各種芳香氨基酸的產(chǎn)量。類似地，正如此處描述的對(duì)于產(chǎn)物如糖醇，在積累核糖-5-P或提高了流向核糖-5-P的碳流的菌株中核糖-5-P衍生產(chǎn)物的產(chǎn)生，可以通過(guò)對(duì)導(dǎo)致這些產(chǎn)物產(chǎn)生的隨后/下游代謝反應(yīng)進(jìn)行遺傳修飾得以進(jìn)一步提高。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了生產(chǎn)D-阿拉伯糖，D-來(lái)蘇糖和D-木糖的新方法。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了生產(chǎn)五碳D-酮糖(即，D-核酮糖和D-木酮糖)以及所有可以從D-戊糖衍生得到的五碳戊糖醇(即，木糖醇、D-阿拉伯糖醇和核糖醇)的方法。生產(chǎn)木糖醇的方法是特別優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明也提供改變五碳碳水化合物產(chǎn)物譜系(相互比較時(shí)的相對(duì)量)的方法，其中所述五碳碳水化合物是，尤其在本發(fā)明的宿主中，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵條件由葡萄糖和其它碳源(尤其是在糖酵解途徑中能夠通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化成六碳糖中間物的碳源)發(fā)酵產(chǎn)生的。利用本發(fā)明的方法，人們可以通過(guò)發(fā)酵葡萄糖和其它六碳糖獲得增加水平的來(lái)源于PPP中間物的任何天然合成的五碳糖或糖醇，所述糖或糖醇或者具有D-構(gòu)型或來(lái)源于具有此構(gòu)型的糖或糖醇。尤其是可以生產(chǎn)D-核酮糖、D-核糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖、D-來(lái)蘇糖、D-木糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇，而且也可以生產(chǎn)從PPP中間物衍生的其它產(chǎn)物。
本發(fā)明的宿主和方法可通過(guò)在微生物宿主內(nèi)并入設(shè)計(jì)以實(shí)現(xiàn)下列目的單一遺傳修飾或幾種不同遺傳修飾的組合來(lái)獲得或?qū)崿F(xiàn)
a)破壞或降低一個(gè)或多個(gè)酶促步驟或者底物轉(zhuǎn)運(yùn)步驟，尤其是
糖運(yùn)輸步驟的活性；
b)引入一個(gè)或多個(gè)新的所需酶活性或者糖運(yùn)輸活性；
c)過(guò)表達(dá)已存在于宿主中的一個(gè)或多個(gè)所需酶活性或者糖運(yùn)輸
活性；
或者
d)(a)和(b)和(c)的任何組合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主經(jīng)過(guò)遺傳修飾，使PPP途徑的非氧化階段中包含受到破壞的一個(gè)或多個(gè)酶促步驟，和/或使間接影響通過(guò)PPP途徑的碳流的一個(gè)或多個(gè)酶促步驟受到破壞。
本發(fā)明的遺傳修飾集中在編碼影響糖代謝、參與碳水化合物代謝的幾個(gè)關(guān)鍵部分的蛋白質(zhì)，尤其是酶的基因上。從這方面來(lái)說(shuō)最重要的部分包括戊糖磷酸途徑(PPP)的非氧化階段；PPP的氧化階段；糖酵解(Embden-Meyerhof)途徑的上半部(即在醛縮酶之前)；和原核生物的糖吸收系統(tǒng)(PTS系統(tǒng))。另外，可以靶向由多元醇脫氫酶、醛糖異構(gòu)酶和酮糖差向異構(gòu)酶以及糖去磷酸化酶催化的各種獨(dú)立的代謝反應(yīng)。
PPP的反應(yīng)被分成氧化階段，以及由隨后的一系列反應(yīng)組成的非氧化階段。經(jīng)氧化還原酶如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶催化的反應(yīng)構(gòu)成了氧化階段。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成葡糖酸內(nèi)酯-6-磷酸，后者很快經(jīng)化學(xué)(在一些宿主中是酶)的作用轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖酸。然后6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶催化6-磷酸葡萄糖酸轉(zhuǎn)化成核酮糖-5-P。
PPP中非氧化階段的特征在于以下幾種酶的催化活性(1)核糖-5-P異構(gòu)酶(也稱核酮糖-5-P異構(gòu)酶)，(2)核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶，(3)轉(zhuǎn)酮酶和(4)轉(zhuǎn)醛醇酶。在PPP的非氧化階段中，核酮糖-5-P被核糖-5-P異構(gòu)酶異構(gòu)化成核糖-5-P。在核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶的作用下，核酮糖-5-P也可以被差向異構(gòu)化變成木酮糖-5-P。轉(zhuǎn)酮酶將核糖-5-P和木酮糖-5-P轉(zhuǎn)化成甘油醛-3-P和景天庚酮糖-7-P。轉(zhuǎn)醛醇酶獲取甘油醛-3-P和景天庚酮糖-7-P并將它們轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸和赤蘚糖-4-P。轉(zhuǎn)酮酶隨后以赤蘚糖-4-P和木酮糖-5-P為底物并將它們轉(zhuǎn)化成甘油醛-3-P和果糖-6-P。
經(jīng)過(guò)修飾在戊糖磷酸途徑的非氧化階段具有一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾的宿主是本發(fā)明特別優(yōu)選的宿主。優(yōu)選地，失活PPP非氧化階段的一種或多種酶，以便經(jīng)過(guò)PPP非氧化階段的碳流在需要被阻斷的位點(diǎn)被破壞，從而使得碳流改變方向進(jìn)入所需化合物的產(chǎn)生過(guò)程。這樣，在此宿主中，經(jīng)過(guò)PPP非氧化階段的天然碳流減弱或者完全停止。這可以優(yōu)選通過(guò)對(duì)一種或多種編碼核酮糖-5-P異構(gòu)酶、核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮酶、和轉(zhuǎn)醛醇酶的基因進(jìn)行破壞來(lái)達(dá)到。如下文詳細(xì)討論的，這種破壞既可以通過(guò)隨機(jī)化學(xué)突變和篩選來(lái)完成，又可以通過(guò)定向誘變技術(shù)如基因破壞來(lái)完成。
為了增加核酮糖-5-P和核酮糖-5-P衍生物的產(chǎn)量，特別優(yōu)選對(duì)核糖-5-P異構(gòu)酶基因進(jìn)行破壞或失活。作為替代方案或此外，對(duì)核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶基因進(jìn)行破壞或失活是極為理想的。將這樣的宿主在六碳糖如葡萄糖、或者能夠轉(zhuǎn)化成葡萄糖或葡萄糖的六碳糖代謝物如葡萄糖-6-P的糖上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)入PPP的碳流被擋在或阻塞在核酮糖-5-P步驟，由此導(dǎo)致該中間物累積，并導(dǎo)致在能產(chǎn)生核酮糖-5-P衍生物的那些宿主中從核酮糖-5-P流向核酮糖-5-P衍生物的碳流增加。生產(chǎn)被“阻擋”或“阻塞”在某一特定步驟，是指在此步驟宿主對(duì)化合物的利用率或降解率低于化合物的合成率，以致相對(duì)于在同等條件下生長(zhǎng)的未經(jīng)修飾的宿主，化合物的量增加。
為了增加木酮糖-5-P和木酮糖-5-P衍生物的產(chǎn)量，極優(yōu)選對(duì)編碼核糖-5-P異構(gòu)酶的基因進(jìn)行破壞或失活。編碼核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶的基因優(yōu)選保持完整，否則引入此基因的額外拷貝(既可以是同源的也可以是異源的，但是優(yōu)選來(lái)自同種的同源拷貝)，以便增加流向木酮糖-5-P的碳流。當(dāng)構(gòu)建能夠增強(qiáng)產(chǎn)生木酮糖-5-P的宿主時(shí)，另外還特別優(yōu)選對(duì)轉(zhuǎn)酮酶基因進(jìn)行失活。將這樣的宿主在六碳糖如葡萄糖、或者其六碳糖代謝物如葡萄糖-6-P上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)入PPP的碳流在木酮糖-5-P階段受到阻擋或阻塞，由此導(dǎo)致該中間物的累積，并導(dǎo)致在能夠產(chǎn)生木酮糖-5-P衍生物的宿主中從木酮糖-5-P向木酮糖-5-P衍生物的碳流增加。
編碼核糖-5-P異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮酶和/或轉(zhuǎn)醛醇酶的基因的失活能夠阻斷、或明顯地減少PPP途徑的碳流沿著形成糖酵解途徑中間物的方向流出PPP途徑?；蛘?，失活轉(zhuǎn)酮酶基因、或再另外失活轉(zhuǎn)醛醇酶基因，甚至不失活核糖-5-P異構(gòu)酶基因，也可用于在那些酶促步驟阻斷碳從PPP途徑流失而進(jìn)入糖酵解途徑，但是仍舊允許產(chǎn)生核糖-5-P及其衍生物。
其中失活核糖-5-P異構(gòu)酶的上述基因失活導(dǎo)致，與未經(jīng)修飾的宿主比較，核酮糖-5-P和木酮糖-5-P中的一者或兩者出現(xiàn)累積，或者導(dǎo)致一種或多種在其合成途徑中核酮糖-5-P或木酮糖-5-P是代謝前體的代謝產(chǎn)物出現(xiàn)累積。
當(dāng)多個(gè)編碼轉(zhuǎn)酮酶或D-核糖-5-磷酸異構(gòu)酶的幾種同工酶的基因存在于宿主中時(shí)，如釀酒酵母的轉(zhuǎn)酮酶基因和大腸桿菌的D-核糖-5-磷酸異構(gòu)酶基因，則優(yōu)選將所有編碼那些酶的基因進(jìn)行失活。根據(jù)不同的應(yīng)用(即，是否需要碳流進(jìn)入木酮糖-5-P)，可以對(duì)編碼D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶的基因進(jìn)行失活，或者過(guò)表達(dá)。實(shí)施本發(fā)明最優(yōu)選的模式是對(duì)存在于所選宿主中的所有D-核糖-5-磷酸異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮酶基因進(jìn)行失活。
本發(fā)明的宿主也可以被設(shè)計(jì)成過(guò)表達(dá)如下一種或多種所需要的基因，所述基因編碼的蛋白質(zhì)已經(jīng)存在于宿主中并且能夠催化特定的五碳糖和糖醇之間的相互轉(zhuǎn)化?；蛘?，本發(fā)明的宿主可被設(shè)計(jì)成表達(dá)期望的但宿主以前缺少的酶活性。在本發(fā)明的宿主和方法中作為引入和/或過(guò)表達(dá)的靶的這類基因的實(shí)例，包括編碼多元醇脫氫酶如木糖醇脫氫酶、阿拉伯糖醇脫氫酶或核糖醇脫氫酶的基因。類似地，編碼作用于中性糖的各種異構(gòu)酶和差向異構(gòu)酶的基因也被認(rèn)為屬于這一類。這類異構(gòu)酶和差向異構(gòu)酶的實(shí)例有L-果糖異構(gòu)酶(Garcia-Junceda E.，等，Bioorg.Med.Chem.31349-1355(1995))、D-甘露糖異構(gòu)酶(Allenza，P.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.24-25171-182(1990))、D-木糖異構(gòu)酶(例如，Bhosale，S.H.等的綜述，Microbiol.Rev.60280-300(1996))、酮糖3-差向異構(gòu)酶(Ishida，Y.，等，J.of Fermentation and Bioengineering 83529-534(1997))。
對(duì)重新引入或過(guò)表達(dá)的基因的特異性選擇將取決于本發(fā)明的具體實(shí)施。例如，如果木糖醇是靶產(chǎn)物并且宿主產(chǎn)生木酮糖，那么需要在發(fā)酵或至少在生產(chǎn)周期中(如果與發(fā)酵步驟分離)在宿主細(xì)胞中表達(dá)木糖醇脫氫酶基因。如果D-木糖是靶產(chǎn)物并且宿主產(chǎn)生木糖醇，那么在發(fā)酵或生產(chǎn)周期間，必須表達(dá)多種已知D-木糖異構(gòu)酶基因中的一種。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主被用于木糖醇的生產(chǎn)，采用的方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有
D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上，培
養(yǎng)重組宿主；
(B)在所述宿主中生產(chǎn)木糖醇，方法是通過(guò)阿拉伯糖醇不是中間物
的代謝途徑將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物轉(zhuǎn)化成所述木糖醇；以
及
(C)回收部分(B)中產(chǎn)生的所述木糖醇。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述途徑利用核酮糖-5-磷酸作為產(chǎn)生木糖醇的中間物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，此途徑利用核酮糖-5-磷酸、木酮糖-5-P和木糖醇-1-P作為產(chǎn)生木糖醇的中間物。木糖醇-1-P也可稱為木糖醇-5-P。
或者，在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，此途徑利用(1)核酮糖-5-磷酸、(2)核酮糖、和(3)木酮糖及木糖中的至少一個(gè)作為產(chǎn)生木糖醇的中間物。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，木糖醇是在本發(fā)明的宿主中經(jīng)過(guò)如實(shí)施例24所例舉的途徑生產(chǎn)的，該途徑中
a)經(jīng)酶如核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶作用，核酮糖-5-P被差向異構(gòu)化
成木酮糖-5-P；
b)經(jīng)酶如木糖醇-5-磷酸脫氫酶(也可稱作木糖醇-1-磷酸脫氫酶或
簡(jiǎn)稱XPDH)或者核糖醇磷酸脫氫酶作用，木酮糖-5-P被還原成D-木糖
醇-5-磷酸(D-木糖醇-1-磷酸)；以及
c)經(jīng)糖磷酸酶作用，D-木糖醇-5-磷酸(D-木糖醇-1-磷酸)去磷酸
化變成木糖醇。
特別優(yōu)選的宿主是可以積累木酮糖-5-P，并具有如下基因的宿主，所述基因表達(dá)的酶能夠?qū)⒛就?5-P還原成木糖醇-5-P，如木糖醇-5-磷酸脫氫酶。
在本領(lǐng)域中所提及的D-木糖醇-5-磷酸應(yīng)理解為與L-木糖醇-1-磷酸是同樣的化合物，反之亦然，因此在本文中它們可以相互交換。另外，本領(lǐng)域中所提及到的能夠產(chǎn)生或利用木糖醇-5-P的酶如木糖醇-5-磷酸脫氫酶，應(yīng)理解為也是指并等同于稱為木糖醇-1-磷酸脫氫酶或簡(jiǎn)稱XPDH的酶，并且這些名稱是可以互換的。
或者，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，木糖醇在宿主中的生產(chǎn)是以實(shí)施例9例舉的路線進(jìn)行的，其中核酮糖-5-磷酸被去磷酸化轉(zhuǎn)化成核酮糖(例如利用核酮糖-5-P磷酸酶)；核酮糖被差向異構(gòu)化成木酮糖(例如利用塔格糖差向異構(gòu)酶)；并且木酮糖或被還原為木糖醇(例如利用木糖醇脫氫酶)，或者，作為替代方案，首先將木酮糖部分異構(gòu)化成木糖，然后將木酮糖和木糖還原成木糖醇。
因此，參與葡萄糖轉(zhuǎn)化成木糖醇的途徑和酶反應(yīng)包括木糖醇磷酸途徑、木糖醇脫氫酶途徑、塔格糖差向異構(gòu)酶途徑和阿拉伯糖醇途徑。
在木糖醇磷酸途徑中，核酮糖-5-P被轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-P。木酮糖-5-P再被轉(zhuǎn)化成木糖醇-5-P，后者被轉(zhuǎn)化成木糖醇。
在木糖醇脫氫酶途徑中，核酮糖-5-P被轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-P。木酮糖-5-P再被轉(zhuǎn)化成木酮糖，后者被轉(zhuǎn)化成木糖醇。
在塔格糖差向異構(gòu)酶途徑中，核酮糖-5-P被轉(zhuǎn)化成核酮糖。核酮糖被轉(zhuǎn)化成木酮糖，后者再被轉(zhuǎn)化成木糖醇。
在阿拉伯糖醇途徑中，阿拉伯糖醇被轉(zhuǎn)化成木酮糖，后者被轉(zhuǎn)化成木糖醇。
已知D-甘露糖異構(gòu)酶能夠催化D-核酮糖和D-來(lái)蘇糖的相互轉(zhuǎn)變(Stevens，F(xiàn).J.等，J.Gen.Microbiol.124219-23 1981))。因此，通過(guò)在產(chǎn)D-木酮糖的宿主中表達(dá)編碼甘露糖異構(gòu)酶的基因，就能夠以葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)物的形式獲得D-來(lái)蘇糖。
還已知L-果糖異構(gòu)酶能將D-核酮糖轉(zhuǎn)化成D-阿拉伯糖(Bartkus，J.M.等，J.Becteriol.165704-709(1986))。在本發(fā)明產(chǎn)D-核酮糖的宿主(例如，枯草芽孢桿菌GX2)中表達(dá)適當(dāng)?shù)幕?例如，大腸桿菌的fucI，GenBank編號(hào)U29581)，將得到能夠?qū)⑵咸烟墙?jīng)D-核酮糖轉(zhuǎn)化成D-阿拉伯糖的宿主。
設(shè)計(jì)本發(fā)明的宿主時(shí)，重要的是還應(yīng)牢記己糖代謝中的早期步驟，包括糖吸收系統(tǒng)、糖酵解途徑的上半部分(即，位于己糖激酶/葡糖激酶和醛縮酶作用之間的某點(diǎn))和PPP途徑的氧化階段。這些區(qū)域的遺傳修飾不是實(shí)施本發(fā)明所必需的。然而，可對(duì)本發(fā)明的宿主進(jìn)行遺傳修飾，使之在這些區(qū)域包括一個(gè)或多個(gè)修飾，以便使流入PPP氧化階段及因而進(jìn)入PPP非氧化階段的碳流最大化，由此可以進(jìn)一步提高所需要的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。
更特別地，在本發(fā)明宿主中，對(duì)編碼能夠調(diào)節(jié)碳流在糖酵解途徑和PPP途徑之間分配的酶的基因進(jìn)行破壞是極為理想的。這些基因能夠編碼存在于糖酵解途徑上半部分(即，在丙糖磷酸異構(gòu)酶步驟之前)的酶活性。這個(gè)基因的破壞以及此基因編碼的酶的缺失能夠阻止碳流通過(guò)糖酵解途徑流出己糖磷酸庫(kù)，這導(dǎo)致六碳糖酵解代謝物的累積，特別是葡萄糖6-磷酸(葡萄糖-6-P)的累積，后者能夠進(jìn)入PPP途徑的氧化階段。
作為丙糖磷酸異構(gòu)酶步驟之前活性破壞或減少的靶標(biāo)的糖酵解酶是那些位于葡萄糖-6-磷酸合成之后的酶，尤其是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(或稱為葡糖磷酸異構(gòu)酶)、果糖磷酸激酶和醛縮酶。優(yōu)選的修飾靶標(biāo)是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因和/或果糖磷酸激酶基因。由于葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的活性減少或缺失的微生物菌株在葡萄糖上的生長(zhǎng)情況一般不好，所以在發(fā)酵時(shí)可以利用果糖作為共底物?；蛘呖梢苑謨蓚€(gè)階段進(jìn)行發(fā)酵，其中在富果糖的培養(yǎng)基上使生產(chǎn)菌株進(jìn)行生長(zhǎng)并且僅在生產(chǎn)階段添加葡萄糖，所需要的PPP糖或其衍生物在生產(chǎn)階段進(jìn)行積累。需要增加進(jìn)入PPP氧化階段的碳流時(shí)，不需要減少葡糖激酶或己糖激酶基因的活性，因?yàn)檫@些酶產(chǎn)生葡萄糖-6-P(PPP氧化階段的第1個(gè)酶葡萄糖-6-P脫氫酶的底物)?；蛘?，細(xì)胞內(nèi)的糖酵解酶的活性可以通過(guò)突變、改變啟動(dòng)子和/或利用化學(xué)抑制劑來(lái)降低，而且可以根據(jù)酶試驗(yàn)或者底物培養(yǎng)篩選試驗(yàn)(substrategrowth screening assay)對(duì)所需要的突變株進(jìn)行篩選。用于鑒定每一種糖酵解酶存在或缺失的體外酶試驗(yàn)是本領(lǐng)域眾所周知的。
使進(jìn)入PPP途徑的碳流增加的替代/補(bǔ)充方法是過(guò)表達(dá)編碼PPP氧化階段的第一個(gè)酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因。具體來(lái)說(shuō)，來(lái)自異型發(fā)酵乳酸菌(如，腸系膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)(GenBank編號(hào)M60615))的這些基因?qū)⑹沁m用的，這是由于它們對(duì)許多葡萄糖-6-磷酸脫氫酶所典型的變構(gòu)抑制的敏感性減少(Sugimoto S.& Shio，I.，Agric.Biol.Chem.51101-108(1987))。過(guò)表達(dá)編碼PPP氧化階段的第二個(gè)酶6-磷酸葡糖酸的基因，也被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。這個(gè)酶的高活性能夠阻止細(xì)胞累積6-磷酸葡糖酸和向培養(yǎng)基中分泌葡糖酸。
為了實(shí)施本發(fā)明，另外一組可以優(yōu)選進(jìn)行失活的基因是編碼控制宿主細(xì)胞吸收糖的酶或蛋白質(zhì)的基因。在細(xì)菌宿主中，在引入替代(基于激酶的)糖吸收系統(tǒng)的同時(shí)通過(guò)突變產(chǎn)生失活的野生型糖吸收系統(tǒng)(稱作PTS系統(tǒng))，可用于改善細(xì)胞的整體代謝和能量平衡。在易于出現(xiàn)所謂“輔因子不平衡”現(xiàn)象的宿主中，失活與PPP氧化階段中的酶競(jìng)爭(zhēng)輔因子(典型的是NADP+)的酶，也是本發(fā)明的范圍。輔因子不平衡在下文進(jìn)一步討論。
在本發(fā)明微生物宿主內(nèi)有利地進(jìn)行表達(dá)或過(guò)表達(dá)的基因組合將根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施來(lái)確定。過(guò)表達(dá)PPP氧化階段的基因，尤其是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶，是有用的，盡管在大多數(shù)實(shí)施過(guò)程中這不是絕對(duì)必須的。在某些可能發(fā)生輔因子不平衡現(xiàn)象的宿主(如，許多酵母)中，表達(dá)異源或同源的轉(zhuǎn)氫酶可能是有利的?；蛘?，也可以通過(guò)給宿主提供編碼如下的一對(duì)脫氫酶的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)氫酶的作用，這對(duì)脫氫酶利用不同的輔因子(一個(gè)用NADPH，另一個(gè)用NAD)并且，優(yōu)選地在細(xì)胞質(zhì)中，催化否則相同的反應(yīng)。
當(dāng)在細(xì)菌宿主中實(shí)施本發(fā)明并且這些宿主天然的基于PTS的糖吸收系統(tǒng)被失活時(shí)，葡糖激酶或己糖激酶的過(guò)表達(dá)是特別有用的。在一些宿主中，可能需要或希望(過(guò))表達(dá)同源或異源糖-磷酸磷酸酶，以便實(shí)現(xiàn)五碳糖磷酸向相應(yīng)的中性(即，去磷酸化的)糖的極大轉(zhuǎn)化。大量其它的基因，包括編碼木糖醇脫氫酶、D-阿拉伯糖醇脫氫酶、核糖醇脫氫酶、L-果糖異構(gòu)酶、D-甘露糖異構(gòu)酶、D-木糖異構(gòu)酶、酮糖3-差向異構(gòu)酶等的基因，都可以用于本發(fā)明的具體實(shí)施中。
除了旨在減少或增強(qiáng)微生物宿主內(nèi)某種已知酶活性的特定遺傳修飾，如上述的修飾之外，經(jīng)未知的酶/機(jī)制起作用的突變也可以用于實(shí)施本發(fā)明。例如，通過(guò)采用如本發(fā)明所顯示的某些突變篩選/選擇方案，可以很大程度地特異改變產(chǎn)戊糖/戊酮糖的重組宿主的發(fā)酵產(chǎn)物譜系。
當(dāng)在能夠經(jīng)PTS系統(tǒng)獲取葡萄糖并對(duì)之進(jìn)行磷酸化的微生物宿主中實(shí)施本發(fā)明時(shí)，優(yōu)選對(duì)葡萄糖吸收系統(tǒng)進(jìn)行修飾。PTS系統(tǒng)發(fā)揮功能需要連續(xù)供應(yīng)磷酸烯醇丙酮酸-一種糖酵解途徑的產(chǎn)物。如果利用以葡糖激酶或己糖激酶為基礎(chǔ)的葡萄糖吸收和磷酸化系統(tǒng)代替PTS系統(tǒng)，那么是ATP而不是磷酸烯醇丙酮酸提供葡萄糖吸收和磷酸化所需的能量。不同于磷酸烯醇丙酮酸，ATP可以經(jīng)過(guò)呼吸鏈利用由PPP氧化階段產(chǎn)生的NADPH進(jìn)行補(bǔ)充。因此，這樣的一個(gè)系統(tǒng)將為本發(fā)明那些通過(guò)PPP途徑將己糖磷酸轉(zhuǎn)化成戊糖磷酸的微生物宿主細(xì)胞提供好得多的能量平衡，并且由此將獲得更高產(chǎn)量的所需五碳糖。利用基于激酶的系統(tǒng)代替基于PTS的葡萄糖吸收和磷酸化系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(Flores，N.等，NatureBiotechnology 14620-623(1996))。
本發(fā)明也涉及被修飾的葡萄糖吸收機(jī)制，它通過(guò)過(guò)表達(dá)枯草芽孢桿菌glcUgdh操縱子，增加流入戊糖磷酸的葡萄糖和葡萄糖衍生的中間物的量。當(dāng)例如在本文描述的制備木糖醇的方法中，希望利用能夠生產(chǎn)出增強(qiáng)水平的一種或多種戊糖磷酸支路中間物的宿主時(shí)，這類宿主特別有用。本發(fā)明也涉及一種宿主，對(duì)它進(jìn)行遺傳修飾后增強(qiáng)了glcUgdh操縱子的表達(dá)。
在轉(zhuǎn)氫酶活性很低或缺失的宿主中和缺少經(jīng)過(guò)呼吸鏈重新氧化NADPH機(jī)器的宿主中，PPP的活性可以造成一種有時(shí)稱之為“輔因子不平衡”的現(xiàn)象。輔因子不平衡引起經(jīng)過(guò)PPP氧化階段的碳流減少，這是因?yàn)楣?yīng)葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶的細(xì)胞內(nèi)NADP+受到了限制。這種情況下，為了實(shí)施本發(fā)明方法，可以對(duì)宿主進(jìn)行附加的遺傳修飾，其中所述附加的遺傳修飾能夠降低其它細(xì)胞代謝部分對(duì)NADP+的需求或允許細(xì)胞，例如通過(guò)NAD+，對(duì)NADPH進(jìn)行再氧化(NADH通過(guò)呼吸鏈的再氧化比NADPH有效得多)。
因此，表達(dá)轉(zhuǎn)氫酶基因有利于提高如上所述的發(fā)明中某些宿主的性能。或者，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)作用于相同底物但是利用兩種不同輔因子(NADH和NADPH)的一對(duì)脫氫酶。這樣的一對(duì)酶可以有效地作為一個(gè)“準(zhǔn)轉(zhuǎn)氫酶”，平衡著NADH-NAD+和NADPH-NADP+庫(kù)的氧化還原態(tài)(Aristidou等，WO 99/46363)。特別適用的脫氫酶對(duì)是NADH和NADPH依賴性谷氨酸脫氫酶。例如，在酵母中NADPH依賴性谷氨酸脫氫酶(由GDH1基因編碼)從野生型的染色體基因獲得足夠高水平的表達(dá)。因此，僅過(guò)表達(dá)一種基因-NADH依賴性谷氨酸脫氫酶基因(例如，酵母GDH2基因(Miller，S.M.，等，-Mol.Cell Biol.116229-47(1991)；Boles，E.，等，Eur.J.Biochem.217(1)469-77(1993))就足以緩解宿主細(xì)胞內(nèi)的輔因子不平衡(Aristidou等，WO 99/46363)。
通過(guò)PPP途徑的碳流也可以通過(guò)使如下細(xì)胞中的酶失活來(lái)增加，這類酶能夠與PPP氧化階段的酶競(jìng)爭(zhēng)NADP+。例如，使NADP依賴性檸檬酸脫氫酶基因IDP失活(Loftus，T.M.，等，Biochemistry 339661-9667(1994))，可以對(duì)通過(guò)PPP途徑的代謝流產(chǎn)生刺激作用。
通過(guò)為宿主細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)墓驳孜锖湍軌蚶肗ADPH還原此共底物的酶，也可以實(shí)現(xiàn)NADPH的再氧化。這種共底物的典型實(shí)例是木糖，它可以被NAD(P)H依賴性木糖還原酶還原為木糖醇。已經(jīng)從大量微生物中克隆出編碼適當(dāng)木糖還原酶的基因(Amore，R.等，Gene 109(1)89-97(1991)；Billard，P.等Gene 162(1)93-97(1995))。
在輔因子不平衡的條件下經(jīng)過(guò)PPP氧化階段的碳流發(fā)生減少這一問(wèn)題的一個(gè)更好解決方法是，在本發(fā)明宿主內(nèi)表達(dá)編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和/或6-磷酸葡糖酸脫氫酶的異源基因，這兩種酶都能夠利用NAD+作為輔因子。能夠編碼具有這些性質(zhì)的葡萄糖6-磷酸脫氫酶的基因的合適實(shí)例是來(lái)自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和腸系膜狀明串珠菌的zwf基因(Ma，J.F.，等，J.Bacteriol.180(7)1741-1749；Lee，W.T.，等，J.Biol.Chem.26613028-13034(1991))。而且，對(duì)于實(shí)施本發(fā)明具有作用的NAD+特異性6-磷酸葡糖酸脫氫酶是已知的(Ohara，H.等，Bioschi.Biotech.Biochein.60(4)692-693(1996))。
在還原型而不是氧化型的輔因子(NADH)變得有限時(shí)，微生物細(xì)胞中可以發(fā)生“相反”類型的輔因子不平衡。在本發(fā)明范圍之內(nèi)，這個(gè)問(wèn)題典型地發(fā)生在當(dāng)靶產(chǎn)物為5-碳糖醇時(shí)，它是通過(guò)酶促還原相應(yīng)的5-碳酮糖形成的。在這種情況下，對(duì)編碼競(jìng)爭(zhēng)NADH的酶的野生型基因進(jìn)行失活是有用的。在酵母中具體適用的實(shí)例是參與甘油生產(chǎn)的成對(duì)NADH依賴性脫氫酶GPD1和GPD2(Ansell R.，等，EMBO J.162179-2187(1997))。在枯草芽孢桿菌中，失活3-羥基丁酮還原酶基因?qū)⑹翘岣哂糜诠?yīng)糖醇生產(chǎn)的NADH的優(yōu)選遺傳修飾。
優(yōu)選的用在一些宿主(例如，酵母)中實(shí)施本發(fā)明的另一種遺傳修飾方法是(過(guò))表達(dá)糖-磷酸磷酸酶基因如釀酒酵母中的DOG1基因(Sanz，P.，等，Yeast 101195-202(1994))。已知這個(gè)基因編碼的磷酸酶也對(duì)5-碳糖磷酸如核糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸具有活性。本發(fā)明人證明這種酶對(duì)木酮糖5-磷酸也具有活性，并且在此公開(kāi)了DOG1的過(guò)表達(dá)引起5-碳糖和相應(yīng)多元醇，尤其是核糖醇的累積增加。已知對(duì)于實(shí)施本發(fā)明有用的另一類型磷酸酶，名稱是“低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶”(Chernoff，J.和Li，H.C.，Arch.Biochem.Biophys.240135-145(1985))。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，這些酶也作用于5-碳糖磷酸。發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的LPT1基因(Ostanin K.，等，J.Biol.Chem.27018491-18499(1995))的過(guò)表達(dá)能夠提高五碳糖和糖醇的產(chǎn)量。適用于實(shí)施本發(fā)明的其它的這類基因從Zygosaccharomyces rouxii種酵母中分離出來(lái)并在本文中進(jìn)行了公開(kāi)。
在某些宿主如枯草芽孢桿菌中，磷酸酶的表達(dá)可能不是必需的，原因是正如本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，這類宿主的細(xì)胞能夠容易地對(duì)大量五碳糖磷酸包括D-核糖5-磷酸、D-核酮糖5-磷酸和D-木酮糖5-磷酸進(jìn)行去磷酸化。
在本發(fā)明實(shí)施中有用的再一類型遺傳修飾是使編碼將五碳糖轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的糖磷酸的激酶的基因失活或減少其活性。這種有用的遺傳修飾的一個(gè)實(shí)例是使編碼木酮糖激酶的基因失活。我們?cè)诒疚闹酗@示，這個(gè)基因的失活能夠增加核酮糖以及相應(yīng)多元醇即木糖醇的產(chǎn)量。類似地，如果核酮糖或核糖醇是靶產(chǎn)物，則失活核酮糖激酶將是有用的。
產(chǎn)物的譜系，如由本發(fā)明的重組菌株產(chǎn)生的五碳糖，在大多數(shù)情況下可以通過(guò)發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)控或進(jìn)一步修飾。最重要的是，培養(yǎng)基中溶解氧的濃度影響酮糖和相應(yīng)糖醇的平衡。例如，當(dāng)本發(fā)明的某些枯草芽孢桿菌菌株在高通氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，它們產(chǎn)生出戊酮糖作為發(fā)酵的主要五碳糖產(chǎn)物。而在微有氧條件下，多元醇是主要的發(fā)酵產(chǎn)物。
除了用于構(gòu)建新的重組微生物宿主的遺傳方法之外，本發(fā)明還提供了通過(guò)調(diào)節(jié)所述宿主的發(fā)酵條件控制產(chǎn)物譜系的方法。例如，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)調(diào)節(jié)微生物培養(yǎng)中的通氧量，由本發(fā)明宿主產(chǎn)生的糖與相應(yīng)糖醇的比率能夠在很大范圍內(nèi)變化。
不論發(fā)酵條件是否針對(duì)所需要產(chǎn)物的生產(chǎn)或產(chǎn)物的選擇進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，在本發(fā)明方法中宿主發(fā)酵所用的碳源都可以是葡萄糖、或另一種能夠通過(guò)與代謝葡萄糖的糖酵解或PPP途徑有至少某些共同步驟(即重疊)的途徑進(jìn)行代謝的六碳糖。這些其它的糖的例子包括果糖和甘露糖。在本發(fā)明范圍內(nèi)還可以考慮使用的碳源是包含這些六碳糖的寡糖和多糖，如蔗糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、菊粉、淀粉等。這些碳源可以單獨(dú)或混合使用，例如轉(zhuǎn)化糖或高果糖的糖漿。戊糖也可以用作底物糖混合物的一部分。在本發(fā)明框架中，戊糖的角色局限于被作為共底物而不是主要底物(例如，作為再生NADP+的“電子庫(kù)(electron sink)”)。
在另一實(shí)施方案中，利用重組XPDH基因序列，構(gòu)建了表達(dá)或過(guò)表達(dá)XPDH基因的宿主。本發(fā)明人在鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)和R.halodurans.中鑒定到此序列。來(lái)自艱難梭菌(C.difficile)的相似序列(SEQID NO51、52和53)也可以應(yīng)用于此方面。這些宿主對(duì)于在如下途徑中產(chǎn)生木糖醇尤其有用，該途徑通過(guò)XPDH將木酮糖-5-P轉(zhuǎn)化成木糖醇-1-P，然后利用磷酸酶將木糖醇1-P轉(zhuǎn)化成木糖醇。如實(shí)施例(實(shí)施例28)所示，這種菌株的培養(yǎng)液包含有木糖醇，然而在對(duì)照菌株的培養(yǎng)基中不能檢測(cè)到木糖醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，首次對(duì)阿拉伯糖醇-磷酸脫氫酶基因進(jìn)行了克隆，并且構(gòu)建了表達(dá)這個(gè)基因的宿主。來(lái)自鳥(niǎo)腸球菌(E.avium)的序列(SEQID NO68)含有一個(gè)由352個(gè)密碼子構(gòu)成的開(kāi)放閱讀框，該閱讀框前面具有一個(gè)典型的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。推導(dǎo)出的氨基酸序列在SEQ ID NO69給出。此酶是可逆的，它可將D-阿拉伯糖醇-5-磷酸轉(zhuǎn)化成D-木酮糖-5-磷酸，反之亦然。因此，可以在通過(guò)將D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成D-阿拉伯糖醇-5-磷酸制備D-阿拉伯糖醇(CAS No.488-82-4)(也稱為D-arabinitol)的方法中，應(yīng)用本發(fā)明的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶。此序列可以用于鑒定其它的可用序列，如SEQ ID NO70，以前有報(bào)道說(shuō)這個(gè)序列是山梨糖醇脫氫酶，而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)它是來(lái)自B.halodurans.的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶。
可以在其中實(shí)施本發(fā)明的宿主范圍包括細(xì)菌和真菌。真菌優(yōu)選酵母。具體來(lái)說(shuō)，具有GRAS狀態(tài)的微生物種如酵母釀酒酵母或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽孢桿菌都適于作為本發(fā)明的宿主。其它適用的宿主有酵母的許多種類，例如屬于如下屬的酵母酵母屬(Saccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomycesi)、假絲酵母屬(Candida)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(例如，Zygosaccharomyces rouxii、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)或馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus))；絲狀真菌如來(lái)自如下屬的那些曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)或木霉屬(Trichoderma)等等(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、婁格法爾特氏青霉(Penicillium roqueforti)、Trichoderma reesei)；或細(xì)菌如埃希氏桿菌屬(Escherichia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬、乳酸細(xì)菌等的各個(gè)種(例如大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)，樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)以及脈胞菌屬(Neurospora)、毛霉屬(Mucor)和Fisarium屬的各個(gè)種)。
優(yōu)選的執(zhí)行本發(fā)明的遺傳修飾技術(shù)是重組DNA技術(shù)(遺傳工程)。此技術(shù)主要應(yīng)用于兩種類型的工作。第一種是對(duì)所選擇宿主的功能性野生型基因進(jìn)行失活。另一種相反類型，其工作是引入和表達(dá)異源基因，此基因編碼的酶在本發(fā)明的宿主中缺失或表達(dá)水平不足。后一類型工作的變化形式是過(guò)表達(dá)宿主的同源基因，此基因在野生型菌株中以亞最佳水平表達(dá)。
對(duì)本發(fā)明宿主的野生型基因的定向失活可以利用任何一種本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。例如，在宿主內(nèi)產(chǎn)生特異針對(duì)靶基因的反義RNA?？梢栽诎谢虮磉_(dá)所需要的“輔助”基因，如轉(zhuǎn)錄激活劑或抗終止子中進(jìn)行突變。以基因的染色體野生型拷貝和相同基因在體外構(gòu)建的無(wú)活性拷貝之間進(jìn)行的同源重組作為基礎(chǔ)的基因失活技術(shù)，稱為“基因破壞”，是實(shí)施本發(fā)明“基因失活任務(wù)”的優(yōu)選方法。這一技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。體外失活靶基因的優(yōu)選方法是構(gòu)建一個(gè)包含此基因的克隆拷貝的質(zhì)粒。接下來(lái)將編碼序列打斷，或者利用編碼遺傳選擇標(biāo)記的DNA如抗生素抗性基因或彌補(bǔ)宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的基因，代替部分編碼序列。然后將質(zhì)粒構(gòu)建體或其部分用于轉(zhuǎn)化所選擇的宿主，使之具有抗生素抗性或成為原營(yíng)型。除了重組DNA技術(shù)，也可以應(yīng)用基于隨機(jī)化學(xué)、放射性誘變或自發(fā)突變、然后對(duì)靶突變體進(jìn)行篩選的傳統(tǒng)遺傳技術(shù)。
本發(fā)明中異源基因的表達(dá)或同源基因的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)許多方法完成。優(yōu)選的方法是在體外構(gòu)建一個(gè)所謂的“表達(dá)盒”，它包含一個(gè)在所選宿主中具有功能的啟動(dòng)子及隨后的待(過(guò))表達(dá)的基因編碼區(qū)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。當(dāng)然，如果待表達(dá)基因的天然啟動(dòng)子在所選宿主中具有活性，則包含編碼序列和側(cè)翼5′和3′區(qū)域的未修飾基因不需任何修飾就可以是這樣一個(gè)“盒”。然后可以將表達(dá)盒引入本發(fā)明的宿主中作為多拷貝質(zhì)粒的一部分，所述質(zhì)粒穩(wěn)定保持在宿主中或整合到染色體中。
許多不同的啟動(dòng)子可應(yīng)用于這種表達(dá)盒中，優(yōu)選地，該啟動(dòng)子在其被應(yīng)用的宿主中具有強(qiáng)至中等的強(qiáng)度。啟動(dòng)子可以是可調(diào)節(jié)的或組成型的。優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)使用不受葡萄糖抑制的、或者在培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)只輕微受到抑制的啟動(dòng)子。只是提及許多可適用啟動(dòng)子中的少數(shù)，就可以提及例如，糖酵解基因啟動(dòng)子如枯草芽孢桿菌tsr基因(編碼果糖二磷酸醛縮酶)的啟動(dòng)子或釀酒酵母GAPDH(編碼甘油醛磷酸脫氫酶)的啟動(dòng)子(BitterG.A.，Meth.Enzymol.152673-684(1987))。其它強(qiáng)啟動(dòng)子有，例如，面包酵母的ADHI啟動(dòng)子(Ruohonen L.，等，J.Biotechnol.39193-203(1995))，磷酸饑餓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如酵母的PHO5啟動(dòng)子(Hinnen，A.等，《酵母遺傳工程》(Yeast Genetic Engineering)，Barr，P.J.等編，Butterworths(1989)，或來(lái)自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的堿性磷酸酶啟動(dòng)子(Lee.J.W.K.等，J.Gen.Microbiol.1371127-1133(1991))。可以構(gòu)建基因組DNA的噬菌體表達(dá)文庫(kù)，從其中可以獲得與例如釀酒酵母的相應(yīng)基因相似的任何所需的糖代謝基因。
本發(fā)明微生物菌株的有用特征不局限于通過(guò)使具有已知功能的基因失活或過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些菌株的某些特征優(yōu)選通過(guò)隨機(jī)化學(xué)誘導(dǎo)或自發(fā)的突變、然后篩選性能改進(jìn)的菌株來(lái)獲得。一種特別有效的篩選方法(由本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)的)以獲得在轉(zhuǎn)酮酶基因中帶有突變的、表現(xiàn)出改良的生長(zhǎng)性質(zhì)的突變株為基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)此種突變株能夠轉(zhuǎn)化葡萄糖得到不同譜系的五碳糖，而親本不能進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)此方法可以實(shí)現(xiàn)D-木酮糖產(chǎn)量的極為明顯的增加。可以通過(guò)檢測(cè)各種糖和PPP中間物的試驗(yàn)、以及檢測(cè)PPP酶活性的試驗(yàn)，對(duì)突變株進(jìn)行表征。PPP酶活性的檢測(cè)可以利用本領(lǐng)域已知的方法，例如Alexander，M.A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.29282-288(1988)所描述的方法。
在本發(fā)明的宿主和方法中產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，可以單獨(dú)獲得(以分離的形式)或以混合物的形式與其它發(fā)酵產(chǎn)物，或其它的糖或糖醇一起(即，作為提取物或以部分純化的形式)獲得。用于純化五碳糖及其糖醇的方法是已知的。例如，D-木糖可以從纖維素加工的側(cè)流中分離得到，并經(jīng)氫化生產(chǎn)出木糖醇。從培養(yǎng)基中純化這些化合物(包括D-核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、D-木酮糖-5-磷酸、D-核酮糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖、D-來(lái)蘇糖、D-木糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并包括各種形式的柱色譜(例如，離子交換，吸附，反相色譜等)和結(jié)晶。沉淀難溶性的鋇鹽和鈣鹽也可以用于純化五碳糖磷酸。
克隆的XPDH基因及其蛋白質(zhì)
對(duì)編碼木糖醇磷酸脫氫酶(XPDH)的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)基因進(jìn)行克隆和翻譯。SEQ ID NO48顯示了在pBK(LRXPDH)質(zhì)粒上提供的該核苷酸序列。此序列包括349氨基酸構(gòu)成的開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO49)，并以較不常用的起始密碼子TTG起始。
鼠李糖乳桿菌XPDH序列的推導(dǎo)氨基酸序列與幾種其它中等鏈長(zhǎng)脫氫酶的序列同源，尤其是例如B.halodurans和艱難梭菌中的那些脫氫酶——但它們的底物或是未知的或被錯(cuò)誤指定。例如，盡管SEQ ID NO50是來(lái)自B.Halodurans的XPDH的氨基酸序列(GenBank PIDg1072799)，卻被作為山梨糖醇脫氫酶列出。SEQ ID NO51-53一直沒(méi)有得到注釋SEQ IDNO51是來(lái)自艱難梭菌的一個(gè)序列，它顯示出與鼠李糖乳桿菌XPDH具有一些同源性。SEQ ID NO52是來(lái)自艱難梭菌的一個(gè)相似序列。SEQ ID NO53是來(lái)自艱難梭菌的另一個(gè)相似序列。
艱難梭菌酶與鼠李糖乳桿菌XPDH具有以下同源性，SEQ ID NO 5152％相同殘基，E值(通過(guò)NCBI WWW互聯(lián)網(wǎng)址提供的BLAST算法計(jì)算)e-109。SEQ ID NO 5237％相同殘基，E值(通過(guò)NCBI WWW互聯(lián)網(wǎng)址提供的BLAST算法計(jì)算)e-68。SEQ ID NO 5337％相同殘基，E值(通過(guò)NCBI WWW互聯(lián)網(wǎng)址提供的BLAST算法計(jì)算)e-65。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明具有XPDH的功能的B.halodurans酶具有較低的同源性數(shù)值
SEQ ID NO 5036％相同殘基，E值(通過(guò)NCBI WWW互聯(lián)網(wǎng)址提供的BLAST算法計(jì)算)e-63
克隆的APDH基因及其蛋白質(zhì)
對(duì)編碼阿拉伯糖醇-磷酸脫氫酶(APDH)的鳥(niǎo)腸球菌基因進(jìn)行克隆和翻譯。編碼此基因的核苷酸序列如SEQ ID NO68所示。此序列包括349個(gè)氨基酸構(gòu)成的開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO69)。
鳥(niǎo)腸球菌APDH序列的推導(dǎo)氨基酸序列與幾種其它中等鏈長(zhǎng)脫氫酶的序列同源，尤其是例如具有被報(bào)道為B.halodurans中的一種山梨糖醇脫氫酶的序列的脫氫酶(SEQ ID NO70)。
多核苷酸
除非有其它說(shuō)明，此處所有的通過(guò)DNA分子的序列分析測(cè)定的核苷酸序列都是按實(shí)施例中描述的方法進(jìn)行測(cè)定的，所有由本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的氨基酸序列都是通過(guò)翻譯上述所測(cè)定的DNA序列來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)的。因此，正如本領(lǐng)域所知的對(duì)利用此方法測(cè)定的任一DNA序列來(lái)說(shuō)，此處測(cè)定的任一核苷酸序列可能都有一些錯(cuò)誤。由自動(dòng)裝置測(cè)定的核苷酸序列典型地達(dá)到至少約35％的同一性，例如至少55％、65％、75％、85％或至少95％的同一性。更典型地，它們與測(cè)序的DNA分子的真實(shí)核苷酸序列有約80％或90％同一性。真實(shí)序列可以通過(guò)其它方法(包括本領(lǐng)域已知的人工DNA序列分析法)得到更精確的測(cè)定。也正如本領(lǐng)域已知的，同真實(shí)序列進(jìn)行比較在測(cè)定的核苷酸序列中插入或缺失一個(gè)核苷酸，將會(huì)引起核苷酸在翻譯中出現(xiàn)移框，以致從發(fā)生插入和缺失的點(diǎn)開(kāi)始，所預(yù)測(cè)的由被測(cè)定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列將與實(shí)際由被測(cè)序的DNA分子編碼的氨基酸序列完全不同。
一個(gè)核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，對(duì)于DNA分子或多核苷酸來(lái)說(shuō)，是指一段脫氧核糖核苷酸序列，而對(duì)于RNA分子或多核苷酸來(lái)說(shuō)，是指相應(yīng)的核糖核苷酸序列(A，G，C和U)，此時(shí)特定脫氧核糖核苷酸序列中的每一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所代替。
“功能性”是指核苷酸序列執(zhí)行的功能與另一個(gè)同源核苷酸序列的功能相當(dāng)，如編碼與所描述的酶具有相同活性(如驅(qū)動(dòng)相同反應(yīng))的酶。
利用本文提供的信息，如在附圖和序列表中列出的核苷酸序列，編碼XPDH或APDH多肽、或者它們的融合蛋白嵌合結(jié)構(gòu)的本發(fā)明核酸分子，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選程序獲得，如那些用于克隆染色體DNA、或以mRNA為起始物質(zhì)克隆cDNA的程序。在實(shí)施例中描述的，作為本發(fā)明舉例說(shuō)明的XPDH或APDH核酸分子，是從來(lái)自鼠李糖乳桿菌的染色體DNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。
正如文中所示，本發(fā)明的核酸分子既可以以RNA形式如mRNA存在，也可以以DNA形式存在，包括例如通過(guò)克隆獲得的或合成產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈的DNA或RNA可以是編碼鏈，也稱有義鏈，或者它可以是非編碼鏈，也稱反義鏈。
“分離的”核酸分子是指從其天然環(huán)境中被轉(zhuǎn)移出來(lái)的一段核酸分子，DNA或RNA。例如，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，包含在載體中的重組DNA分子被認(rèn)為是分離的。分離的DNA分子的其它實(shí)例包括維持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或溶液中的被純化(部分地或基本上地)的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明中分離的核酸分子還包括合成產(chǎn)生的這類分子。
本發(fā)明的分離的核酸分子包括如下DNA分子，該DNA分子包含一個(gè)能夠編碼本發(fā)明XPDH或APDH蛋白、或含有它們的融合蛋白的開(kāi)放閱讀框(ORF)。對(duì)這類融合蛋白可以進(jìn)行工程化，以便例如為XPDH或APDH多肽或其轉(zhuǎn)錄本提供附加的活性或功能，或者提供一種功能以幫助在宿主生產(chǎn)后純化XPDH或APDH蛋白。因此，舉例來(lái)說(shuō)，可將多肽與標(biāo)記序列如肽融合，后者使融合(含有標(biāo)記)多肽的純化變得容易。在本發(fā)明此方面的某些實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是六組氨酸肽，例如載體pQE(Qiagen，Inc.)中提供的標(biāo)簽，尤其是，其中的許多已經(jīng)商業(yè)化。例如，如Gentz 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)描述的，六組氨酸為融合蛋白的純化提供了便利?！癏A”標(biāo)簽是另一個(gè)用于純化的肽，它相應(yīng)于流感血凝素蛋白的表位，其描述見(jiàn)Wilson 等，Cell 37767-778(1984).。
在一個(gè)實(shí)施方案中，XPDH或APDH編碼序列與編碼信號(hào)序列的序列可操作地連接，這樣，當(dāng)進(jìn)行翻譯后，信號(hào)序列將產(chǎn)生的XPDH或APDH引導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)或外的所需要的位點(diǎn)。這種信號(hào)序列可以是細(xì)菌的或真核的，取決于XPDH或APDH是在細(xì)菌還是在真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。
包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO68所示XPDH或APDH蛋白編碼序列或其中所需片斷的DNA分子；以及包含一段與上述序列實(shí)質(zhì)上不同的序列、但是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性仍舊能夠編碼XPDH或APDH蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO49或SEQ ID NO69)的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域熟知的。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生這樣的簡(jiǎn)并性變體是常規(guī)操作。
本發(fā)明不僅提供上文描述的核酸分子，而且提供具有與上述序列互補(bǔ)的序列的核酸分子。這類分離的分子，尤其是DNA分子，可作為探針用于通過(guò)與染色體原位雜交進(jìn)行基因作圖，以及用于通過(guò)例如Northern印跡分析檢測(cè)XPDH或APDH基因在不同物種中的表達(dá)。
本發(fā)明還提供從完整的多核苷酸序列的5′和3′末端缺失了不同殘基、但保留了閱讀框并且仍舊能夠編碼具有XPDH或APDH催化活性的XPDH或APDH的多核苷酸。因此在實(shí)施方案中，這類多核苷酸編碼的本發(fā)明多肽從完整多肽的N-末端或C-末端缺少了不同殘基，但保持了XPDH或APDH的催化活性。
因此本發(fā)明提供分離的核酸分子，包括(1)編碼具有SEQ ID NO49所示氨基酸序列的鼠李糖乳桿菌XPDH多肽的多核苷酸，特別是SEQ ID NO48所示多核苷酸序列；或者編碼具有SEQID NO69所示氨基酸序列的鳥(niǎo)腸球菌APDH多肽的多核苷酸，特別是SEQ IDNO68所示多核苷酸序列；(2)編碼XPDH或APDH序列中的有用肽片斷的多核苷酸，這種有用片斷包括但不限于提供酶活性的片斷，即具有催化活性的XPDH或APDH蛋白；以及(3)編碼如上所述的、但是缺失了N-末端甲硫氨酸的XPDH或APDH多肽的多核苷酸。
本文描述的分離核酸分子的片斷保持了所需的性質(zhì)或者它編碼的多肽保持了所需的性質(zhì)或活性。如上所述的分離核酸分子的片斷所指的片斷，長(zhǎng)至少約15個(gè)核苷酸(nt)，并且更優(yōu)選至少約20nt，再更優(yōu)選至少約30nt，甚至更優(yōu)選至少約40nt，可用作在此討論的探針和引物，或者用于給融合蛋白構(gòu)建體提供所需要的基序或結(jié)構(gòu)域。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明長(zhǎng)度為50-300nt，或甚至600nt的較大片斷也具有用處，正如相應(yīng)于SEQ ID NO48或68所示大部分(即使不是全部的)DNA核苷酸序列的片段或編碼SEQ IDNO49或69的片段也是有用的。舉例來(lái)說(shuō)，與SEQ ID NO48或68所示的片斷進(jìn)行比較，長(zhǎng)至少20nt的片斷是指包括SEQ ID NO48或68所示核苷酸序列中的20個(gè)或更多個(gè)連續(xù)堿基的片段。
具體地，本發(fā)明提供如下多核苷酸，它具有的一段核苷酸序列是SEQID NO48或68所示序列的一部分、或者編碼SEQ ID NO49或69所示的氨基酸序列。本發(fā)明還考慮編碼缺失氨基末端甲硫氨酸的XPDH多肽的多核苷酸。本發(fā)明也提供了由這些多核苷酸編碼的多肽，該多肽包含一個(gè)起始于SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的第2位、但缺失氨基末端甲硫氨酸的氨基酸序列。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，該分子所包含的一段多核苷酸在嚴(yán)緊雜交條件下與如上描述的本發(fā)明核酸分子中的部分或優(yōu)選全部的多核苷酸雜交，特別是與SEQ ID NO48或68或其互補(bǔ)序列雜交。“嚴(yán)緊雜交條件”是指在溶液中42℃孵育過(guò)夜，該溶液中含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20μg/ml變性的經(jīng)剪切的鮭魚(yú)精子DNA，之后在0.1×SSC中約65℃洗滌濾膜。
一段多核苷酸能夠與多核苷酸的一部分雜交是指多核苷酸(DNA或RNA)能夠雜交參照多核苷酸的至少約15個(gè)核苷酸(nt)，更優(yōu)選至少約20nt，再更優(yōu)選至少約30nt，甚至更優(yōu)選約30-70(如50)nt。它們可用作如上所討論的和下文進(jìn)一步詳述的探針和引物。
舉例來(lái)說(shuō)，“長(zhǎng)至少20nt”的多核苷酸部分是指來(lái)自參照多核苷酸(例如，SEQ ID NO48或68所示核苷酸序列)的核苷酸序列中的20或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸，當(dāng)然，只能與poly A序列或者T(或U)殘基組成的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交的多核苷酸不包括在用于雜交本發(fā)明核酸的一部分的本發(fā)明多核苷酸之內(nèi)，因?yàn)檫@樣的多核苷酸缺少特異性，并且能夠與任何包含poly A序列或者其互補(bǔ)序列的核酸分子(例如，幾乎任何雙鏈cDNA克隆)雜交。
正如已經(jīng)說(shuō)明的，編碼XPDH多肽的本發(fā)明核酸分子可以包括，但不限于該多肽的編碼序列本身；該多肽和附加序列的編碼序列，附加序列的例子有編碼前導(dǎo)或分泌序列的那些序列，如前-，或原-或前原-蛋白質(zhì)序列；與附加的非編碼序列連在一起、并具有或不具有前面提到的附加編碼序列的該多肽編碼序列，所述非編碼序列包括但不局限于例如，內(nèi)含子和非編碼的5′和3′序列，如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工(包括例如剪接和聚腺苷腺化信號(hào))、mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定信號(hào)中起作用的被轉(zhuǎn)錄但不被轉(zhuǎn)譯的序列；編碼附加氨基酸如提供附加功能的那些氨基酸的附加編碼序列。
變體和突變多核苷酸
本發(fā)明還涉及本發(fā)明核酸分子的變體，它編碼XPDH的部分、類似物、或衍生物。變體可以在自然界發(fā)生，如天然的等位基因變體?！暗任换蜃凅w”是指在生物染色體上占有一個(gè)特定位點(diǎn)的一個(gè)基因的幾種交替形式中的一種。Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons，New York(1985)。非天然發(fā)生的變體可以利用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。
這類變體包括通過(guò)核苷酸的替代、缺失或添加產(chǎn)生的那些變體。替代、缺失或添加作可以涉及一個(gè)或多個(gè)核苷酸。變體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)、或兩個(gè)區(qū)域同時(shí)發(fā)生變化。在編碼區(qū)發(fā)生改變可以引起保守的或者非保守的氨基酸替代、缺失或添加。其中特別優(yōu)選沉默替代、缺失或添加，這類變化不改變XPDH多肽或其部分多肽的性質(zhì)和活性。從這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，還特別優(yōu)選保守替代。
本發(fā)明其它實(shí)施方案包括分離的核酸分子，該分子包含具有編碼如下多肽的核苷酸序列，尤其是那些在嚴(yán)緊雜交條件下能夠與其雜交的那些核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO49或69所示的完整氨基酸序列相比，至少具有35％同一性，更優(yōu)選至少具有55％、65％、75％、85％和95％同一性。能夠與上述序列雜交的這樣的多核苷酸，在嚴(yán)緊雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。
在實(shí)際情況下，任一具體的核酸分子與例如SEQ ID NO48所示核苷酸序列的同一性是例如35％、55％、75％、85％還是95％，可以常規(guī)地利用已知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit program(Wisconsin序列分析軟件包，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University ResearchPark，575 Science Drive，Madison，WI 53711)進(jìn)行測(cè)定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)的局部同源算法，找到兩個(gè)序列之間的最佳同源區(qū)段。當(dāng)使用Bestfit或者任何其它的序列比對(duì)程序來(lái)測(cè)定一個(gè)具體的序列(舉例來(lái)說(shuō))與本發(fā)明的參照序列是否具有95％的同一性時(shí)，首先設(shè)定參數(shù)，當(dāng)然這種同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算是對(duì)參照核苷酸序列的全長(zhǎng)進(jìn)行的，并且允許同源比較中的短缺區(qū)(gap)不超過(guò)參照序列總核苷酸數(shù)的5％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體多核苷酸包括與SEQ ID NO48或68所示的核酸序列具有至少35％、55％、65％、75％、85％、95％或99％同一性的核酸分子，而不論它們是否編碼具有XPDH或APDH活性的肽。這是由于即使一個(gè)具體核酸分子不編碼具有XPDH或APDH活性的多肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍知道如何利用這個(gè)核酸分子，例如作為雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物。不編碼具有XPDH活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括，尤其是(1)從cDNA文庫(kù)中分離XPDH或APDH基因或者它們的等位基因變體；(2)與分散的中期染色體進(jìn)行原位雜交，獲得XPDH或APDH基因的精確染色體位點(diǎn)；和Northern印跡分析用于探測(cè)在特定組織中mRNA的表達(dá)。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠立即意識(shí)到，大量具有與SEQ ID NO48或68所示核酸序列有同一性的同源序列的核酸分子將能夠分別編碼具有XPDH或APDH酶(即催化)活性的多肽。實(shí)際上，由于核苷酸序列的所有簡(jiǎn)并變體都能夠編碼相同的多肽，即使沒(méi)有進(jìn)行上述的比較實(shí)驗(yàn)，這一點(diǎn)對(duì)技術(shù)人員也是很清楚的。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將意識(shí)到，對(duì)于不是簡(jiǎn)并變體的核酸分子，適當(dāng)數(shù)量的也將編碼具有XPDH或APDH酶(催化)活性的多肽。這是因?yàn)榧夹g(shù)人員十分明了較少可能或不可能顯著影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸替代(例如，將一個(gè)脂肪族的氨基酸用另一個(gè)脂肪族的氨基酸替代)，如下文的進(jìn)一步描述。
載體和宿主細(xì)胞
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明核酸分子的載體，利用本發(fā)明的重組載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，通過(guò)重組技術(shù)對(duì)XPDH或ADPH多肽或其片斷的制備，及它們的用途。
可以將本發(fā)明的多核苷酸連接到含有選擇標(biāo)記的載體中以便在宿主中進(jìn)行繁殖。通常，將質(zhì)粒載體引入沉淀物如磷酸鈣沉淀中、或者引入具有帶電荷脂質(zhì)的復(fù)合體中。如載體是病毒，則可以利用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系在體外對(duì)其進(jìn)行包裝然后轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞。
為表達(dá)編碼蛋白，應(yīng)該將編碼這個(gè)蛋白的DNA插入序列與能夠在所需要的宿主中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子進(jìn)行操作連接。有用的原核啟動(dòng)子的實(shí)例有枯草芽孢桿菌degQ啟動(dòng)子(尤其是其degQ36突變體)、噬菌體λPL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子，這里僅提及了一部分。也可以使用天然啟動(dòng)子。其它適用的啟動(dòng)子對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。表達(dá)構(gòu)建體還將包括用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點(diǎn)、以及在轉(zhuǎn)錄后的區(qū)域中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分將優(yōu)選包括位于起始點(diǎn)的翻譯起始密碼子和適當(dāng)?shù)匚挥诖g的多肽的末端的終止密碼子(UAA，UGA或UAG)。
正如所說(shuō)明的，表達(dá)載體將優(yōu)選包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性和用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及其它細(xì)菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。合適宿主的代表性實(shí)例包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞如枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅屬(Drosophila)S2和灰翅夜蛾屬(Spodoptera)Sf9細(xì)胞。優(yōu)選的宿主包括微生物細(xì)胞，尤其是細(xì)菌和酵母細(xì)胞。如果需要，哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可用來(lái)作為克隆基因的宿主。用于上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。
優(yōu)選用于細(xì)菌的載體包括pQE70、pQE60和pQE-9，可從Qiagen獲得；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可從Stratagene獲得；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可從Pharmacia獲得。其它適用載體是技術(shù)人員容易明了的。
可以通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，如Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)中都有描述。多肽及片斷
本發(fā)明還提供具有SEQ ID NO49所示氨基酸序列編碼的氨基酸序列的分離或純化的XPDH多肽，或含有上述多肽的一部分的肽或多肽，特別是如上所描述的由上述核酸分子編碼的那些。
本發(fā)明還提供了XPDH蛋白(特別是由上述的多肽核苷酸編碼的)的融合蛋白，例如，其中XPDH氨基酸序列與信號(hào)序列或一條多肽融合，以提高XPDH蛋白在宿主細(xì)胞中、在進(jìn)行純化過(guò)程中或在隨后的處理和貯藏時(shí)的穩(wěn)定性和持久性。而且，例如可以將肽部分加到多肽上以利于純化，如上文所述?？梢栽诙嚯牡淖詈笾苽洳襟E之前將這些區(qū)域去除。尤其是，將肽部分加到多肽上以造成分泌或排泄、提高穩(wěn)定性和利于純化，這些都是本領(lǐng)域的熟知和常規(guī)技術(shù)。
如上所述的XPDH蛋白可以通過(guò)熟知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行回收和純化，這些方法包括硫酸氨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選應(yīng)用高效液相色譜(″HPLC″)進(jìn)行純化。
本發(fā)明的XPDH或APDH多肽包括天然的純化產(chǎn)物、化學(xué)合成方法所得的產(chǎn)物、以及利用重組技術(shù)從原核或真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，其中的宿主包括，舉例來(lái)說(shuō)，微生物細(xì)胞如細(xì)菌和酵母(特別是枯草芽孢桿菌和酵母屬)，以及高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另外，在某些情況下作為宿主介導(dǎo)的方法的結(jié)果，本發(fā)明的多肽也可以包括最初未經(jīng)修飾的甲硫氨酸殘基。
XPDH或APDH多核苷酸和多肽根據(jù)本發(fā)明可以具有許多用途，尤其是利用XPDH或APDH的化學(xué)和生物性質(zhì)的用途。
變體和突變多肽
為了改善或改變XPDH或APDH多肽的特征，可以應(yīng)用蛋白質(zhì)工程。為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)可以用于制備包括了單個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，缺失，添加的新突變蛋白或″突變蛋白(muteins)″、或融合蛋白。這些被修飾的多肽能夠顯示出，例如增強(qiáng)的活性或增加的穩(wěn)定性。另外，它們可以純化得到較高的產(chǎn)量，而且顯示出至少在某些純化和貯藏條件下比相應(yīng)的天然多肽具有較好的溶解性。
N-末端和C-末端缺失的突變體
舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)許多蛋白質(zhì)包括膜結(jié)合蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或者分泌蛋白的成熟形式，本領(lǐng)域已知可以從N-末端或C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸而不會(huì)造成蛋白質(zhì)的生物功能的實(shí)質(zhì)性喪失。
然而，即使從蛋白質(zhì)的N-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致此蛋白質(zhì)的一種或多種生物功能受到修飾或者喪失，其它生物活性也仍可以保持。因此，將完整蛋白或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的少于大多數(shù)的殘基從N末端去除時(shí)，通常被截短蛋白質(zhì)仍舊可以保持誘導(dǎo)和/或結(jié)合抗體的能力，其中所述抗體能夠識(shí)別全部或部分的XPDH或APDH蛋白。缺少全蛋白N-末端殘基的具體多肽是否保持了這種免疫活性，可以很容易地利用此處描述的和否則為本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定。
因此，本發(fā)明還提供從SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的氨基末端缺失一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。
然而，即使從蛋白質(zhì)的C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸能夠?qū)е麓说鞍踪|(zhì)的一種或多種生物功能受到修飾或者喪失，其它生物活性也仍可以保持。因此，將完整蛋白或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的少于大多數(shù)的殘基從C-末端去除時(shí)，通常被截短蛋白質(zhì)仍舊可以被保持誘導(dǎo)和/或結(jié)合抗體的能力，其中所述抗體能夠識(shí)別完整或成熟形式的蛋白。缺少全蛋白C-末端殘基的具體多肽是否保持了這種免疫活性，可以很容易地利用此處描述的和否則為本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明也提供從氨基和羧基末端同時(shí)缺失一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。
其它突變體
除了上述討論的蛋白質(zhì)的末端缺失形式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將明了，XPDH或APDH多肽的一些氨基酸序列可以被改變而不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。技術(shù)人士將明了蛋白質(zhì)上有決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。因此，本發(fā)明還包括XPDH或APDH多肽的各種變體，它們顯示了XPDH或APDH多肽的基本活性，或者它們包含了XPDH或APDH多肽中諸如那些保持XPDH或APDH酶活性的區(qū)域。這樣的突變體包括缺失、插入、倒位、重復(fù)、以及類型替代。對(duì)于哪一種氨基酸變化可能是表型沉默的，其有關(guān)指導(dǎo)參見(jiàn)Bowie，J.U.等，″解譯蛋白質(zhì)序列中的信息對(duì)氨基酸替代的耐受性″Science 2471306-1310(1990).
因此，SEQ ID NO49或69所示多肽的片斷、衍生物、或類似物可以(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基，更優(yōu)選至少一個(gè)但小于10個(gè)保守氨基酸殘基)替代，并且這些替代氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的殘基；或者(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基團(tuán)；或者(iii)其中成熟或可溶性的細(xì)胞外多肽與另一個(gè)化合物融合，如一個(gè)能夠提高該多肽的半壽期的化合物(例如，聚乙二醇)；或(iv)其中將附加氨基酸融合到前導(dǎo)或分泌序列上或用于純化成熟多肽的序列上或原蛋白序列上。從本文的教導(dǎo)，這些片斷、衍生物和類似物被認(rèn)為屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍。
因此，本發(fā)明的XPDH或APDH可以包含即可以來(lái)自天然突變也可以由人為操作引起的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代，缺失或添加。正如所說(shuō)明的，優(yōu)選地變化具有次要性質(zhì)，如不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊或活性的保守氨基酸替代，見(jiàn)下示。
本發(fā)明XPDH或APDH蛋白中的功能所必需的氨基酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))。后一種方法在分子中的每一個(gè)殘基位置引入單丙氨酸突變。然后檢測(cè)所得突變分子的生物活性如受體結(jié)合或體外繁殖的活性。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式進(jìn)行提供?！胺蛛x的多肽”是指從天然環(huán)境中被轉(zhuǎn)移出來(lái)的多肽。根據(jù)本發(fā)明，由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽和/或含在重組宿主細(xì)胞內(nèi)的多肽被認(rèn)為是分離的?！胺蛛x的多肽”也可以指已經(jīng)從重組細(xì)胞中被部分地或基本上地純化出來(lái)的多肽。例如，重組產(chǎn)生的XPDH多肽可以利用純化鼠李糖乳桿菌天然XPDH蛋白的方法進(jìn)行基本上的純化，該方法描述在Hausman和London，J.Bacteriol169(4)1651-1655(1987))。優(yōu)選將本發(fā)明的多肽純化到足以進(jìn)行序列分析的程度，或者純化到一定程度以便它代表了制劑中99％的蛋白質(zhì)性物質(zhì)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了XPDH基因、APDH基因、并發(fā)現(xiàn)可以將它們重組應(yīng)用于微生物宿主中生產(chǎn)木糖醇和/或阿拉伯糖醇。尤其是，XPDH酶可以用于被XPDH將木糖醇-5-P轉(zhuǎn)化成木糖醇-1-P、然后利用例如磷酸酶將木糖醇-1-P轉(zhuǎn)化成木糖醇的途徑。木糖醇優(yōu)選從細(xì)胞中分泌出來(lái)，并以純化和分離的形式進(jìn)行回收。在其它實(shí)施方案中，XPDH類似物，如SEQ ID NOs50，51、52和53也可以作為XPDH的替代物用于本發(fā)明的方法，尤其是用于木糖醇的重組生產(chǎn)。而且，特別的是，APDH活性在用于生產(chǎn)阿拉伯糖醇的方法中是有用的，并且APDH類似物如SEQ ID NO70可以代替APDH應(yīng)用于其中。
本發(fā)明包括與含有SEQ ID NO49或69所示序列的多肽有至少35％同一性、更優(yōu)選至少55％或75％同一性、再更優(yōu)選具有至少85％、95％或99％同一性的多肽，本發(fā)明還包括具有至少30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸的該多肽的一部分。
在實(shí)際情況下，任一具體的核酸分子與例如SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的同一性是例如至少35％、55％、65％、75％、85％、95％還是99％，可以常規(guī)地利用已知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)使用Bestfit或者任何其它的序列比對(duì)程序來(lái)測(cè)定一個(gè)具體的序列，舉例來(lái)說(shuō)，與本發(fā)明的參照序列是否具有95％的同一性時(shí)，當(dāng)然對(duì)參數(shù)進(jìn)行，以便這種同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算是對(duì)參照氨基酸序列的全長(zhǎng)進(jìn)行的，并且允許同源比較中的斷缺區(qū)不超過(guò)參照序列總殘基數(shù)目的5％。
具有XPDH或APDH活性的本發(fā)明多肽可以在體內(nèi)或體外用于提供這種活性，例如，在對(duì)它們進(jìn)行測(cè)試的試驗(yàn)中、或?qū)Υx物如該酶的底物或產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試的試驗(yàn)中、或與更多的多酶系統(tǒng)偶聯(lián)使用。
因此我們?cè)谌缦聦?shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。下面的實(shí)施例只是用于說(shuō)明的目的并不應(yīng)認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
此處提供的實(shí)施例對(duì)上述討論進(jìn)行補(bǔ)充，部分概述如下
實(shí)施例1，2和3示例了細(xì)菌宿主，宿主中的核糖-5-P異構(gòu)酶活性被減少或消除。
實(shí)施例2和3示例了細(xì)菌宿主，宿主中的轉(zhuǎn)酮酶活性被減少或消除。
實(shí)施例5示例了細(xì)菌宿主，宿主中的核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶活性被增強(qiáng)或修飾。
實(shí)施例6示例了細(xì)菌宿主，宿主中的木酮糖-5-P向木酮糖的轉(zhuǎn)化被增強(qiáng)或修飾。
實(shí)施例7示例了細(xì)菌宿主，宿主中的木糖醇脫氫酶活性被增強(qiáng)或修飾。
實(shí)施例9示例了細(xì)菌宿主，宿主中的塔格糖差向異構(gòu)酶活性被增強(qiáng)或修飾，用于核酮糖向木酮糖的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例10示例了細(xì)菌宿主，其中利用基于ATP依賴性激酶的己糖吸收和磷酸化系統(tǒng)對(duì)葡萄糖PTS(PEP依賴運(yùn)輸)系統(tǒng)活性進(jìn)行修飾，替代或補(bǔ)充。
實(shí)施例11示例了細(xì)菌宿主，其中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和/或6-磷酸葡糖酸脫氫酶的活性被增強(qiáng)或修飾。
實(shí)施例12示例了酵母宿主，其中轉(zhuǎn)酮酶和木酮糖激酶活性被消除，并且引入木糖醇脫氫酶活性。
實(shí)施例13示例了酵母宿主，其中5-碳糖磷酸的累積被增強(qiáng)。
實(shí)施例14，15，17，20和22示例了酵母宿主，其中多元醇和/或戊糖的累積被增強(qiáng)。
實(shí)施例15示例了酵母宿主，其中通過(guò)具有不同底物特異性的木糖醇脫氫酶使產(chǎn)生的木糖醇和核糖醇的比率發(fā)生改變。
實(shí)施例16和17示例了酵母宿主，其中引入了作用于5-碳糖磷酸的去磷酸化酶，并且多元醇和戊糖的累積被增強(qiáng)，多元醇和戊糖的比率發(fā)生改變，以及葡萄糖進(jìn)入PPP的碳流被增強(qiáng)。
實(shí)施例18示例了酵母宿主，其中葡萄糖磷酸異構(gòu)酶活性被減少或消除。
實(shí)施例19示例了酵母宿主，其中轉(zhuǎn)酮酶和葡萄糖磷酸異構(gòu)酶活性被消除。
實(shí)施例20示例了酵母宿主，其中6-磷酸果糖-2-激酶活性被消除。
實(shí)施例21示例了酵母宿主，其中電子庫(kù)被增強(qiáng)或修飾用于再生NADP+。
實(shí)施例21和22示例了酵母宿主，其中細(xì)胞輔因子平衡被修飾用于再生NADPH+。
實(shí)施例23示例了酵母宿主，其中利用傳統(tǒng)誘變獲得增強(qiáng)的多元醇和戊糖的生產(chǎn)。
實(shí)施例25描述了對(duì)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhammosus)的木糖醇磷酸脫氫酶(XPDH)的克隆。
實(shí)施例26描述了表達(dá)載體pGTK74(LRXPDH)和pGTK74(BHDH)的構(gòu)建。
實(shí)施例27描述了對(duì)鼠李糖乳桿菌和R.Halodurans的木糖醇磷酸脫氫酶基因(XPDH)的表達(dá)。
實(shí)施例28例證了利用表達(dá)XPDH的重組枯草芽孢桿菌菌株生產(chǎn)木糖醇的方法。
實(shí)施例29例證了枯草芽孢桿菌glcUgdh操縱子的過(guò)表達(dá)。
實(shí)施例30描述了鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium)的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的純化和部分序列分析。
實(shí)施例31描述了枯草芽孢桿菌中來(lái)自鳥(niǎo)腸球菌和B.halodurans的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的表達(dá)。
實(shí)施例32描述了利用枯草芽孢桿菌重組菌株生產(chǎn)阿拉伯糖醇。
實(shí)施例1
編碼D-核糖-磷酸異構(gòu)酶的枯草芽孢桿菌rpi基因的克隆
在此工作開(kāi)始時(shí)，還沒(méi)有獲得枯草芽孢桿菌完整的基因組序列。而且，還不知道枯草芽孢桿菌中是否包含一個(gè)或多個(gè)D-核糖-磷酸異構(gòu)酶基因(已知大腸桿菌中含有兩個(gè))。因此，克隆rpi基因的對(duì)策是基于大腸桿菌中D-核糖營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的功能互補(bǔ)，而不是PCR。目前，優(yōu)選的克隆rpi基因的方法是根據(jù)PCR進(jìn)行的技術(shù)而不是如下面示例了方法。然而，本實(shí)施例描述的方法足以實(shí)施本發(fā)明。
從枯草芽孢桿菌(ATCC 6051)的DNA構(gòu)建一個(gè)基因文庫(kù)。利用限制性內(nèi)切酶Sau 3A對(duì)此菌株進(jìn)行部分酶切并利用制備型瓊脂糖凝膠電泳分離出大小超過(guò)3kb的片斷。除非其它說(shuō)明，本發(fā)明的研究使用的是已知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程方法(Maniatis，T.，等，(1982，Molecular cloning，ColdSpring Harbor Laboratory)。通過(guò)ZAP表達(dá)預(yù)消化載體/Gigapack克隆試劑盒(Stratagene，USA)，利用此片斷構(gòu)建枯草芽孢桿菌基因文庫(kù)。除了以大腸桿菌AS11菌株(rpiA-從遺傳貯藏中心http//cgsc.biology.yale.edu獲得的D-核糖營(yíng)養(yǎng)缺陷型)取代廠商建議的菌株之外，根據(jù)廠商的說(shuō)明將文庫(kù)轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒形式。將質(zhì)粒形式文庫(kù)的等分試樣轉(zhuǎn)移到含有標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌礦物培養(yǎng)基(M9)。從生長(zhǎng)于該培養(yǎng)基上的菌落分離出質(zhì)粒并進(jìn)行限制性分析。通過(guò)限制性分析，大部分質(zhì)粒顯現(xiàn)出重疊。對(duì)最高豐度的群體的一個(gè)克隆進(jìn)行詳細(xì)限制性分析，表明它是從枯草芽孢桿菌染色體的已測(cè)序部分衍生出來(lái)的。這一區(qū)域包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框，它與大腸桿菌的rpiB編碼區(qū)具有較強(qiáng)同源性。
實(shí)施例2
構(gòu)建包含rpi-和tkt-突變的枯草芽孢桿菌菌株
從獲自芽孢桿菌遺傳貯藏中心(BGSC，Ohio，USA)的質(zhì)粒pMK4中分離出氯霉素抗性基因。以DraI和EcoRI對(duì)pMK4進(jìn)行消化，利用制備型瓊脂糖凝膠電泳從消化物中分離出1.9kb的片斷，并利用Sau3A對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步消化。從此消化物中分離出純化的0.83kb片斷，在所有四種脫氧核苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶I的Klenow片斷對(duì)純化的0.83kb的片斷處理。然后將此片斷與質(zhì)粒p131(實(shí)施例1)進(jìn)行連接，后者是利用SfuI消化并同樣利用Klenow片斷處理。在利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，將包含有被氯霉素抗性基因中斷的枯草芽孢桿菌rpi基因的質(zhì)粒p131-Cm2分離出來(lái)(附圖2)。
用EcoRI和PstI消化p131-Cm2，并利用枯草芽孢桿菌的天然感受態(tài)，用所得的消化物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的菌株BD170(trpC2，thr-5，來(lái)源于BGSC)，使之具有氯霉素抗性。轉(zhuǎn)化流程是按照所謂的“Paris方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus，Harwood和Cutting，編，John Wiley and sons，Chichester，NY(1990)，pp.148-149)進(jìn)行的。以單個(gè)克隆的染色體DNA制備物(Molecular Biological Methods for Bacillus，Harwood和Cutting，編，John Wiley and sons，Chichester，NY(1990)，p65)為模板和以寡核苷酸對(duì)oCA5(SEQ ID NO1)和oBS-RPI3(SEQ ID NO2)為引物，通過(guò)運(yùn)行PCR反應(yīng)篩選出轉(zhuǎn)化體。應(yīng)用于此處以及隨后實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(除了特別說(shuō)明的)是在93℃反應(yīng)3分鐘，接下來(lái)的反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)60℃反應(yīng)45秒，72℃反應(yīng)3分鐘以及93℃反應(yīng)30秒。對(duì)此試驗(yàn)(產(chǎn)生一個(gè)大約1.35kb的PCR產(chǎn)物)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行進(jìn)一步克隆，而且對(duì)所得的亞克隆的染色體DNA通過(guò)利用不同寡核苷酸對(duì)(oBS-RPI5(SEQ ID NO3)和oBS-RPI3(SEQ ID NO2))為引物的PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。選擇能夠產(chǎn)生預(yù)期大小(大約2.1kb，而在野生型枯草芽孢桿菌中為1.25kb)的DNA片斷的一個(gè)克隆并檢驗(yàn)其D-核糖的營(yíng)養(yǎng)缺陷性。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)此克隆是D-核糖營(yíng)養(yǎng)缺陷的，這一點(diǎn)有力地說(shuō)明枯草芽孢桿菌僅存在一個(gè)D-核糖磷酸異構(gòu)酶基因。此克隆被命名為GX1。
根據(jù)已知的枯草芽孢桿菌染色體DNA的序列，對(duì)編碼轉(zhuǎn)酮酶的枯草芽孢桿菌的tkt基因通過(guò)PCR進(jìn)行克隆。寡核苷酸oBS-TKT5(SEQ ID NO18)作為有義引物，oBS-TKT3(SEQ ID NO19)作為反義引物。將PCR片斷克隆到標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室載體pUC19得到質(zhì)粒pUC(TKT)。隨后將存在于質(zhì)粒pDG647中1.6kb BamHI片斷(來(lái)自BGSC)上的紅霉素抗性基因插入pUC(TKT)的MluI位點(diǎn)。質(zhì)粒pUC(TKT)和pTKTE1的構(gòu)建說(shuō)明見(jiàn)附圖10。
以SalI和SmaI對(duì)質(zhì)粒pTKTE1進(jìn)行消化，利用所得的消化物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌株BD170和GX1獲得紅霉素抗性。利用oBS-TKT5和oBS-TKT3為引物進(jìn)行PCR對(duì)一套隨機(jī)的轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)行分析，并篩選出能夠產(chǎn)生大約4kb DNA片斷的克隆。利用此程序，從BD170衍生的枯草芽孢桿菌菌株被命名為GX4，GX1的相似衍生菌株被命名為GX5。
實(shí)施例3
D-核酮糖生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌的構(gòu)建
通過(guò)實(shí)施例2中的方法(除了以十二烷基硫酸鈉替代原方案中的十二烷基肌氨酸鈉)從菌株GX1中分離出染色體DNA。采用基于天然感受態(tài)的方法(實(shí)施例2)，用此DNA對(duì)生產(chǎn)D-核糖的枯草芽孢桿菌菌株31094(U.S.專利No.3,970,522)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過(guò)實(shí)施例2描述的PCR方法，以及研究這些菌株的葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)物，篩選轉(zhuǎn)化株。篩選出的一個(gè)克隆能夠在利用寡核苷酸對(duì)oBS-RPI5和oBS-RPI3進(jìn)行的PCR中產(chǎn)生預(yù)期大小的片斷，并保持了親本菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化成五碳糖的能力。rpi被破壞的ATCC 31094衍生菌株被命名為GX2。
實(shí)施例4
利用枯草芽孢桿菌重組菌株生產(chǎn)核酮糖
將枯草芽孢桿菌菌株ATCC 31094，GX2，GX4和GX5在LB培養(yǎng)基(細(xì)菌用蛋白藥(Difco)1％，酵母提取物(Difco)-0.5％，NaCl 1％)上預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜，然后接種到額外添加10％葡萄糖的相同培養(yǎng)基中至最初的OD600為1。將含有約10ml的培養(yǎng)物的20ml試管以水平成約30°角放置在旋轉(zhuǎn)搖床上，在37℃，200rpm培養(yǎng)3天。利用HPLC分析發(fā)酵液中的碳水化合物。HPLC分析是在配備有折射率探測(cè)器的Hitachi 665A-12液相色譜上進(jìn)行的。使用了Bio-Rad HPX87P 7.8×200mm柱。在70℃以水平衡柱子并以0.9ml/min流速的水洗脫。HPLC的標(biāo)準(zhǔn)溶液是利用獲自Sigma化學(xué)公司的試劑制備的。既可以直接從干燥的晶體糖，也可以將糖漿在NaOH片上進(jìn)行真空干燥直到恒重，然后利用獲得的糖制備這些溶液(木酮糖和D-核酮糖)。
從表1的數(shù)據(jù)可以看出，rpi-突變顯著改變了枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的五碳糖的譜系。不再產(chǎn)生D-核糖而且D-核酮糖成為主要發(fā)酵產(chǎn)物。D-木酮糖的產(chǎn)生變得明顯，雖然其產(chǎn)量比D-核酮糖的產(chǎn)量低很多，而在親本菌株中難以探測(cè)到D-木酮糖。通過(guò)基因破壞獲得的tkt突變體GX4和GX5，產(chǎn)生了與具有化學(xué)誘導(dǎo)的tkt突變的菌株ATCC 31094和GX2性質(zhì)上相似的五碳糖譜系。然而，GX4和GX5比ATCC 31094及其衍生菌的生長(zhǎng)稍慢。最可能的解釋是菌株ATCC 31094中“代償性”突變的累積。因此，將這些菌株在葡萄糖豐富的培養(yǎng)基上培養(yǎng)幾個(gè)周期，然后進(jìn)行亞克隆(在相同培養(yǎng)基上)并篩選較大、生長(zhǎng)較快的克隆，就能夠改進(jìn)GX4和GX5的發(fā)酵性能。表1利用具有tkt和rpi基因突變的枯草芽孢桿菌菌株從葡萄糖生產(chǎn)五碳糖(mg/ml).(*)n.d.-低于可信的檢測(cè)極限(對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基此極限是大約0.15-0.25mg/ml)(**)發(fā)酵時(shí)間-5天
實(shí)施例5
過(guò)表達(dá)D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶的枯草芽孢桿菌菌株的構(gòu)建
利用下列成分構(gòu)建用于在枯草芽孢桿菌中過(guò)表達(dá)D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶的載體-pBS(AR2T) ·質(zhì)粒pGDV1中的革蘭氏陽(yáng)性復(fù)制子和氯霉素抗性標(biāo)記(《芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法》(Molecular Biology Methods for Bacillus)，
Harwood和Cutting編，John Wiley and Sons，Chichester，NY，82-83
頁(yè))(從BGSC獲得)； ·質(zhì)粒pMOB中的大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性標(biāo)記(Strathmann，
M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881247-1250(1991))； ·質(zhì)粒pDG783中的卡那霉素抗性基因(Guérot-Fleury等，Gene
167335-336(1995))； ·枯草芽孢桿菌醛縮酶基因(tsr，又稱fba)啟動(dòng)子，通過(guò)利用寡核
苷酸oALDOP5(SEQ ID NO4)和oALDOP3(SEQ ID NO5)的PCR
克隆得到； ·大腸桿菌中的D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶基因的編碼序列，通過(guò)
利用寡核苷酸oRPE5(SEQ ID NO6)和oRPE32(SEQ ID NO7)的
PCR克隆得到； ·枯草芽孢桿菌的糖酵解操縱子的轉(zhuǎn)錄終止子，也是通過(guò)PCR利用寡
核苷酸oENOT5(SEQ ID NO8)和oENOT3(SEQ ID NO9)克隆得
到的；質(zhì)粒pBS(AR2T)-Kan的構(gòu)建由附圖.3，4和5進(jìn)行說(shuō)明。
利用實(shí)施例2和3中描述的方法，以pBS(AR2T)-Kan轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌株GX2。使兩株隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化體的約50ml培養(yǎng)物在250mlErylenmeyer燒瓶中生長(zhǎng)過(guò)夜(旋轉(zhuǎn)搖床，37℃，200rpm。LB培養(yǎng)基，含有25mg/l卡那霉素)。枯草芽孢桿菌菌株GX2作為對(duì)照菌株。除了省去卡那霉素之外，在同樣的條件下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。制備出細(xì)胞提取物并利用已知的方法對(duì)D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶的活性進(jìn)行測(cè)定(Sasajima，K.和Yoneda，M.，Agr.Biol.Chem.381297-1303(1974))。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體表達(dá)的D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶水平比野生型對(duì)照的表達(dá)水平(0.3-0.4U/mg蛋白)高約30-50倍(10-20U/mg蛋白)。葡萄糖對(duì)醛縮酶啟動(dòng)子活性的影響在后面的獨(dú)立試驗(yàn)(實(shí)施例8)中進(jìn)行了研究。當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)啟動(dòng)子(在多拷貝質(zhì)粒pGT24(MXD2)上控制木糖醇脫氫酶基因的表達(dá))受到適度地抑制(大約3-10倍)。
利用枯草芽孢桿菌菌株過(guò)表達(dá)D-核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶生產(chǎn)五碳糖
在實(shí)施例4描述的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了pBS(AR2T)-Kan的GX2。親本菌株GX2作為對(duì)照。培養(yǎng)3-7天之后，通過(guò)計(jì)算培養(yǎng)液中D-木酮糖和D-核酮糖的比率，檢測(cè)D-核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶的表達(dá)效果。實(shí)際上，此比率增加，雖然只是適度增加(典型地約2倍，從大約5-7％增加到10-12％，表2)。
實(shí)施例6
篩選產(chǎn)生增加量的D-木酮糖的枯草芽孢桿菌突變株
將0.1-1ml(每個(gè)90mm培養(yǎng)皿)過(guò)夜培養(yǎng)(生長(zhǎng)于含有25mg/I卡那霉素的LB培養(yǎng)基)的轉(zhuǎn)化了pBS(AR2T)-Kan的GX2置于選擇性平板(添加10％ D-木糖和25mg/l卡那霉素的LB)上。平板在37℃下培養(yǎng)約一天。利用亞克隆對(duì)出現(xiàn)于平板上的獨(dú)立菌落(典型地有幾十到幾百個(gè))進(jìn)行純化，然后在LB-葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再利用HPLC對(duì)產(chǎn)生的五碳糖譜系進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)利用上述程序篩選出來(lái)的一些突變體比親本菌株產(chǎn)生了明顯高水平的D-木酮糖。除了將抗生素從含有木糖的選擇性培養(yǎng)基中去除之外，利用同樣的篩選/選擇程序處理GX2，也得到非常相似的結(jié)果。這些試驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表2中。菌株GX2的一種過(guò)量產(chǎn)生D-木酮糖的突變株被命名為枯草芽孢桿菌GX7，并應(yīng)用于隨后的研究。表2.利用轉(zhuǎn)化了pBS(AR2T)-Kan的枯草芽孢桿菌菌株GX2和GX2的D-木糖抗性突變株從葡萄糖生產(chǎn)D-核酮糖和D-木酮糖。(*)近似值.在此低范圍內(nèi)D-木酮糖濃度的測(cè)量只是半定量的。
實(shí)施例7
構(gòu)建過(guò)表達(dá)木糖醇脫氫酶的枯草芽孢桿菌菌株
質(zhì)粒pGTK24(MXD2)的構(gòu)建包括兩步。首先，構(gòu)建通用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌(E.coli-B.subtilis)表達(dá)載體pGTK24，它具有枯草芽孢桿菌醛縮酶基因的啟動(dòng)子和烯醇化酶基因的轉(zhuǎn)錄終止子。質(zhì)粒pGTK24的構(gòu)建涉及以下遺傳工程操作
·大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)通過(guò)以pUC19為模板和利用兩種寡核苷酸oOR15
(SEQ ID NO10)和oORI32(SEQ ID NO11)為引物的PCR進(jìn)行擴(kuò)
增；PCR片斷利用EcoRI和BclI進(jìn)行消化，并且與使用同種酶消化的
pGDV1進(jìn)行連接。所得的質(zhì)粒被命名為pGT21。
·利用SalI和EcoRI消化pGT21并與一對(duì)合成的寡核苷酸oPLI5(SEQ ID
NO12)和oPLI3(SEQ ID NO13)進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pGT22。
·利用以枯草芽孢桿菌的染色體DNA為模板和兩種寡核苷酸oENOT5
(SEQ ID NO8)和oENOT3(SEQ ID NO9)進(jìn)行的PCR分離出枯草芽
孢桿菌糖酵解操縱子(烯醇化酶基因)轉(zhuǎn)錄終止子。PCR產(chǎn)物利用BamHI
和HindIII消化并克隆到由同種限制性內(nèi)切酶消化的pGT22的多聚
接頭區(qū)。所得的質(zhì)粒命名為pGT23。
·利用混合的SalI和EcoRI消化質(zhì)粒pGT23，并與含有醛縮酶啟動(dòng)子
并利用同種酶消化的PCR片斷(PCR模板枯草芽孢桿菌染色體DNA，
PCR引物oALDOP5(SEQ ID NO4)和oALDOP3(SEQ ID NO5))
進(jìn)行連接。所得到的構(gòu)建體(質(zhì)粒pGT24)是便利的小型穿梭(大腸桿
菌-枯草芽孢桿菌)載體，它提供了轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)及一個(gè)核糖體
結(jié)合位點(diǎn)其緊接位于唯一的EcoRI位點(diǎn)前，EcoRI位點(diǎn)后面接著幾個(gè)其
它的唯一限制性位點(diǎn)(XbaI，XhoI，BamHI))。質(zhì)粒pGT24的醛縮酶啟
動(dòng)子可以容易地與利用SalI和EcoRI限制性位點(diǎn)的任何其它啟動(dòng)子
進(jìn)行交換。氯霉素抗性標(biāo)記可以既在大腸桿菌又在枯草芽孢桿菌中作
篩選之用。
·質(zhì)粒pGTK24是pGT24的一種衍生質(zhì)粒，其中氯霉素抗性基因被卡那霉
素抗性基因代替。這是通過(guò)使用兩種寡核苷酸引物oKAN5(SEQ ID
NO14)和oKAN3(SEQ ID NO15)的PCR對(duì)質(zhì)粒pDG783的卡那霉素抗
性基因進(jìn)行擴(kuò)增、利用ScaI和BamHI消化PCR產(chǎn)物并與利用BclI和
SnaBI消化的pGT24進(jìn)行連接來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
質(zhì)粒pGT24和pGTK24的構(gòu)建通過(guò)附圖6，7和8說(shuō)明。在合成的第二部分，利用革蘭氏陰性菌摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)ATCC 25829的木糖醇脫氫酶(XDH)基因的已知序列(GenBank編號(hào)，L34345)通過(guò)PCR對(duì)該基因的編碼序列進(jìn)行克隆。應(yīng)用于此PCR的有義和反義寡核苷酸是oMXD52(SEQ ID NO16)和oMXD32(SEQ ID NO17)。將PCR擴(kuò)增的XDH基因的編碼序列插入到表達(dá)載體pGTK24的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間(詳細(xì)情況如附圖9所示)。發(fā)現(xiàn)所得到的質(zhì)粒pGTK24(MXD2)包含一個(gè)插在EcoRI位點(diǎn)中的附加99bp DNA片斷。此DNA片斷(具有序列GAATTCTATGTGGTTATCGAAGGCGGTATGACCAACCTGGAACGTCAGCAGATCCTGACTGAAGAGCAGTATCTGGACGCGCTGGAAGAGTTCGGTGAC)明顯來(lái)自大腸桿菌染色體的rpoBC區(qū)。盡我們所知，此片斷在pGTK24(MXD2)中沒(méi)有功能只是一個(gè)人為造成的克隆產(chǎn)生物。它似乎對(duì)于木糖醇脫氫酶基因在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的表達(dá)沒(méi)有大的影響。利用上述程序?qū)GTK24(MXD2)引入枯草芽孢桿菌菌株D170和GX7(實(shí)施例6)中(枯草芽孢桿菌菌株BD170作為轉(zhuǎn)化GX7的中間宿主)。
使菌株BD170[pGTK24(MXD2)]以及未轉(zhuǎn)化的菌株BD170在LB或含有10％葡萄糖的LB上生長(zhǎng)過(guò)夜，制備出細(xì)胞提取物并測(cè)定XDH活性。測(cè)定XDH活性的試驗(yàn)條件是30℃，50mM Tris-HCI，pH7.0，0.2mM NADH和10mM D-木酮糖。記錄340nm下的吸光度改變；一個(gè)活性單位定義為在試驗(yàn)條件下每分鐘催化一摩爾底物還原的酶量(假定NADH/NAD+的差別吸收系數(shù)等于6.25×104M-1cm-1)。下列水平的XDH活性是在生長(zhǎng)于兩種介質(zhì)上的BD170[pGTK24(MXD2)]菌株中測(cè)定的LB-0.5U/mg蛋白，LB-葡萄糖0.05-0.15U/mg蛋白。因此，葡萄糖顯示出使醛縮酶啟動(dòng)子的活性減小3-10倍。在生長(zhǎng)于兩種介質(zhì)的任一種上的菌株BD170中均沒(méi)有檢測(cè)到XDH活性。
實(shí)施例8
利用表達(dá)木糖醇脫氫酶的枯草芽孢桿菌菌株生產(chǎn)五碳糖和糖醇
除了變化不同發(fā)酵中的通氣條件和使用較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間之外，基本上如實(shí)施例3的描述，將包含質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌菌株GX7[pGTK24(MXD2)]在包含10％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通氣水平的變化是定性的，是通過(guò)改變培養(yǎng)體積和搖動(dòng)條件來(lái)達(dá)到的?！案摺蓖饪梢酝ㄟ^(guò)如下方式得到將裝有3ml培養(yǎng)液的20ml試管與搖床平臺(tái)成30°角固定，并在200rpm下?lián)u動(dòng)；“中度”通氣可以通過(guò)在相同條件下培養(yǎng)10ml培養(yǎng)液得到；“低”通氣條件與“中度”通氣條件相同，只是將試管垂直固定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)見(jiàn)表3。
表3中的數(shù)據(jù)清楚顯示了通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵條件和通過(guò)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)適當(dāng)?shù)亩嘣济摎涿福梢詫挿秶乜刂朴芍亟M枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的五碳糖/糖醇的性質(zhì)。以表3中的結(jié)果為例，可以看到在發(fā)酵產(chǎn)品混合物中酮糖向糖醇的轉(zhuǎn)化量從基本為零變化到約80％。表3XDH的表達(dá)和通氣條件對(duì)于D-木酮糖和木糖醇在枯草芽孢桿菌菌株GX7的培養(yǎng)基中累積的影響(*)在低通氣條件下發(fā)酵7天后，再在高通氣條件下發(fā)酵3天
應(yīng)當(dāng)注意的是表達(dá)載體pGTK24(MXD2)在重組B subtilis細(xì)胞中提供了僅中等水平的XDH。利用比醛縮酶啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子將能夠提高XDH的表達(dá)水平和D-核酮糖-核糖醇生物轉(zhuǎn)化的效率。對(duì)此系統(tǒng)進(jìn)一步的改進(jìn)可以通過(guò)更精確地控制發(fā)酵條件(具體來(lái)說(shuō)，補(bǔ)料分批發(fā)酵中的溶解氧的濃度，葡萄糖濃度和補(bǔ)料速率等來(lái)完成)。在本實(shí)施例描述的實(shí)驗(yàn)中葡萄糖轉(zhuǎn)化成木糖醇的慢速度可以利用簡(jiǎn)單的批式發(fā)酵進(jìn)行解釋?？梢岳闷渲芯哂休^高密度的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的補(bǔ)料分批式發(fā)酵(例如，對(duì)于枯草芽孢桿菌可以獲得的細(xì)胞密度為大約或超過(guò)每升100g細(xì)胞干重)或者將細(xì)胞高密度地固定在固相載體上來(lái)提高此速率。
實(shí)施例9
利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)其它五碳糖和糖醇
本發(fā)明已經(jīng)建立了葡萄糖生物轉(zhuǎn)化成五碳糖的一般效率和靈活性并通過(guò)實(shí)施例1-8來(lái)舉例說(shuō)明。相同的概念可以進(jìn)一步擴(kuò)展到生產(chǎn)和獲得除了被用作本研究的模型的D-核酮糖，D-木酮糖和木糖醇之外的五碳糖。
一種這樣的擴(kuò)展是以核糖醇脫氫酶基因代替用于我們實(shí)驗(yàn)中的木糖醇脫氫酶基因。例如，將產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)(Loviny，T.，等Biochem.J.230579-585(1985))的核糖醇脫氫酶基因在菌株GX2中表達(dá)，并收集，如果需要的話分離產(chǎn)生的核糖醇。通過(guò)控制或調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)的通氣條件，如上所示，使核糖醇的生產(chǎn)量最大化。在本實(shí)施例中，利用以核糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的菌株指導(dǎo)碳流從葡萄糖流向D-核酮糖或核糖醇。利用已知的程序分離產(chǎn)生的核糖醇。
阿拉伯糖醇的生產(chǎn)可以利用重組枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵葡萄糖進(jìn)行，此菌株是利用編碼下列兩種酶之任一種的基因轉(zhuǎn)化得到的形成的D-木酮糖的阿拉伯糖醇脫氫酶基因例如來(lái)自土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)的[U.S.專利No.5,631,150]或者形成D-核酮糖的阿拉伯糖醇脫氫酶基因例如來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母的[(Hallborn，J.，等，Yeast11839-847(1995)，Genbank序列編號(hào).Z46866)]。在前一種情況下，優(yōu)選的用于轉(zhuǎn)化的宿主是產(chǎn)生D-木酮糖的菌株如GX7，在后一種情況下，是產(chǎn)生D-核酮糖的菌株如GX2。利用已知的程序分離產(chǎn)生的阿拉伯糖醇。
產(chǎn)生核酮糖的宿主，例如，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC31094、GX2或GX7，還可以通過(guò)在宿主內(nèi)(過(guò))表達(dá)編碼酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因進(jìn)行進(jìn)一步修飾(此酶也稱為塔格糖差向異構(gòu)酶)。如此修飾的結(jié)果是，提高了這類宿主中的木酮糖產(chǎn)量。來(lái)自菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)的適當(dāng)酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的核苷酸序列可以從GenBank編號(hào)AB000361獲得。
類似地，產(chǎn)生核酮糖的宿主，如，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 31094、GX2或GX7，也可以進(jìn)一步修飾以有效生產(chǎn)木糖醇。在這種情況下，應(yīng)當(dāng)在這種宿主中共表達(dá)兩種基因，一種編碼木糖醇脫氫酶(例如，來(lái)自摩氏摩根氏菌的木糖醇脫氫酶，GenBank編號(hào)L34345)的基因和一種編碼酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因(如前段中描述的基因)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是在產(chǎn)酮戊糖的枯草芽孢桿菌菌株中表達(dá)多種已知醛糖異構(gòu)酶基因中的一種，并由此指導(dǎo)發(fā)酵朝向例如D-木糖的方向進(jìn)行(在產(chǎn)木酮糖的菌株GX7中表達(dá)大量已知D-木糖異構(gòu)酶中的任一種)。
類似地，D-來(lái)蘇糖的生產(chǎn)，可以通過(guò)在產(chǎn)D-木酮糖的芽孢桿菌屬(Bacillus)宿主中表達(dá)D-甘露糖異構(gòu)酶基因來(lái)進(jìn)行(Stevens，F(xiàn).J.，等，J.Gen.Microbiol.124219-23(1981)；Allenza，P.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.24-25171-182(1990))。利用已知的程序分離D-來(lái)蘇糖。
編碼L-果糖異構(gòu)酶的基因如大腸桿菌基因fucI(它的序列在GenBank編號(hào)U29581下)可以在D-核酮糖生產(chǎn)菌株GX2中表達(dá)。結(jié)果導(dǎo)致生產(chǎn)出D-阿拉伯糖—一種較為常見(jiàn)的L-阿拉伯糖的不尋常的立體異構(gòu)體(Garcia-Junceda，E.，等，Bioorg.Med.Chem.31349-1355(1995)).
實(shí)施例10
在枯草芽孢桿菌中增加進(jìn)入戊糖磷酸途徑的葡萄糖碳流
并且修飾葡萄糖吸收系統(tǒng)
已經(jīng)知道破壞枯草芽孢桿菌的糖酵解途徑上部分的許多突變(Sonenshein，L.，等，編.，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其它革蘭氏陽(yáng)性菌，American Society for Microbiology，1993，第173頁(yè))，包括例如，葡糖磷酸異構(gòu)酶、果糖磷酸激酶和果糖二磷酸醛縮酶基因中的突變。利用相應(yīng)基因(pgi，fruB，fbaA(tsr)，iolJ)的已知序列和基因破壞技術(shù)，可以相對(duì)容易地在任一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株中構(gòu)建這樣的突變。
優(yōu)選地，枯草芽孢桿菌的葡萄糖特異性PTS系統(tǒng)的失活通過(guò)利用隨機(jī)誘變對(duì)ptsG基因進(jìn)行突變，或優(yōu)選地通過(guò)基于重組DNA的技術(shù)(基因破壞)來(lái)完成。獲得ptsG基因的DNA序列(例如，在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址(http//genomeweb.pasteur.fr/GenoList/SubtiList/))可以簡(jiǎn)化后一種技術(shù)的使用。
已知許多葡糖激酶和己糖激酶基因并且它們能夠用于本發(fā)明。例如，枯草芽孢桿菌的同源葡糖激酶(由glck基因編碼)可以利用本說(shuō)明書(shū)已描述的技術(shù)進(jìn)行過(guò)表達(dá)。己糖激酶的優(yōu)點(diǎn)是可以以葡萄糖和果糖作為底物。例如，眾所周知的編碼己糖激酶I和II的酵母HXK1或HXK2基因，可以被利用并在PTS缺陷的宿主中表達(dá)。
具有修飾的葡萄糖吸收系統(tǒng)的細(xì)菌菌株的附加葡萄糖運(yùn)輸能力可以通過(guò)兩種方法獲得。首先，對(duì)基于葡萄糖的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)的克隆的篩選，提供了強(qiáng)有力的篩選方法，這種方法與適當(dāng)?shù)恼T變技術(shù)結(jié)合(如化學(xué)或UV誘變)將容易地提供具有所需性能的突變體?；蛘?，同源的(例如，由g1cT1基因編碼)或來(lái)自其它生物(優(yōu)選原核生物，如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的glf基因Weisser，P.，等，J.Bacteriol.177(11)3351-3354(1995))的異源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/促進(jìn)因子(facilitator)可以在芽孢桿菌屬(Bacillus)宿主中表達(dá)。
實(shí)施例11
提高PPP氧化階段的能力
通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼PPP途徑中的關(guān)鍵酶的同源或異源基因可以提高本發(fā)明宿主的PPP的能力，所述酶包括葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(以及任選地磷酸葡糖內(nèi)酯酶)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用的葡萄糖6-磷酸脫氫酶基因是來(lái)自只能夠通過(guò)6-磷酸葡糖酸代謝葡萄糖的生物(如異型發(fā)酵乳酸菌)。這樣一個(gè)基因的適宜的實(shí)例是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的zwf基因(Barnell，W.O.，等，J.Bacteriol.174(12)7227-7240(1990))。
實(shí)施例12釀酒酵母的TKL1和TKL1，2缺陷型菌株的遺傳構(gòu)建；木糖醇脫氫酶(XDH)
編碼基因的轉(zhuǎn)化以及木酮糖激酶(XK)編碼基因的缺失
從Dr.I.Schaaff-Gerstenschlger獲得同時(shí)具有被破壞的TKL1和TKL2編碼基因的釀酒酵母菌株W303-1B(Thomas，B.J.和Rothstein，R.，Cell 56619-630(1989)。此菌株被重命名為H1055。
利用以下的常規(guī)方法構(gòu)建不同的酵母菌株
將目的DNA片斷從瓊脂糖凝膠切離出來(lái)并放進(jìn)eppendorf管中(大約200-300μl)。利用粗的無(wú)菌玻璃棒將瓊脂糖凝膠壓碎。加入200μl的10mMTrisHCl pH7.5，1mM EDTA-緩沖液(TE)。任選地將壓碎的瓊脂糖/TE放置在4℃下過(guò)夜以提高產(chǎn)量。加入300μl苯酚，旋轉(zhuǎn)混合一分鐘并立即放置到液氮中冰凍。在室溫下將冰凍管離心15分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的試管中，用300μl氯仿-異戊醇(24∶1)抽提，旋轉(zhuǎn)混合0.5分鐘，離心3分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的試管中。DNA利用1/10體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的94％冷乙醇在20℃下過(guò)夜(或-70℃，30分鐘)進(jìn)行沉降。將沉淀物在4℃離心15-20分鐘。以70％乙醇洗滌沉淀并干燥。將DNA溶解于TE或水中?；蛘呃肣IAquick方法，按照用于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen GmbH，德國(guó))的QIAquick Spin手冊(cè)的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。
按照Bio-Rad基因脈沖儀器的說(shuō)明，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌。所有酵母的轉(zhuǎn)化通過(guò)醋酸鋰方法進(jìn)行(Hill，J.，等，Nucl.Acids Res.195791(1991)；Gietz，D.，等，Nucl.Acids Res.201425(1992))。構(gòu)建的所有酵母菌株和質(zhì)粒列于附錄1和2。
常規(guī)地，所有的酵母培養(yǎng)既可以使用1％酵母提取物，2％蛋白胨(YP)的培養(yǎng)基，也可以使用包含所提及碳源(D是葡萄糖，F(xiàn)是果糖)的經(jīng)過(guò)修改的酵母人工完全培養(yǎng)基(其中具有必需氨基酸和堿基)[SC；Sherman等，Methods in yeast genetics.A laboratory manual.Cold SpringHarbor Laboratory.Cold Spring Harbor，NY，USA(1983)]，在通氣搖瓶中30℃，250rpm搖床上進(jìn)行。酵母的極限培養(yǎng)基中包含6.7g/l酵母氮堿(Merck，德國(guó))、所提及碳源、僅由于菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷而被需要的氨基酸和堿基。TKL1，2缺陷型菌株不能在沒(méi)有芳香族氨基酸時(shí)生長(zhǎng)。
構(gòu)建一個(gè)酵母菌株，其中只有TKL1編碼基因被破壞。菌株CEN.PK2-1D[重命名為H1346，Boles，E.，等，Mol.Microbiol.2065-76(1996)]用作宿主菌株。從Jrg Hauf(Darmstadt，德國(guó))獲得包含TKL1編碼基因的破壞片斷的質(zhì)粒并重命名為B1087。其是攜帶了被URA3編碼基因破壞的TKL1編碼基因的pUC19載體[Schaaff-Gerstenschlger，I.和Zimmermann，F(xiàn).K.，Curr.Genet.24373-376(1993)]。利用SacI和BamHI消化質(zhì)粒B1087，釋放出該破壞片斷，并從瓊脂糖凝膠中將其分離出來(lái)。利用此片斷轉(zhuǎn)化H1346菌株，并在缺少尿嘧啶的平板上篩選轉(zhuǎn)化體得到URA3陽(yáng)性克隆。通過(guò)RNA印跡分析證實(shí)了基因的缺失。所得到的菌株被命名為H1764。
將編碼樹(shù)干畢赤酵母[Ktter，P.，等，Curr.Genet.18493-500(1990)]的木糖醇脫氫酶(XDH)的XYLZ基因克隆到pMA91表達(dá)載體的BglII位點(diǎn)(Mellor，J.，等，Gene 241-14(1983))，得到質(zhì)粒pAOS63(附圖11)。將表達(dá)盒，也就是位于PGK啟動(dòng)子和終止子之間的XYL2基因作為HindIII片斷從pMA91載體釋放出來(lái)，用Klenow酶對(duì)其進(jìn)行處理，并克隆到酵母多拷貝載體pRS423的EcoRV位點(diǎn)(Christianson，T.W.，等，Gene110119-122(1992))得到質(zhì)粒pAOS67(附圖12)，或者克隆到Y(jié)Ep24H的PvuII位點(diǎn)(Aalto，M.，等，EMBO Journal 124095-4104(1993))得到質(zhì)粒pAOS64(附圖13)。
載體pAOS66(附圖14)(其中包含來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母的受PGK1啟動(dòng)子調(diào)控的編碼木糖還原酶(XR)的XYL1基因和受修飾的ADH1啟動(dòng)子調(diào)控的編碼木糖醇脫氫酶(XDH)的XYL2基因)(Ruohonen，L.，等，J.Biotechnol.39193-203(1995))以BamHI進(jìn)行消化，從瓊脂糖凝膠中分離出包含了用于XYL2基因的表達(dá)盒的2.2kbp片斷，并利用Klenow酶產(chǎn)生平末端。利用NcoI消化質(zhì)粒B713(URA3基因是1.2kbp片斷，位于細(xì)菌克隆載體Bluescript KS(+)(Stratagene，CA，USA)多克隆位點(diǎn)的HindIII位點(diǎn)中；URA3編碼乳清酸核苷-5′-P脫羧酶)，用Klenow酶處理并將XYL2表達(dá)盒連接到載體中。所得的質(zhì)粒B995(附圖15)具有位于修飾的ADH1啟動(dòng)子和ADH1終止子之間的XYL2基因，該基因兩末端接有用于靶向宿主菌株的URA3座位的URA3序列，利用PvuII和HindIII酶對(duì)此質(zhì)粒進(jìn)行消化。利用QIAquick法(Qiagen GmbH，德國(guó))從瓊脂糖凝膠中提純HindIII片斷。利用此片斷轉(zhuǎn)化TKL1，2缺陷型酵母菌株H1055，使轉(zhuǎn)化體在YPD平板上生長(zhǎng)過(guò)夜，然后將影印物鋪在FOA(5-氟乳清酸)平板上，篩選尿嘧啶陰性轉(zhuǎn)化體(Cold Spring Harbor Laboratory Press，酵母遺傳學(xué)方法(Methods in yeast genetics)，1994，pp.188-189)。通過(guò)測(cè)定粗細(xì)胞抽提物(對(duì)于細(xì)胞提取物制備和XDH活性測(cè)定，參見(jiàn)實(shí)施例15)中的XDH活性以及Southern印跡分析來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)化體中的整合情況。所得到的整合菌株被命名為H1506。
Trichoderma reesei的XYL2同源物來(lái)自在載體pAJ401中構(gòu)建的cDNA文庫(kù)(Saloheimo，A.，等，Mol.Microbiol.13219-228(1994))，在載體中cDNA位于PGK1啟動(dòng)子和終止子之間。從在含有幾種植物多糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的T.reesei Rut-C30分離出Poly(A)+mRNA(Stal brand，H.，等，Appl.Environ.Microbiol.611090-1097(1995))。利用ZAP-cDNA合成試劑盒(stratagene，CA，USA)合成cDNA，并連接到質(zhì)粒pAJ401中(Margolles-Clark，E.，等，Appl.Environ.Microbiol.623840-3846(1996))。以大約120μg cDNA庫(kù)DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株H475，此菌株在多拷貝質(zhì)粒pMA91上攜帶來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母編碼木糖還原酶(XR)的XYL1基因[Hallborn，J.，等，Bio/Technology 91090-1095(1991)]。獲得含有3.7×105獨(dú)立克隆的酵母cDNA庫(kù)。如果細(xì)胞中同時(shí)存在XR和XDH編碼基因，則在含有20g/l葡萄糖的SC-leu-ura培養(yǎng)基上收集酵母庫(kù)，并在含有20g/l木糖的SC-leu-ura平板上鋪平板(5×105個(gè)細(xì)胞/平板)，以篩查在純的木糖平板上的生長(zhǎng)能力。從生長(zhǎng)在木糖平板上的九個(gè)克隆菌落中分離出cDNA庫(kù)質(zhì)粒，利用四個(gè)克隆對(duì)H475再次進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再次驗(yàn)證在純木糖上生長(zhǎng)的能力。對(duì)六個(gè)克隆的5′末端測(cè)序，其中四個(gè)克隆顯示出與編碼樹(shù)干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶的XYL2基因同源。
利用BamHI和HindIII從載體中釋放出在pAJ401中位于PGK啟動(dòng)子和終止子之間的T.Reesei的XYL2同源物的表達(dá)盒(大約2.5kbp片斷)，并使用QIAquick方法從瓊脂糖凝膠上回收該片段。將此片斷連接到Y(jié)Eplac 195相應(yīng)的位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1070，它被轉(zhuǎn)化到宿主H1052中，得到酵母菌株H1748。為了構(gòu)建整合盒，將此片斷與利用HindIII和BamHI消化的質(zhì)粒B955連接。質(zhì)粒B955(Toikkanen，J.和Kern en，S.，待發(fā)表(1999))是攜帶兩個(gè)片斷的URA3基因的Bluescript SK(-)載體；來(lái)自該基因編碼區(qū)的第71-450位和第781-1135位堿基對(duì)分別位于多聚接頭區(qū)域的SacI-XbaI位點(diǎn)和XhoI-Asp718位點(diǎn)。該克隆載體中剩余的多接頭位點(diǎn)HindIII和BamHI被用于在兩個(gè)URA3片斷之間通過(guò)粘性末端連接頭位點(diǎn)HindIII和BamHI被用于在兩個(gè)URA3片斷之間通過(guò)粘性末端連接引入XYL2表達(dá)盒。所得的質(zhì)粒B1068(附圖16)是6.2kbp。通過(guò)SacI-Asp718消化從Bluescript SK(-)中釋放出此表達(dá)盒(5′URA3 71-450bp-XYL2表達(dá)盒5′-3′-URA3 781-11353′)，并從瓊脂糖凝膠分離出來(lái)。1μg的片斷用于轉(zhuǎn)化TKL1，2缺陷型菌株H1055。轉(zhuǎn)化體的篩選和驗(yàn)證如上文所描述，并將其命名為H1741。
開(kāi)放閱讀框(ORF)YLR070c與樹(shù)干畢赤酵母的XYL2基因具有高同源性，并且已被證明編碼具有木糖醇脫氫酶活性的酶[Richard，P.，等，F(xiàn)EBSLetters 457135-138(1999)]。通過(guò)PCR從酵母W303-1B(重命名為H1104)的基因組DNA，利用寡核苷酸對(duì)oSCXYL21(SBQ ID NO20)和oSCXYL22(SEQ ID NO21)對(duì)ORF YLR070c進(jìn)行擴(kuò)增。得到的PCR產(chǎn)物以BamHI進(jìn)行消化，從瓊脂糖凝膠中純化并連接到pMA91表達(dá)載體的PGK啟動(dòng)子和終止子之間的BglII位點(diǎn)中。用得到的克隆B1163轉(zhuǎn)化酵母菌株H1104，得到菌株H1886。
利用寡核苷酸對(duì)oSCXKS11(SEQ ID NO22)和oSCXKS12(SEQ ID NO23)，通過(guò)PCR從酵母菌株H1104的全DNA中擴(kuò)增木酮糖激酶(XK)的編碼基因(XKS1，ORF YGR194c)。以EcoRV消化PCR產(chǎn)物并從瓊脂糖凝膠中純化出來(lái)。將XK編碼片斷連接進(jìn)克隆載體pRSETC(Invitrogen，TheNetherlands)的PvuII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1025。缺失盒的構(gòu)建方式是首先將XKS1的1kbp EaeI片斷從B1025轉(zhuǎn)移到pZErOTM-1載體(Invitrogen)的相容位點(diǎn)NotI，然后ScaI消化從XKS1序列中間去除一個(gè)500bp的片斷。將利用ScaI進(jìn)行過(guò)缺失的XKS1片斷作為NsiI片斷從這個(gè)載體上轉(zhuǎn)移到Bluescript SK(-)的PstI位點(diǎn)。來(lái)自pFA6-kanMX2質(zhì)粒[Wach，A.，等，Yeast 101793-1808(1994)]的kanMX2片斷作為一個(gè)PvuII-SpeI片斷從該載體中釋放出，并且通過(guò)平末端連接將該片段克隆到XKS1序列的BstEII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1154(附圖17)。通過(guò)PCR利用寡核苷酸對(duì)oSCXKS13(SEQ ID NO24)和oSCXKS14(SEQ ID NO25)對(duì)B1154的破壞盒進(jìn)行擴(kuò)增。用片斷轉(zhuǎn)化TKL1，2缺陷型菌株(H1506)，此菌株具有整合在基因組中的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因。在含有200mg/l抗生素G418的YPD平板上篩核酮糖激酶缺陷型轉(zhuǎn)化體。通過(guò)PCR和Sonthern印跡驗(yàn)證此破壞。所獲菌株命名為H1854。
實(shí)施例13
在釀酒酵母的轉(zhuǎn)酮酶缺陷型菌株中的五碳糖磷酸的累積
在TKL1，2缺陷型菌株(H1055)和宿主菌株(H1104)中測(cè)定糖磷酸。細(xì)胞在SCD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分別達(dá)到1.4(H1055)和4.0(H1104)的光密度(OD)600，收集細(xì)胞，用水洗滌一次并懸浮于PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽，150mM NaCl，pH6.7)中，得到的密度為0.2g濕重/ml。加入葡萄糖使其終濃度為20g/l，20分鐘后在冷甲醇中將細(xì)胞迅速破碎并利用甲醇/氯仿程序進(jìn)行抽提(de Koning，W.，和van Dam，K.，Anal.Biochem.204118-123(1992))。
利用酶學(xué)分析量化5-碳糖磷酸。主要按照Bergmeyer[Methods inenzymatic analysis，Vol.3(1974)Verlag Chemie，Academic Press]描述的方法測(cè)定木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸。木酮糖-5-磷酸的測(cè)定在0.1M TEA(三乙醇胺)緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液pH7.2并含有0.15mM核糖-5P、0.22mM NADH、25U甘油醛-3-磷酸異構(gòu)酶(TPI)、0.85U甘油-3P脫氫酶(G3PDH)。以終濃度為1.2U/ml的轉(zhuǎn)酮酶(TKL)(Sigma，USA)起始反應(yīng)。監(jiān)測(cè)340nm下吸光度的減少。所有酶，除了轉(zhuǎn)酮酶都從Boehringer Mannheim(德國(guó))購(gòu)買。核酮糖-5P的測(cè)定如用于測(cè)定木酮糖-5P的所述方法，不同的是此反應(yīng)以木酮糖-5P差向異構(gòu)酶(Sigma USA)進(jìn)行起始，此酶能夠?qū)⒑送?5-磷酸轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸。木酮糖-5P差向異構(gòu)酶的終濃度是2U/ml。除了加入木酮糖-5P(sigma)以代替使用過(guò)量的核糖-5P外，核糖-5P的測(cè)定如木酮糖-5P的測(cè)定。根據(jù)Gancedo和Serrano[Gancedo，C.和Serrano，R.，TheYeasts，vol 3，端Rose A.H.和Harrison J.S.，pp 205-260，AcademicPress Ltd.，London，(1989)]方法計(jì)算糖磷酸的細(xì)胞內(nèi)濃度。結(jié)果如表4所示。表4.在TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104中的5-碳糖磷酸的累積
在這個(gè)具體實(shí)驗(yàn)中，與宿主菌株相比，TKL缺陷型菌株中的木酮糖-5P(X5P)水平高25倍，核酮糖-5P(Ru5P)和核糖-5P(Ri5P)濃度高2-3倍。實(shí)驗(yàn)表明與宿主酵母菌株相比，五碳糖磷酸在TKL缺陷型菌株中累積到達(dá)較高水平。
實(shí)施例14
通過(guò)釀酒酵母的
轉(zhuǎn)酮酶缺陷型菌株生產(chǎn)多元醇和戊糖
將宿主菌株H1104和TKL1，2缺陷型菌株H1055在酵母極限培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在SCD培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)，達(dá)到OD600為3-5，離心收集細(xì)胞并以水洗滌一次，然后將細(xì)胞重新懸浮使得OD600為0.1，以用于在酵母極限培養(yǎng)基上的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)過(guò)程中在指示的時(shí)間點(diǎn)抽取樣品，測(cè)定OD600值，離心去除細(xì)胞并利用Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇比色法分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇。結(jié)果如表5顯示。應(yīng)用于此分析試劑盒的山梨糖醇脫氫酶(SDH)能夠氧化D-山梨糖醇和木糖醇，并且以較慢的速率(例如，不是定量地)氧化其它多元醇如核糖醇，艾杜糖醇和阿洛糖醇。OD600 1.0相當(dāng)于0.3g/l的細(xì)胞干重。表5.TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104生產(chǎn)的多元醇
1)多元醇的測(cè)定利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒進(jìn)行
2)抽取生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品的時(shí)間點(diǎn)以小時(shí)計(jì)算可以觀察到TKL1，2缺陷型菌株H1055的多元醇的產(chǎn)量比宿主菌株H1104提高了15-20倍。
還通過(guò)HPLC對(duì)29h，53h和101h時(shí)間的生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析。分析之前，通過(guò)凍干將樣品濃縮5倍。使用具有CarboPac PA-10柱的DIONEXDX-500裝置(30℃，流速1 ml/min；洗脫液A＝水，B＝100mM NaOH，C＝300mM醋酸鈉/100mM NaOH，D＝300mM NaOH；梯度洗脫如下100％A在21h，100％B在40h，50％B+50％C在60h，100％C在60.10h，100％C在64h，100％D在64.10h，100％D在67h，100％A在67.10h，100％A在82h)。在所用的分析條件下，對(duì)核酮糖和木酮糖進(jìn)行共洗脫。結(jié)果如表6所示。表6.TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104產(chǎn)生的羥基化合物(木糖醇和核糖醇)和5-碳糖。1)抽取生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品的時(shí)間點(diǎn)以小時(shí)計(jì)算；2)木糖醇+核糖醇g/g細(xì)胞干重；3)核糖g/g細(xì)胞干重；4)核酮糖+木酮糖g/g細(xì)胞干重
HPLC結(jié)果顯示，在TKL1，2缺陷型菌株中多元醇的產(chǎn)量比宿主菌株中的提高了40倍。另外，5-碳糖的產(chǎn)量也明顯增加，對(duì)核糖和核酮糖+木酮糖來(lái)說(shuō)分別增加了175和40倍。含量小于1-2％的多元醇有阿拉伯糖醇，甘露醇或山梨糖醇(后者的測(cè)定在另一實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)，表明由TKL1，2缺陷型菌株生產(chǎn)的多元醇是核糖醇和木糖醇。
實(shí)施例15利用含有木糖醇脫氫酶(XDH)編碼基因的釀酒酵母轉(zhuǎn)酮酶缺陷型菌株生產(chǎn)多元醇和戊糖，其中所述基因或來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母并既可以位于多拷貝的質(zhì)粒上也可以整合在基因組中，或來(lái)自屬Trichoderma Reesei并整合在基
因組中。a)利用釀酒酵母的TKL1缺陷型菌株進(jìn)行多元醇的生產(chǎn)，其中此菌株含有位于多拷貝質(zhì)粒上來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因
轉(zhuǎn)酮酶活性缺陷的酵母菌株是芳香族氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因?yàn)榉枷阕灏被岬暮铣汕绑w赤蘚糖-4-磷酸在TKL1，2缺陷型菌株中不能合成。如果部分葡萄糖也能夠支持細(xì)胞的維持，則可能是有益的。在只有轉(zhuǎn)酮酶的主要異構(gòu)型TKL1被破壞的菌株中這是可能的。
利用含有樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的多拷貝載體(pAOS67；附圖12)轉(zhuǎn)化TKL1缺陷型菌株H1764及其相應(yīng)的宿主菌株H1346(參見(jiàn)附錄I，表32)，分別得到菌株H1765和H1766。將得到的菌株在缺少組氨酸的SCD培養(yǎng)基上培養(yǎng)以進(jìn)行質(zhì)粒篩選。在指示的時(shí)間點(diǎn)取樣，離心細(xì)胞并利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的多元醇。結(jié)果顯示見(jiàn)表7。表7由載有具樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的多拷貝載體pAOS67的TKL1缺陷型菌株H1765和宿主菌株H1766產(chǎn)生的多元醇(木糖醇+核糖醇)。1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣時(shí)間點(diǎn)以小時(shí)計(jì)算
在整個(gè)70h的培養(yǎng)期中，觀察到TKL1缺陷型菌株與野生型相比生產(chǎn)的多元醇(g多元醇/g細(xì)胞干重)提高到2倍。本實(shí)驗(yàn)表明多元醇產(chǎn)量的提高可利用只缺陷一種轉(zhuǎn)酮酶異構(gòu)型TKL1的酵母菌株獲得。b)利用釀酒酵母的TKL1，2缺陷型菌株進(jìn)行多元醇和戊糖的生產(chǎn)，其中此菌株含有位于多拷貝質(zhì)粒上的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因
利用含有樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的多拷貝載體(pAOS67；附圖12)轉(zhuǎn)化宿主菌株H1104和TKL1，2缺陷型菌株H1055，分別得到菌株H1160和H1057(附錄I，表32)。所得的菌株在酵母極限培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在用于篩選質(zhì)粒的缺少組氨酸的SCD培養(yǎng)基上培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物，使OD600達(dá)到3-5，離心收集細(xì)胞并以水洗滌一次，然后將細(xì)胞重新懸浮使得OD600為0.1，以用于在酵母極限培養(yǎng)基上的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)過(guò)程中在指示的時(shí)間點(diǎn)抽取樣品，離心去除細(xì)胞并利用Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒和HPLC(見(jiàn)實(shí)施例14)分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇。結(jié)果如表8顯示。表8.由TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104，以及載有具樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的多拷貝載體pAOS67的分別相應(yīng)的菌株H1057和H1160產(chǎn)生的多元醇(木糖醇+核糖醇)1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行2)利用Boehringer Mannheim山梨糖醇/木糖醇試劑盒測(cè)定多元醇核糖醇+木糖醇(g/g細(xì)胞干重)3)利用HPLC(DIONEX DX 500，CarboPack PA-10)測(cè)定木糖醇和核糖醇(g/g細(xì)胞干重)
如在實(shí)施例14中的討論，可以觀察到TKL1，2缺陷型菌株H1055與宿主菌株H1104相比多元醇的產(chǎn)量提高了15-40倍。當(dāng)樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因在TKL1，2缺陷型菌株中的多拷貝質(zhì)粒上進(jìn)行表達(dá)時(shí)，該產(chǎn)物產(chǎn)量又增加大約5倍。本實(shí)驗(yàn)中，多元醇組分由木糖醇和核糖醇構(gòu)成，主要是核糖醇，僅有約10到15％的多元醇是核糖醇。
利用HPLC(參見(jiàn)實(shí)施例14)，也分析了生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中5-碳糖。結(jié)果如表9所示。表9.由載有攜帶具樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的多拷貝載體pAOS67的TKL1，2缺陷型菌株和宿主菌株，分別為H1057和H1160產(chǎn)生的多元醇(木糖醇+核糖醇)和5-碳糖。1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行2)木糖醇+核糖醇g/g細(xì)胞干重(結(jié)果來(lái)自表8)3)核糖g/g細(xì)胞干重4)核酮糖+木酮糖g/g細(xì)胞干重5)TKL1，2缺陷型菌株與宿主菌株比較，產(chǎn)量增加(x-倍)
TKL1，2缺陷型菌株中多元醇(核糖醇+木糖醇)、核糖和核酮糖+木酮糖的增加比例分別是40，175，和40倍(參見(jiàn)實(shí)施例14)，而在XDH編碼基因存在時(shí)分別增加220，130和75倍，證明這些比率向著多元醇和木酮糖+核酮糖移動(dòng)。
同單純TKL1，2缺陷型菌株相比，多拷貝載體上的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的過(guò)表達(dá)，使得多元醇和5-碳糖的比率發(fā)生明顯改變。5-碳糖的量從減少1.4倍到2倍，而多元醇增加4倍(參加表10)。表10.TKL1，2缺陷型菌株H1055和載有具樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的多拷貝載體pAOS67的該菌株H1057中多元醇(木糖醇+核糖醇)和5-碳糖的比率。1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行2)木糖醇和核糖醇占產(chǎn)生的總多元醇和5-碳糖的％比率3)核糖占產(chǎn)生的總多元醇和5-碳糖的％比率4)木酮糖和核酮糖占產(chǎn)生的總多元醇和5-碳糖的％比率c)通過(guò)表達(dá)編碼具有不同底物特異性的XDH酶的基因，改變TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇的比率。
對(duì)樹(shù)干畢赤酵母，Trichoderma reesei和釀酒酵母的木糖醇脫氫酶對(duì)于糖底物的特異性進(jìn)行了研究。使每一個(gè)XDH編碼基因分別在多拷貝載體pAOS67、B1070和B1163上表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例12)。將包含其中一種多拷貝載體的酵母菌株H1104(pAOS67，B1163)和H1052(B1070)，以及H1160、H1886和H1748分別在缺少適當(dāng)選擇性標(biāo)記(分別是組氨酸，亮氨酸，尿嘧啶)的SCD培養(yǎng)基上培養(yǎng)。離心收集細(xì)胞并以100mM磷酸鈉鹽緩沖液pH7.0洗滌兩次。在同種緩沖液中重新懸浮細(xì)胞使?jié)舛葹?00mg/ml濕重，大約相當(dāng)于75mg/ml干重。4℃利用1g玻璃珠(0.5mm )對(duì)1ml此懸浮液進(jìn)行15分鐘渦旋，在Eppendorf離心管中離心(13,000rpm)然后檢測(cè)上清液。在含有50mM Pipes KOH pH7.0，0.2mM NADH的介質(zhì)中檢測(cè)XDH活性。通過(guò)加入D-木酮糖或D-核酮糖至終濃度為1mM，起始反應(yīng)。由340nm下的NADH吸收值來(lái)測(cè)定活性。結(jié)果如表11所示。表11.三種真菌XDH酶對(duì)于濃度1mM的D-木酮糖和D-核酮糖的比活性。以D-木酮糖活性為100％對(duì)活性進(jìn)行標(biāo)化。
本實(shí)施例表明與樹(shù)干畢赤酵母的XDH酶相比，T.Reesei和釀酒酵母的XDH酶對(duì)于D-木酮糖具有更高的特異性。
如在實(shí)施例12中的描述，將來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母和T.reesei的同源XDH編碼基因整合到TKL1，2缺陷型菌株H1055的基因組中，分別得到H1506和H1741。在SCD培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并在指定的時(shí)間點(diǎn)取樣。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心并且分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇(木糖醇和核糖醇)。利用Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒分析總的多元醇，通過(guò)加入0.07U/ml純化的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)核糖醇脫氫酶(RDH)定量測(cè)定核糖醇的量(Bergmeyer H.U.，“酶學(xué)分析方法”，Verlag Chemie Vol 3′，Academic Press(1974)，pp.1356-1358)單獨(dú)利用RDH測(cè)定核糖醇，木酮糖的量通過(guò)從總多元醇的量中減去核糖醇的量獲得。核糖醇的檢測(cè)條件如下包含450mM TrisHCl pH8.7、5mM NAD和0.07U/ml核糖醇脫氫酶的200μl試劑中，加入樣品并且補(bǔ)加水使總體積為250μl。將此溶液在37℃下孵育20分鐘。將加入樣品之前和孵育之后的吸光度差值與在完全相同條件下測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括零對(duì)照進(jìn)行比較。所有的分析都在Cobas Mira Plus自動(dòng)分析儀(Roche)上進(jìn)行。結(jié)果如表12所示。表12.由含有整合在基因組上的樹(shù)干畢赤酵母(H1506)或T.reesei(H1741)的XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株H1055產(chǎn)生的木糖醇和核糖醇(g/g細(xì)胞干重)。1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行2)木糖醇(Xol)或核糖醇(Rol)g/g細(xì)胞干重3)木糖醇/核糖醇的比率
本實(shí)驗(yàn)公開(kāi)了如何能夠通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)亩嘣济摎涿缚刂贫嘣籍a(chǎn)物的譜系，以及如何能夠通過(guò)體外測(cè)定表征多元醇脫氫酶。通過(guò)過(guò)表達(dá)適當(dāng)脫氫酶的基因，可以按照需要的方向操縱Xol/Rol的比率。d)利用XK編碼基因失活的TKL1，2缺陷型菌株生產(chǎn)多元醇
將木酮糖激酶(XK)編碼基因從含有染色體整合的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株H1506中破壞掉，得到菌株H1854，參見(jiàn)實(shí)施例12所述。
細(xì)胞在SCD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2天。將預(yù)培養(yǎng)物以1∶50稀釋轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并繼續(xù)再生長(zhǎng)20h。離心收集細(xì)胞，水洗滌細(xì)胞一次，重新將細(xì)胞懸浮于1ml水中。通過(guò)加入細(xì)胞達(dá)到0.2的OD600，開(kāi)始在SCD培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。培養(yǎng)100h之后，收集樣品，測(cè)OD600，通過(guò)離心去除細(xì)胞，并且通過(guò)Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒利用RDH并通過(guò)特異性的核糖醇實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)前面的實(shí)施例)分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的木糖醇和核糖醇。結(jié)果如表13所示。表13.由具有整合在基因組中的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因(H1506)和此外還具有失活的XK編碼基因(H1854)的TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的木糖醇和核糖醇(g/g細(xì)胞干重)
1)木糖醇或核糖醇g/g細(xì)胞干重
2)木糖醇/核糖醇比率
同H1506菌株相比較，XK缺陷型菌株H1854產(chǎn)生較多量的木糖醇和較少量的核酮糖。木糖醇的比例從18％增加到40％。本實(shí)驗(yàn)中，核糖醇和木糖醇的總量沒(méi)有顯著變化，但是比率偏向木糖醇。本實(shí)驗(yàn)表明XK編碼基因的破壞改變了多元醇的比率。
實(shí)施例16
釀酒酵母的DOG1編碼基因以及釀酒酵母和
Zygosaccharomyces Rouxii的LTP1同源基因的克隆
從Dr.SanZ獲得位于YEplac 181載體(YEp11HP，[SanZ，P.等，Yeast10195-1202(1994)]重命名為B1016)上的2-脫氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOG1)編碼基因DOG1。利用寡核苷酸對(duì)oDOG11(SEQ ID NO26)和oDOG12(SEQ ID NO27)通過(guò)PCR對(duì)B1016質(zhì)粒的DOG1基因進(jìn)行擴(kuò)增。以HindIII消化PCR片斷并從瓊脂糖凝膠中純化出來(lái)。將此片斷連接到Bluescribe M13(B609附錄I，表33)中的位于被修飾的ADH1啟動(dòng)子和ADH1終止子之間的HindIII位點(diǎn)。所得到的克隆以BamH1和PvuII消化，從瓊脂糖凝膠中抽提出包含ADH1啟動(dòng)子-DOG1-ADH1終止子的BamHI-片斷，并將它克隆到Y(jié)Eplac 195多拷貝載體(Gietz和Sugino，Gene74527-534(1988))的BamHI位點(diǎn)得到質(zhì)粒B1020。用質(zhì)粒B1020轉(zhuǎn)化TKL1，2缺陷型菌株(H1506)，此菌株含有整合在基因組中的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因，得到菌株H1520。對(duì)照菌株包含不具有DOG1的同樣載體(YEplac 195)，命名為H1524。將質(zhì)粒B1020也轉(zhuǎn)化到宿主菌株H1104中，得到菌株H1514。
為了構(gòu)建Zygosaccharomyces rouxii的基因組文庫(kù)，利用標(biāo)準(zhǔn)方法將Z.rouxii的染色體DNA分離出來(lái)，以Sau3A進(jìn)行部分消化，將消化物中大于2kb的DNA片斷通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳分離出來(lái)。將從K.Sasnauskas(Institute of Biotechnology，Vilnius，Lithuania)獲得的大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體pL3(Ianushka，A.P.，Genetika.24(5)773-80(1988))以BamHI進(jìn)行消化，利用牛小腸磷酸酶處理并且與Z.rouxii染色體DNA的Sau3A片斷連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HB101(Stratagene，La Jolla USA)。得到約20,000個(gè)轉(zhuǎn)化體，其中估計(jì)有60-70％的克隆插入了Z.rouxii DNA。將轉(zhuǎn)化體集中成庫(kù)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從幾個(gè)這樣的庫(kù)中分離質(zhì)粒DNA。利用它在釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)菌株中對(duì)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變(HIS3，URA3，ADE1)的補(bǔ)充能力檢測(cè)文庫(kù)的質(zhì)量。
將Z.rouxii基因組文庫(kù)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母的TKL1缺陷型菌株(H1764，參見(jiàn)實(shí)施例12)中，得到10,000獨(dú)立的克隆。我們已經(jīng)觀察到TKL1缺陷型菌株H1764不能在含有0.3％或更高濃度D-木酮糖的2％半乳糖平板上生長(zhǎng)(可能是由于累積的5-碳糖磷酸的毒性濃度)。將獨(dú)立克隆鋪在具有0.5％D-木酮糖的平板上(合成的完全培養(yǎng)基，包含2％半乳糖、0.5％木酮糖和3％木糖并缺少亮氨酸，用于篩選文庫(kù)質(zhì)粒)并在這些平板上就互補(bǔ)生長(zhǎng)對(duì)這些克隆進(jìn)行篩選。
對(duì)Z.rouxii基因組文庫(kù)的篩選得到六個(gè)陽(yáng)性克隆，它們能夠在上述平板上生長(zhǎng)7天。從酵母菌落中拯救出文庫(kù)質(zhì)粒并利用限制性酶消化和測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行分析。根據(jù)限制性酶圖譜和序列數(shù)據(jù)，六個(gè)質(zhì)粒包含兩個(gè)不同的Z.rouxi基因組片斷。兩個(gè)基因組片斷中都含有與釀酒酵母的TKL1編碼基因具有高同源性的ORF。兩個(gè)ORF被命名為Z.Rouxii的TKL1和TKL2。
基因組克隆的序列分析提示(兩個(gè)TKL基因的下游280bp)另一個(gè)長(zhǎng)度為483bp的ORF，其編碼一條160個(gè)氨基酸殘基的多肽。這兩個(gè)ORF的同一性是94％(一個(gè)來(lái)自一個(gè)基因組克??；分別命名為PPPase 1(SEQ IDNO38)(它來(lái)自Z.rouxii的TKL1下游)和PPPase2(SEQ ID NO40)(它來(lái)自Z.rouxii的TKL2下游))。利用由Z.rouxii的PPPase 1(SEQ IDNO39)和PPPase2(SEQ ID NO41)編碼的氨基酸序列為模板，進(jìn)行Blast檢索(Altschul，S.F等，http//www.ncbi，nlm，nih.goviblast/(1997))，得到幾個(gè)來(lái)自其它物種(包括酵母)的同源物(表14)。所有這些同源氨基酸序列的特征是1)由這些同源基因編碼的蛋白質(zhì)屬于蛋白質(zhì)-酪氨酸磷酸酶(EC 3.1.3.48)和/或酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)蛋白質(zhì)家族，2)由此基因編碼的蛋白質(zhì)的大小約為17-20kDa，以及3)由此基因編碼的蛋白質(zhì)與低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶具有共同的活性位點(diǎn)基序CXXXXXR(C＝半胱氨酸，X＝任何氨基酸，R＝精氨酸)，位于該蛋白質(zhì)的氨基末端。表14.其它酵母中Z.Rouxii的PPPase1和PPPase2的最同源對(duì)應(yīng)物1)與Z.rouxii PPPase 1的同一性。2)與Z.rouxii PPPase 2的同一性。
為了構(gòu)建具有釀酒酵母的LTP(低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶)編碼基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，以HindIII消化表達(dá)載體pMA91，并從瓊脂糖凝膠中分離出包含PGK1啟動(dòng)子和終止子的1.8kb片斷。將啟動(dòng)子-終止子盒連接到Y(jié)Eplac195載體中(此載體已在它的多克隆位點(diǎn)處被HindIII進(jìn)行了線性化)，得到質(zhì)粒B1181。表達(dá)載體中的啟動(dòng)子-終止子片斷的方向是HindIII-PGK1啟動(dòng)子-PGK1終止子EcoRI。利用寡核苷酸對(duì)oScLTP5(SEQID NO28)和oScLTP3(SEQ ID NO29)為引物通過(guò)PCR從H475(附錄I，表32)的基因組DNA中擴(kuò)增釀酒酵母(YPR073C)的LTP1編碼基因。PCR反應(yīng)是30個(gè)循環(huán)，95℃下45sec，45℃下45sec和72℃下2min，并72℃下最終延伸10min。利用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，德國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后以BglII進(jìn)行消化(在PCR合成中引入該片段的位點(diǎn))，并將其連接到B1181的BglII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1449(附圖18)。將這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母的TKL1，2缺陷型菌株(H1741)中，該菌株具有整合到基因組中的來(lái)自T.reesei的XDH編碼基因(參見(jiàn)實(shí)施例12)。含有B1449質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化體被命名為H2422。為獲得一個(gè)對(duì)照菌株，將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒B1181轉(zhuǎn)化到H1741中，所得的菌株命名為H2421。
利用表達(dá)載體B1181構(gòu)建具有Z.rouxi的PPPase2編碼基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。PCR片斷是利用包含PPPase2基因的Z.rouxi基因組片斷為模板，寡核苷酸對(duì)oZrPPPase5(SEQ ID NO30)和oZrPPPase3(SEQ ID NO31)為引物制備的。PCR反應(yīng)后(30個(gè)循環(huán)，95℃下45sec，45℃下45sec，72℃下2min，72℃下最終延伸10min)，利用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，德國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后以BamHI進(jìn)行消化(在PCR合成中引入該片段的位點(diǎn))，并將其連接到B1181的BglII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1450。將這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母的TKL1，2缺陷型菌(H1741)中，該菌株含有整合到基因組中的來(lái)自T.reesei的XDH編碼基因(參見(jiàn)實(shí)施例12)。含有B1450質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化株被命名為H2424。
實(shí)施例17
過(guò)表達(dá)編碼磷酸酶DOG1和LTP1的基因提高
釀酒酵母菌株中戊糖和戊糖醇的產(chǎn)量a)在過(guò)表達(dá)編碼磷酸酶的DOG1基因的TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的產(chǎn)量增加
將編碼2-脫氧葡萄糖-6-磷酸酶的釀酒酵母的DOG1基因在具有整合到基因組中的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因TKL1，2缺陷型菌株(H1506，表32)中進(jìn)行過(guò)表達(dá)。將包含了DOG1編碼基因的多拷貝載體(B1020，參見(jiàn)實(shí)施例16)轉(zhuǎn)化到上面提到的菌株和宿主菌株H1104中，分別得到菌株H1520和H1514。另外，將空載體YEplac 195轉(zhuǎn)化到該菌株中得到對(duì)照菌株H1524。也將B1020轉(zhuǎn)化到H1741中，H1741是具有整合到基因組中的T.reese s的XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株，得到菌株H2425。
利用20mM的底物濃度測(cè)定DOG1對(duì)木酮糖-5-P，核酮糖-5-P，核糖-5-P和2-脫氧葡萄糖-6-P的特異性。除使用50mM咪唑-HCl，10mM MgCl2緩沖液，pH6.0外，按照實(shí)施例15的描述制備酵母細(xì)胞提取物。將10μl提取物和210μl底物(20mM)在同種緩沖液中30℃孵育30分鐘。利用終濃度2％的TCA終止反應(yīng)，并以鉬酸銨(15mM)，醋酸鋅(100mM)，pH5.0為試劑，測(cè)定釋放出來(lái)的磷酸鹽。在350nm下測(cè)定形成的鉬藍(lán)，并利用磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行定量(Sanz，P.等，Yeast 101195-1202(1994)；Bencini，D.A.等，Anal.Biochem.132254-258(1983))。結(jié)果如表15所示。表15.含有位于多拷貝質(zhì)粒(H1514)上的DOG1編碼基因的宿主菌株的酵母細(xì)胞提取物中DOG1的特異性，顯示的活性是以2-脫氧葡萄糖-6-P為100％的相對(duì)活性值。1)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的底物濃度。2)未測(cè)定3)Randez-Gil，F(xiàn).等，Yeast 111233-1240(1995)
預(yù)培養(yǎng)物在用于質(zhì)粒篩選的缺少尿嘧啶的SCD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，收集細(xì)胞，水洗一次，并重懸浮于同種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中使OD600約為0.2。細(xì)胞的培養(yǎng)是在250rpm的搖床上，30℃下進(jìn)行。在培養(yǎng)期間，在指定的時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定OD600，并通過(guò)離心去除細(xì)胞。利用HPLC分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇和戊糖。HPLC分析的進(jìn)行利用了配有折光率探測(cè)器(Waters 410差示折光計(jì))的Waters 510 HPLC泵，Waters 712 WISP和Water SystemInterfase Module液相色譜儀。所用Shodex-Pb柱(Shodex SP0810，ShowaDenko K.K.，Tokyo，日本；80℃，流速0.6ml/min，水作為洗脫液)導(dǎo)致核糖和木糖醇的共洗脫，另外對(duì)木糖醇進(jìn)行定量。結(jié)果如表16所示。表16.由包含整合的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因和位于多拷貝質(zhì)粒上的DOG1編碼基因的釀酒酵母TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇和戊糖(g/g細(xì)胞干重)。1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。2)核糖醇+核糖+木糖醇g/g細(xì)胞干重3)核糖醇或(核糖+木糖醇)g/g細(xì)胞干重
多元醇和戊糖的產(chǎn)量與在培養(yǎng)過(guò)程中消耗的葡萄糖相關(guān)。結(jié)果如表17所示。表17.消耗單位葡萄糖(g/l)產(chǎn)生的多元醇和戊糖(核糖醇，木糖醇，核糖；g/l)。而且顯示單位細(xì)胞干重消耗的葡萄糖。1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。2)消耗單位葡萄糖(g/l)產(chǎn)生的多元醇和戊糖(核糖醇，木糖醇，核糖；g/l)，以％表示。3)每細(xì)胞干重(g/l)消耗的葡萄糖(g/l)4)同對(duì)照菌株H1524相比較增加的％
利用TKL1，2缺陷型菌株(含有整合到基因組中的T.Reesei的XDH編碼基因和多拷貝質(zhì)粒攜帶的DOG1編碼基因H2425)還研究了多元醇和戊糖的產(chǎn)生(對(duì)于培養(yǎng)條件和分析方法的詳細(xì)描述；HPLC和酶實(shí)驗(yàn)參見(jiàn)下一段有關(guān)釀酒酵母的LTP1編碼基因的實(shí)施例)。結(jié)果如表18所示。表18.含有整合的T.reesei XDH編碼基因和過(guò)表達(dá)多拷貝質(zhì)粒上的DOG1編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的戊糖醇和戊糖
1)利用酶檢測(cè)測(cè)定核糖醇，木酮糖，核酮糖或核糖醇+木酮糖+核酮糖的總量(g/g細(xì)胞干重)
2)利用HPLC測(cè)定總的核糖醇，核糖和核酮糖(g/g細(xì)胞干重)
本實(shí)施例表明從多拷貝質(zhì)粒表達(dá)的DOG1磷酸酶使TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的產(chǎn)量增加1.5-4倍(參見(jiàn)表16)。表18中的結(jié)果表明木酮糖和核酮糖的產(chǎn)量也增加2-3倍。葡萄糖向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化顯著增強(qiáng)(參見(jiàn)表17)，也就是從葡萄糖出發(fā)所得產(chǎn)物的產(chǎn)量增加，證明進(jìn)入PPP的碳流增加。b)在過(guò)表達(dá)編碼磷酸酶的LTP1基因的TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的產(chǎn)量的增加。
利用載有低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶(LTP1，參見(jiàn)實(shí)施例16)的多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有整合到基因組中的T.reese的XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株(H1741)，得到菌株H2422，并以缺少LTP1編碼基因的對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到菌株H2421(參見(jiàn)實(shí)施例16)。菌株是在缺少尿嘧啶的SCD培養(yǎng)基上從單菌落培養(yǎng)的。在30℃培養(yǎng)42小時(shí)后，離心去除細(xì)胞，收集培養(yǎng)基上清液。通過(guò)HPLC(參見(jiàn)下文)或者通過(guò)使用COBAS Mira自動(dòng)分析儀(Roche)的酶檢驗(yàn)分析上清液中的戊糖和戊糖醇。
核糖醇和木糖醇的測(cè)定按照實(shí)施例15部分“C”中的描述進(jìn)行。在37℃孵育20分鐘過(guò)程中取樣，對(duì)樣品中的核酮糖的測(cè)定是通過(guò)分析反應(yīng)中核糖醇脫氫酶(0.07U/ml)引起的NADH減少來(lái)進(jìn)行的，所述反應(yīng)中含有100mM KH2PO4，pH7.0和0.2mM NADH。測(cè)定木酮糖和核酮糖的合并量的方法同測(cè)定核酮糖的量的方法相似，只不過(guò)在此反應(yīng)中還使用了山梨糖醇脫氫酶(0.2U/ml)。從木酮糖和核酮糖的合并量中減去核酮糖的量就獲得木酮糖的量。根據(jù)以前描述的實(shí)驗(yàn)方案(Bergmeyer，1974)，從肺炎克雷伯氏菌(E-87293，VTT菌株保藏)純化出應(yīng)用于酶檢測(cè)的核糖醇脫氫酶。
HPLC分析的進(jìn)行利用了配有折光率探測(cè)器(Waters 410差示折光計(jì))的Waters 510 HPLC泵，Waters 712 WISP和Water System Interfase Module液相色譜儀。在55℃下以水中的5mM H2SO4對(duì)所用的Aminex HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)進(jìn)行平衡，并用水中的5m H2SO4以0.3ml/min流速洗脫樣品。利用Sigma化學(xué)品公司的干燥晶體糖制備標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果如表19-21所示。表19利用酶檢測(cè)法測(cè)定的由過(guò)表達(dá)LPT1編碼基因的菌株產(chǎn)生的核糖醇，木糖醇，核酮糖以及木酮糖(g/g細(xì)胞干重)。1)n.d.-可信檢測(cè)限以下表20.利用酶檢測(cè)法測(cè)定的由過(guò)表達(dá)LTP1編碼基因的菌株產(chǎn)生的不同戊糖醇和戊糖的比率(％)。1)n.d.-可信檢測(cè)限以下表21.利用HPLC測(cè)定的由過(guò)表達(dá)LPT1編碼基因的菌株產(chǎn)生的核糖醇，核酮糖，木酮糖以及核糖(g/g細(xì)胞干重)。1)n.d.-可信檢測(cè)限以下
表19-21的結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)LTP1編碼基因的菌株(H2422)比LTP1編碼基因不過(guò)表達(dá)的菌株(H1741和H2421)產(chǎn)生更多的木酮糖(分別2.5倍和2.5倍)和核酮糖(分別2.2倍和2.7倍)。H2422也產(chǎn)生木糖醇(14mg/g細(xì)胞干重)，這一點(diǎn)與H1741和H2421不同，在本具體實(shí)驗(yàn)中它們不產(chǎn)生木糖醇。本實(shí)驗(yàn)中，與H1741和H2421菌株相比，菌株H2422產(chǎn)生的戊糖和戊糖醇(核糖醇，木糖醇，木酮糖和核酮糖)總量提高了80-100％。
在H2422菌株中，不同戊糖和戊糖醇的比率也發(fā)生變化(表20)與H1741(44％)和H2421(32％)菌株相比，它產(chǎn)生更多的核酮糖(54％)。所觀察到的“木酮糖+木糖醇”的情況是相同的H2422產(chǎn)生的“木酮糖+木糖醇”占戊糖和戊糖醇總量的20％，而H1741和H2421只分別產(chǎn)生了戊糖和戊糖醇總量10％和9％的“木酮糖+木糖醇”。與其它的戊糖和戊糖醇不同，H2422產(chǎn)生的核糖醇(26％)的量比H1741(46％)和H2421(59％)菌株所產(chǎn)生的量減少。
對(duì)培養(yǎng)42h時(shí)消耗的葡萄糖進(jìn)行了測(cè)定并證實(shí)流λPPP途徑的葡萄糖增加。對(duì)照菌株H2421將1.0％消耗的葡萄糖轉(zhuǎn)化成戊糖醇和戊糖，但是在LTP1編碼基因過(guò)表達(dá)的菌株(H2422)中，轉(zhuǎn)變了1.7％消耗的葡萄糖，證明提高了70％。
本實(shí)施例表明在含有整合的T.Reesei的XDH編碼基因的釀酒酵母TKL1，2缺陷型菌株中，過(guò)表達(dá)LTP1編碼基因提高了戊糖醇和戊糖的產(chǎn)量，倍數(shù)為1.6-1.8。而且，戊糖醇和戊糖的比率發(fā)生變化而有利于木酮糖(木糖醇)和核酮糖的產(chǎn)生。由于進(jìn)入PPP途徑的碳流增加，葡萄糖向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變?cè)鰪?qiáng)了70％。
實(shí)施例18
釀酒酵母菌株和菌株構(gòu)建體用于研究減少的糖酵解活性
從Dr.Eckard Boles(Düsseldorf，德國(guó))獲得釀酒酵母的兩個(gè)不同菌株，它們中的葡糖磷酸異構(gòu)酶編碼基因(PGI1)被破壞，將它們重命名為H1053[EBY22，Boles，E.，等，Eur.J.Biochem.217469-477(1993)]和H1054[EBY44，Boles，E.，等，Mol.Gen.Genet.243363-368(1994)]。
為了構(gòu)建具有較低活性的葡糖磷酸異構(gòu)酶的釀酒酵母菌株，從Dr.Eckard Boles[Rose，M.，等，Eur.J.Biochem.199511-518(1991)]獲得用于產(chǎn)生部分PGIl啟動(dòng)子缺失的質(zhì)粒。利用部分啟動(dòng)子缺失的已經(jīng)被HpaI線性化的質(zhì)粒pBR4和pBR5，轉(zhuǎn)化PGIl缺陷型菌株H1054。篩選亮氨酸原養(yǎng)型。所得的菌株分別命名為H1768和H1770。
從Dr.Susanne Müller(Darmstadt，德國(guó))獲得編碼6-磷酸果糖-L-激酶(PFK26和PFK27)的基因出現(xiàn)缺陷的菌株，并重命名為H1347。利用包含樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的酵母多拷貝載體pAOS64(參見(jiàn)實(shí)施例12)轉(zhuǎn)化此菌株并將所得的菌株命名為H1759。
將菌株H1055(TKL1，2缺陷型菌株)和H1053(PGI1缺陷型菌株)混合為一批用于在YPF平板上接合。兩天以后檢測(cè)此批中的接合子。在YPF和SCD-tyr-phe平板上對(duì)這批培養(yǎng)中的單菌落進(jìn)行劃線接種。將來(lái)自每一類型平板的24個(gè)大的菌落分別轉(zhuǎn)移至平板上劃線接種。利用對(duì)照菌株H5和H6進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，證實(shí)所有48個(gè)菌落都是雙倍體(附錄I，表32)。再將4個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到極限培養(yǎng)基平板上進(jìn)行單克隆劃線接種[YNB(酵母氮源基質(zhì)6.7g/l；Merck，德國(guó))+2％葡萄糖]。將四個(gè)平板上的一個(gè)單克隆作為一批，在孢子形成前平板(5％葡萄糖)上劃線接種培養(yǎng)兩天。再將此批培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到孢子形成平板(減少了C-和N-源)上以便在饑餓條件下刺激孢子形成。9天后檢測(cè)平板上四分體的形成。挑選出具有40-50％四分體的兩批克隆用于隨機(jī)的孢子分離。蝸牛酶gluculase以1比10用水進(jìn)行稀釋，將來(lái)自孢子形成平板的相當(dāng)于一半火柴頭大小的酵母懸浮物與200 l酶稀釋溶液混合。將混合物在搖床上溫育2小時(shí)。加入1ml水并劇烈渦旋混合物。將稀釋液-3，-4和-5在YPF上鋪平板培養(yǎng)3天。挑出440個(gè)菌落在SC+2％果糖+0.05％葡萄糖的平板上劃線接種培養(yǎng)2天。將接種的劃線在YPD(PGI1缺陷型突變株不生長(zhǎng))和SC+2％果糖+0.05％葡萄糖-tyr-phe(TKL1，2缺陷型突變株不生長(zhǎng))的平板上進(jìn)行復(fù)制。
獲得4個(gè)陽(yáng)性候選菌落(在YPD和SC+2％果糖+0.1％葡萄糖-tyr-phe上都不生長(zhǎng))。通過(guò)DNA印跡檢測(cè)候選菌落是否保持了PGI1和TKL1，2的破壞。以BglII(TKL1)，ClaI(TKL2)或BglI(PGI1)消化染色體DNA，所用的探針來(lái)自PGI1基因(+100到+1640核苷酸)，TKL1基因(+115到+1060)和TKL2基因(+810到+1870)。利用PCR制備探針，以毛地黃毒苷標(biāo)記的dNTP混合物(Boehringer Mannheim，德國(guó))對(duì)其標(biāo)記，利用QIAquick柱進(jìn)行純化。同親本菌種比較印跡表明圖式?jīng)]有變化。在4個(gè)菌落中，挑選編號(hào)I的菌落用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)并命名為H1451。
為了將樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因引入上文提到的菌種H1451，將質(zhì)粒pAOS67利用SalI酶消化，用Klenow酶處理，然后再利用蝦堿性磷酸酶處理。利用SalI和SpeI從pFA6-kanMX2質(zhì)粒[Wach，A.，等，Yeast101793-1808(1994)]中釋放出kanMX2片斷，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行純化并通過(guò)酚-液氮法從凝膠中將片斷抽提出來(lái)。以Klenow酶處理純化的片斷以產(chǎn)生平末端。將kanMX2片斷克隆到pAOS67 SalI位點(diǎn)。具有遺傳霉素(genenticin)抗性基因的質(zhì)粒pAOS67被命名為B1003(附圖19)，并將其引入TKL1，2；PGI1缺陷型菌株H1451中得到菌株H1453。
實(shí)施例19
在缺少PGI1和/或TKL1，2活性的釀酒酵母菌株中
葡萄糖向戊糖醇的轉(zhuǎn)變?cè)鰪?qiáng)
將包含樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因和卡那霉素抗性標(biāo)記基因(pAOS67+kanr，附圖19)的多拷貝質(zhì)粒B1003轉(zhuǎn)化到TKL1，2；PGI1缺陷型菌株H1451中得到菌株H1453(附錄I，表32)。所得的菌株和各種對(duì)照菌株在含有2％果糖和0.15％葡萄糖的人工完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中的指定時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定OD600以監(jiān)測(cè)菌株的生長(zhǎng)，離心去除細(xì)胞，利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒檢測(cè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇(木糖醇和部分核糖醇；參見(jiàn)實(shí)施例14)，并利用BoehringerMannheim GOD-Perid試劑盒檢測(cè)樣品中的葡萄糖。結(jié)果如表22所示。表22.由含有位于多拷貝質(zhì)粒上的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的TKL，PGI1缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇。1)產(chǎn)生的多元醇以mg/g細(xì)胞干重計(jì)算2)產(chǎn)生的多元醇以mg/g消耗的葡萄糖計(jì)算3)未測(cè)定4)轉(zhuǎn)化成多元醇的葡萄糖所占的分?jǐn)?shù)以％表示
以上結(jié)果顯示含有XDH編碼基因的TKL1，2；PGl1缺陷型菌株中，每g葡萄糖產(chǎn)生約0.2g多元醇，這比含有XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株的葡萄糖向多元醇的轉(zhuǎn)化高3-6倍。這個(gè)具體的菌株生長(zhǎng)緩慢，所以它產(chǎn)生多元醇的速率也慢。本實(shí)施例表明糖酵解(PGI1缺陷)和戊糖磷酸途徑(TKL1，2缺陷)同時(shí)受阻斷使得釀酒酵母中葡萄糖向多元醇的轉(zhuǎn)化增強(qiáng)。
實(shí)施例20
在釀酒酵母中糖酵解的部分阻斷使碳流(葡萄糖)轉(zhuǎn)向
戊糖磷酸途徑a)減少葡糖磷酸異構(gòu)酶的活性引起多元醇產(chǎn)量的增加
從Dr.Eckard Boles(Düsseldorf，德國(guó))獲得了一系列質(zhì)粒，它們包含葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI1)編碼基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)和不同長(zhǎng)度的這個(gè)基因的啟動(dòng)子。利用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化PGI1缺陷型酵母菌株所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株具有不同的PGI1活性[Rose，M.，等，Eur.J.Biochern.199511-518(1991)]。利用由Rose等構(gòu)建的PGI1-啟動(dòng)子缺失。在著絲粒質(zhì)粒上具有連續(xù)的啟動(dòng)子缺失的八個(gè)不同質(zhì)粒，以PstI和DraI進(jìn)行消化。將載有PGI1基因和不同大小的啟動(dòng)子的片斷，亞克隆到整合型質(zhì)粒YIplac128(Gietz和Sugino，Gene 74527-534(1988))中。利用HpaI對(duì)得到的質(zhì)粒pRB1到pRB8進(jìn)行線性化，將分別它們轉(zhuǎn)化到菌株H1054并測(cè)定葡糖磷酸異構(gòu)酶的比活性。(E.Boles，個(gè)人交流)。假定具有全部PGI1活性的10％能夠維持在葡萄糖上的生長(zhǎng)，挑選出給出8％(pRB4)和5％(pRB5)PGI1活性的兩個(gè)質(zhì)粒，用于構(gòu)建PGI1活性減少的酵母菌株。將質(zhì)粒pRB4和pRB5引入PGI1缺陷型菌株H1054，分別得到菌株H1768和H1770(附錄I，表32)。利用含有樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的多拷貝質(zhì)粒pAOS67(附圖12)對(duì)這兩個(gè)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分別得到菌株H1772和H1774。這些菌株在含有2％果糖和0.05％葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，作為對(duì)照含有多拷貝質(zhì)粒pAOS67的完全PGI1缺陷型菌株(H1117)也包括在培養(yǎng)的菌株之中。在指定的時(shí)間點(diǎn)取樣，通過(guò)測(cè)定OD600監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)情況。離心去除細(xì)胞并通過(guò)D-山梨糖醇/木糖醇Boehringer Mannheim試劑盒分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇(木糖醇和部分核糖醇；參見(jiàn)實(shí)施例14)。結(jié)果如表23所示。表23.由含有位于多拷貝質(zhì)粒上的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的、PGI1活性減少的釀酒酵母產(chǎn)生的多元醇。
1)利用Boehringer Manneheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒測(cè)定木糖醇+部分核糖醇(mg/g細(xì)
胞干重)
2)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行
本實(shí)施例表明PGI1活性減少的酵母菌株同完全缺失PGI1活性的菌株相比較，多元醇的產(chǎn)量增加約2倍。b)利用缺失6-磷酸果糖-2激酶活性的釀酒酵母生產(chǎn)多元醇
已知證明果糖-2，6-二磷酸(F2，6P)是6-果糖磷酸激酶的一種有效的激活劑，同時(shí)是果糖-1，6-二磷酸-1磷酸水解酶的強(qiáng)抑制劑，因此它是糖酵解途徑的重要調(diào)節(jié)因子。在釀酒酵母中F2，6P由兩種6-磷酸果糖-2-激酶編碼基因PFK26和PFK2合成。具體來(lái)說(shuō)，F(xiàn)2，6P對(duì)于快速消耗糖是必需的[Boles，E.，等，Mol.Microbiology 2065-76(1996)]。我們的興趣是研究如果缺失這兩個(gè)基因是否會(huì)由于糖酵解中的碳流減少引起的進(jìn)入PPP的葡萄糖增加而造成多元醇的產(chǎn)量增加。
利用一個(gè)多拷貝載體轉(zhuǎn)化PFK26，PFK27缺陷型菌株，此載體含有位于多拷貝載體(pAOS64)上的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因。將細(xì)胞在具有20g/l葡萄糖的人工完全培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并且省去了尿嘧啶用于質(zhì)粒篩選。通過(guò)測(cè)定OD600監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)，利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒分析培養(yǎng)基樣品中的產(chǎn)生的多元醇。結(jié)果如表24所示。表24.由含有位于多拷貝質(zhì)粒上的樹(shù)干畢赤酵母XDH編碼基因的PFK26，PFK27缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇(部分核糖醇+木糖醇)(mg/g細(xì)胞干重)
1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。
本實(shí)施例表明多元醇能夠在PFK26，27缺陷型菌株中產(chǎn)生，并且過(guò)表達(dá)樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因能夠提高多元醇的產(chǎn)量2-3倍。c)減少甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性引起多元醇的產(chǎn)量和流向戊糖磷酸途徑的碳流增加
已知增加醋酸碘(IA)的量能夠逐漸抑制甘油醛-3-磷酸脫氫酶，因此導(dǎo)致流入糖酵解途徑下部分的葡萄糖減少。在25M IA(Fluka Chemie AG，Switzerland)存在時(shí)培養(yǎng)攜帶多拷貝質(zhì)粒PAOS67的TKL1，2缺陷型菌株H1055(H1057)，其中所述攜帶的多拷貝質(zhì)粒pAOS67含有樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因。生長(zhǎng)培養(yǎng)基是用于質(zhì)粒篩選的不含組氨酸的SCD和7.65g/lKNO3。在指定的時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定OD600，離心去除細(xì)胞，利用BoehringerMannheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒檢測(cè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇，并利用Boehringer Mannheim GOD-Perid試劑盒檢測(cè)樣品中的葡萄糖。結(jié)果如表25所示。表25.在醋酸碘存在的條件下由含有位于多拷貝質(zhì)粒上的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇在醋酸碘存在時(shí)，可以觀察到多元醇的產(chǎn)量增加了大約30％，使得1.2％消耗的葡萄糖代謝為多元醇(木糖醇+部分核糖醇)。本實(shí)施例表明由醋酸碘引起的甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性的減少，導(dǎo)致戊糖醇產(chǎn)量和流向戊糖磷酸途徑的葡萄糖增加。
實(shí)施例21
構(gòu)建具有改變的氧化還原平衡的釀酒酵母菌株
編碼NAD依賴性谷氨酸脫氫酶的基因作為一個(gè)SstI-XbaI片斷，從質(zhì)粒YEpMSP3-T[Boles，E.，等，Eur.J.Biochem.217469-477(1993)]被克隆到Y(jié)Eplac195多拷貝質(zhì)粒上[Gietz，R.D.和Sugino，A.，Gene74527-534(1988)]，得到質(zhì)粒B1007。將質(zhì)粒B1007分別轉(zhuǎn)化到含有樹(shù)干畢赤酵母和T.reesei XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株(分別為H1506和H1741)中，分別得到菌株H1499和H1743。
采用另一種方法(參見(jiàn)實(shí)施例18)構(gòu)建PGI1；TKL1，2缺陷型菌株(它含有整合在基因組中的T.reesei的XDH編碼基因)，以便獲得有用的選擇標(biāo)記用于在質(zhì)粒上表達(dá)其它基因。通過(guò)將釀酒酵母的HIS3基因整合進(jìn)PGI1編碼基因來(lái)破壞此基因。利用寡核苷酸對(duì)oPGI11(SEQ ID NO32)和oPGI12(SEQ ID NO33)，通過(guò)PCR對(duì)PGI1基因進(jìn)行擴(kuò)增，并克隆到Blaesuipt SK(-)載體的SalI-PstI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1186。HIS3基因作為一個(gè)DrdI片斷從載體pRS423被克隆到Bluescript SK(-)的EcoRV位點(diǎn)，得到質(zhì)粒B1185。利用EcoRI和BstBI對(duì)含有PGI1的載體B1186進(jìn)行消化，這樣從PGI1開(kāi)放閱讀框去除一個(gè)700bp片斷，并利用來(lái)自HIS3-Bluescript SK(-)載體B1185的作為EcoRI-ClaI片斷的HIS3基因替代這個(gè)片斷，得到質(zhì)粒B1187(附圖20)。利用SalI-MunI消化從B1187中釋放出PGI1-HIS3-PGI1片斷，從瓊脂糖凝膠中提純，并將它轉(zhuǎn)化到含有整合在基因組中的T.reesei XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株(H1741)中。轉(zhuǎn)化體中的正確整合通過(guò)PCR，Southern印跡，具有在不含組氨酸的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力和不能在葡萄糖上生長(zhǎng)的能力進(jìn)行證實(shí)。獲得的菌株被命名為H1857。將上述包含GDH2編碼基因的質(zhì)粒(B1007)轉(zhuǎn)化到H1857菌株中，得到菌株H1915。為了獲得對(duì)照菌株，將載體YEplac195轉(zhuǎn)化到菌株H1857中，得到菌株H1916。
將包含受PGK1啟動(dòng)子調(diào)控的樹(shù)干畢赤酵母的XR編碼基因和受修飾的ADH1啟動(dòng)子調(diào)控的樹(shù)干畢赤酵母的XDH編碼基因的酵母表達(dá)載體pAOS66(附圖14)，轉(zhuǎn)化到PGI1缺陷型菌株H1053中，得到菌株H1115。
為了破壞胞質(zhì)NADP依賴性異檸檬酸脫氫酶編碼基因(IDP2)[Loftus，T.M.，等，Biochemistry 339661-9667(1994)；Sazanov，L.A.和Jackson，J.B.，F(xiàn)EBS Letters 344109-116(1994)]，利用PCR構(gòu)建一個(gè)破壞盒；菌株H1346的基因組DNA作為模板DNA。寡核苷酸對(duì)是oIDP21(SEQ ID NO34)和oIDP22(SEQ ID NO35)被用于5′末端，寡核苷酸對(duì)oIDP23(SEQID NO36)和oIDP24(SEQ ID NO37)被用于3′末端。擴(kuò)增的5′末端片段長(zhǎng)為415bp。以SalI和HindIII消化5′末端片斷，以HindIII和PstI消化3′末端片斷(注意，3′末端片斷包含一個(gè)非特異性HindIII星號(hào)活性位點(diǎn)，所得到3′片斷只有158bp) 以及利用SalI和PstI消化pBluescript SK(-)載體。在一步反應(yīng)中將這三種組分連接在一起，得到質(zhì)粒約為3.8kbp(B1009)。通過(guò)HindIII消化，將URA3基因以一個(gè)1170bp片斷從質(zhì)粒B713[Toikkanen，J.，等，Yeast 12425-438(1996)]中釋放出來(lái)，從瓊脂糖凝膠中純化，并連接到質(zhì)粒B1009的HindIII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒1011(附圖21)。通過(guò)SalI和NotI消化，從質(zhì)粒B1011中釋放出IDP2破壞的片斷。將這個(gè)片斷轉(zhuǎn)化到PGI1缺陷型菌株H1053中得到菌株H1576.
實(shí)施例22
在具有改變的細(xì)胞氧化還原平衡的釀酒酵母菌株中
增加由葡萄糖產(chǎn)生的戊糖醇和戊糖的產(chǎn)量a)在過(guò)表達(dá)NAD依賴性谷氨酸脫氫酶編碼基因的釀酒酵母TKL1，2缺陷型菌株中多元醇的產(chǎn)量增加
將NAD依賴性谷氨酸脫氫酶編碼基因在含有整合到基因組中的樹(shù)干畢赤酵母或T.reesei的XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株中進(jìn)行過(guò)表達(dá)。將含有GDH2編碼基因(參見(jiàn)實(shí)施例21)的質(zhì)粒B1007轉(zhuǎn)化到酵母菌株H1506和H1741中，分別得到菌株H1499和H1743(附錄I，表32)。在含有20g/l葡萄糖的人工完全培養(yǎng)基(不含尿嘧啶，適當(dāng)條件下用于質(zhì)粒篩選)上培養(yǎng)這些菌株。在指定的時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定OD600，離心去除細(xì)胞，利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇試劑盒并向該檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中加入核糖醇脫氫酶檢測(cè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品中的多元醇。結(jié)果如表26所示。表26.由包含整合的樹(shù)干畢赤酵母(P.s)或T.reesei(T.r)的XDH編碼基因以及位于多拷貝質(zhì)粒上的GDH2編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇(核糖醇+木糖醇)(g/g干重)。
1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的取樣在以小時(shí)計(jì)算的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行
2)未測(cè)定
本實(shí)施例表明GDH2編碼基因的過(guò)表達(dá)使在含有XDH編碼基因的釀酒酵母TKL1，2缺陷型菌株中產(chǎn)生的多元醇(核糖醇+木糖醇)的量提高50-80％。b)在過(guò)表達(dá)NAD依賴性谷氨酸脫氫酶編碼基因的釀酒酵母PGI1；TKL1，2缺陷型菌株中多元醇的產(chǎn)量增加
NAD依賴性谷氨酸脫氫酶(GDH2)編碼基因在H1857中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，H1857是葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI1)和轉(zhuǎn)酮酶(TKL1，2)缺陷型菌株，它還包含整合到基因組中的T.Reesei的XDH編碼基因。利用攜帶GDH2編碼基因的質(zhì)粒B1007(參見(jiàn)實(shí)施例21)以及利用空質(zhì)粒YEplac195轉(zhuǎn)化H1857，分別得到菌株H1915和H1916。
對(duì)菌株H1915和H1916進(jìn)行培養(yǎng)使其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集細(xì)胞并懸浮于不含組氨酸和尿嘧啶的人工完全培養(yǎng)基中，使平均密度為20的OD600的。加入葡萄糖使其終濃度為20g/l并立即取樣。細(xì)胞在30℃的搖床(250rpm)上培養(yǎng)2.5h，然后取第一個(gè)樣品。再加入H2O2使其濃度約為0.5mM，再繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)1.5h，此時(shí)取第二個(gè)樣品。測(cè)定OD600，離心去除細(xì)胞，利用HPLC分析生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品(Waters device，Aminex HPX-87H離子排阻柱，參見(jiàn)實(shí)施例17)。結(jié)果如表27所示。表27.由含有整合的T.reesei XDH編碼基因和位于多拷貝質(zhì)粒上的GDH2編碼基因的PGI1；TKL1，2缺陷型菌株產(chǎn)生的多元醇和戊糖。
1)多元醇+戊糖mg/g細(xì)胞干重
可以看到在過(guò)表達(dá)GDH2編碼基因的菌株H1915中，PPP衍生的化合物(木酮糖/核酮糖/核糖/核糖醇)的產(chǎn)量增加2倍。兩種菌株中加入過(guò)氧化氫對(duì)多元醇和戊糖的總產(chǎn)量具有積極的作用；可以看到在具有和不具有GDH2編碼基因過(guò)表達(dá)的TKL1，2；PGI1缺陷型菌株中，都增加2倍。令人感興趣的是，H2O2特異性地使得只有過(guò)表達(dá)GDH2編碼基因的菌株能夠產(chǎn)生木酮糖。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，測(cè)定菌株消耗的葡萄糖，從消耗的葡萄糖產(chǎn)生的多元醇和戊糖的比率如表28所示。表28.消耗單位葡萄糖(g/l)產(chǎn)生的多元醇和戊糖(核糖醇，核酮糖，木酮糖；g/l)
1)與對(duì)照菌株H1916比較增加的產(chǎn)量的％。
本實(shí)施例說(shuō)明在釀酒酵母中氧化還原酶的過(guò)表達(dá)或者氧化還原平衡的改變引起流向戊糖磷酸途徑的碳流增強(qiáng)，這樣導(dǎo)致PGI1；TKL1，2缺陷型菌株中戊糖醇和戊糖的產(chǎn)量進(jìn)一步增加。還說(shuō)明從葡萄糖獲得的產(chǎn)物量增加，證明了進(jìn)入PPP的葡萄糖增加。c)在缺少NADP依賴性異檸檬酸脫氫酶活性的釀酒酵母菌株中進(jìn)入戊糖磷酸途徑的葡萄糖增加
胞質(zhì)NADP依賴性異檸檬酸脫氫酶(IDP2)催化異檸檬酸氧化脫羧得到酮戊二酸，并伴隨著NADP的還原。這樣此反應(yīng)與利用NADP的戊糖磷酸途徑氧化階段的酶(也位于細(xì)胞的胞質(zhì)中)競(jìng)爭(zhēng)同種輔因子NADP。因此，破壞編碼IDP2的基因可以提高進(jìn)入PPP的葡萄糖，因?yàn)樵诖耸軗p菌株中對(duì)胞質(zhì)中NADPH產(chǎn)生的需求可以僅由該途徑的酶來(lái)提供。
PGI1缺陷型菌株的生長(zhǎng)在高于0.2％葡萄糖的培養(yǎng)基中受到抑制。在突變菌株中過(guò)表達(dá)GDH2編碼基因，能夠使其恢復(fù)在接近宿主菌株所用的高水平的葡萄糖上生長(zhǎng)的能力。為了檢驗(yàn)我們的假設(shè)，我們將IDP2編碼基因從PGI1缺陷型菌株H1053(參見(jiàn)實(shí)施例21和表32)中破壞掉，并且研究其在含有2％果糖的不同濃度的葡萄糖上的生長(zhǎng)情況。結(jié)果如附圖22所示。
同PGI1缺陷型菌株相比，PGI1，IDP2缺陷型菌株能夠在0.25％葡萄糖中生長(zhǎng)到較高的細(xì)胞密度。另外，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間之后，可以看到PGI1，IDP2缺陷型菌株能夠在0.5％和1.0％葡萄糖濃度中生長(zhǎng)，而這兩種濃度對(duì)PGI1缺陷型菌株具有毒性。這些結(jié)果支持了這一假設(shè)，即當(dāng)缺失IDP2編碼基因后，流入PPP的葡萄糖增加。d)在過(guò)表達(dá)NAD(P)H依賴性木糖還原酶的釀酒酵母菌株中進(jìn)入戊糖磷酸途徑的葡萄糖增加
PGI1缺陷型菌株H1053(參見(jiàn)附錄1，表32)利用包含樹(shù)干畢赤酵母的木糖還原酶(XR)和XDH編碼基因的多拷貝質(zhì)粒pAOS66(附圖14)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到菌株H1115。
細(xì)胞的培養(yǎng)在不含亮氨酸，并補(bǔ)充20g/l果糖和0.5g/l葡萄糖的人工完全培養(yǎng)基中進(jìn)行。洗滌細(xì)胞并重新懸浮于100mM磷酸緩沖液pH5.0中，使OD600為130。加入總糖濃度為20g/l的D-葡萄糖和D-木糖混合物，利用商業(yè)化的酶試劑盒(Boehringer Mannheim)測(cè)定乙醇產(chǎn)量。結(jié)果如表29-30所示。表29.加入糖之后不同時(shí)間的乙醇濃度(mM)，其中2％的糖中包含不同比率的D-木糖和D-葡萄糖。在頂欄中給出葡萄糖的量。表30.根據(jù)D-葡萄糖D-木糖比率為0.2的最大速率標(biāo)化的乙醇產(chǎn)生速率。
與單獨(dú)使用純糖相比，使用兩種糖的混合物時(shí)，乙醇生產(chǎn)速率較高。當(dāng)只有葡萄糖或只有木糖存在時(shí)乙醇產(chǎn)量低。這可能是由于輔酶因子的損耗所致。D-葡萄糖通過(guò)戊糖磷酸途徑進(jìn)行代謝時(shí)，利用NADP；D-木糖轉(zhuǎn)化成木糖醇時(shí)，利用NADPH。NADP或NADPH的損耗限制了進(jìn)入戊糖磷酸途徑的碳流，即限制了乙醇生產(chǎn)速率。只有當(dāng)兩種糖同時(shí)代謝時(shí)，才能有效地再生這些輔因子；一個(gè)葡萄糖將兩個(gè)NADP轉(zhuǎn)化成兩個(gè)NADPH，后者然后被用于從D-木糖形成木糖醇。乙醇的生產(chǎn)速率反映出經(jīng)過(guò)戊糖磷酸途徑的碳流，因?yàn)檫@是唯一可能的路線。當(dāng)葡萄糖和木糖的混合物同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，能夠有效再生輔因子，可以觀察到最高的乙醇生產(chǎn)速率。當(dāng)葡萄糖分?jǐn)?shù)是1/3，即木糖對(duì)葡萄糖的比率是2時(shí)，乙醇生產(chǎn)速率最高。這一點(diǎn)反映了該輔因子再生的化學(xué)計(jì)量，即需要2當(dāng)量的木糖再生出用于1當(dāng)量葡萄糖的輔因子。
本實(shí)施例證明經(jīng)過(guò)戊糖磷酸途徑的葡萄糖發(fā)酵受到NADP再生系統(tǒng)如需要NADPH的木糖還原酶反應(yīng)的刺激。
根據(jù)對(duì)輔因子的需求，僅過(guò)表達(dá)XR編碼基因的菌株能夠產(chǎn)生相似的效果，增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)化成PPP衍生產(chǎn)物。
類似地，在TKL1，2缺陷型菌株或即使在非缺陷型菌株中，也能夠增強(qiáng)葡萄糖向多元醇和戊糖的轉(zhuǎn)變。因?yàn)樵诖送緩街心就?5-磷酸不能被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，所以包含如上所述的用于PGI1缺陷型菌株的異源XR和XDH編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株仍舊不能利用木糖為碳源。在宿主菌株中，木糖通過(guò)木糖還原酶被還原為木糖醇，該酶同時(shí)氧化NAD(P)H。木糖醇進(jìn)一步被氧化形成木酮糖并且木酮糖被磷酸化得到木酮糖-5P，一種戊糖磷酸途徑的中間物。
然而，木糖醇向木酮糖的轉(zhuǎn)變?cè)跓釀?dòng)力學(xué)上是不利的，通常情況在木糖培養(yǎng)物中木糖醇出現(xiàn)累積。XR編碼基因的表達(dá)引起對(duì)NADPH的需求增加，NADPH主要在戊糖磷酸途徑中產(chǎn)生。我們的假設(shè)是當(dāng)菌株是TKL1，2缺陷型菌株時(shí)，碳的唯一出口是作為酮或多元醇；這引起在過(guò)表達(dá)XR編碼基因的TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的產(chǎn)量增加。
以上描述的實(shí)施例還可以導(dǎo)致從木糖和葡萄糖同時(shí)生產(chǎn)出木糖醇。
實(shí)施例23
篩選增加多元醇和戊糖的產(chǎn)量的釀酒酵母突變株
將TKL1，2缺陷型菌株H1055和H1741(后者含有整合到基因組中的T.reesei的XDH編碼基因)(附錄I，表32)，在YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)上培養(yǎng)過(guò)夜。收獲細(xì)胞(離心3000rpm，5min)并懸浮在0.1M磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.0)中，密度為2×108細(xì)胞/ml。誘變的細(xì)胞總量是20ml中4.7×109個(gè)。將500μl的細(xì)胞取出來(lái)作為對(duì)照。將600μl的誘變劑(甲基磺酸乙酯(EMS)，Sigma)加入到細(xì)胞懸浮液中。在對(duì)照細(xì)胞中不加入誘變劑。細(xì)胞在30℃下攪拌(250rpm)孵育60min。然后收獲細(xì)胞，用20ml水洗一次，用5％硫代硫酸鈉(每次20ml)洗兩次，并重新懸浮于1ml的水中。將經(jīng)過(guò)誘變的細(xì)胞在包含2％半乳糖、0.1％木酮糖、0.6％木糖、酵母提取物和蛋白胨的平板上鋪平板(每種菌株鋪9個(gè)平板)。將對(duì)照和誘變細(xì)胞的稀釋溶液(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)在YPD平板上鋪平板用于生存力的檢驗(yàn)。誘變后的生存力約為60％。培養(yǎng)6天之后，菌株H1055和H1741分別在平板上生長(zhǎng)了20和13個(gè)菌落。再培養(yǎng)8天之后，在平板上生長(zhǎng)的菌落分別增加了40和21個(gè)。將菌落在含有3ml SCD培養(yǎng)基的試管中，30℃，250rpm培養(yǎng)4天。測(cè)定培養(yǎng)物的OD600，離心去除細(xì)胞并利用HPLC(HPX-87H柱，BioRad，分析條件55℃，流速0.3ml/min，洗脫液5mM H2SO4)分析培養(yǎng)物的上清液中產(chǎn)生的戊糖醇和戊糖。結(jié)果如表31所示。表31.菌株H1055和H1741以及木酮糖抗性突變菌產(chǎn)生的多元醇和戊糖(g/g細(xì)胞干重)。
1)總量；核酮糖，核糖醇，核糖和木酮糖g/g細(xì)胞干重。
2)同親本菌株H1055和H1741相比較，核酮糖，核糖醇，核糖產(chǎn)量增加的％比率。
3)同親本菌株H1055和H1741相比較，核酮糖，核糖醇，核糖和木酮糖產(chǎn)量增加的％比率。
所獲得的一些突變株明顯地產(chǎn)生更多的戊糖醇或戊糖。在本具體實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有檢測(cè)到親本菌株產(chǎn)生了木酮糖，但是幾個(gè)突變株除了產(chǎn)生增加量的核酮糖，核糖或核糖醇之外，也生產(chǎn)出木酮糖。在某些突變株中，比率從木酮糖，核糖和核糖醇向木酮糖移動(dòng)。本實(shí)施例表明經(jīng)典的誘變具有獲得能夠從葡萄糖產(chǎn)生增加的戊糖醇和戊糖的釀酒酵母菌株的潛力。
實(shí)施例24
利用表達(dá)木糖醇磷酸脫氫酶或核糖醇磷酸脫氫酶的重組微生物菌株
生產(chǎn)木糖醇或核糖醇
從干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)(Hausman，S.Z.和London，J.，J.Bacteriol.1691651-1655(1987))中純化出木糖醇5-磷酸脫氫酶和核糖醇磷酸脫氫酶。已知相似的酶也存在于某些其它的微生物中，如鳥(niǎo)鏈球菌(London，J.，F(xiàn)EMS Microbiol.Reviews 87103-112(1990))?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離出編碼這些酶的基因。這些基因在累積木酮糖5-磷酸和/或核酮糖5-磷酸的本發(fā)明宿主(如枯草芽孢桿菌菌株GX7或釀酒酵母H1055)中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的戊糖醇5-磷酸。累積的木糖醇5-磷酸或核糖醇5-磷酸最終被去磷酸化(例如，利用木糖醇-5-磷酸酶)并從細(xì)胞中分泌出來(lái)。木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸之間的快速平衡可以通過(guò)核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶的過(guò)表達(dá)相對(duì)容易地獲得。利用戊糖醇5-磷酸脫氫酶催化的反應(yīng)的平衡取決于宿主細(xì)胞中氧化還原的能力(NADH/NAD+比率)。在適當(dāng)條件下(高NADH/NAD+比)(已知存在于例如酵母細(xì)胞中)，平衡非常有力地向有利于戊糖醇磷酸的方向移動(dòng)。因此，對(duì)代謝流進(jìn)行較好地全面控制是可能的，意思是說(shuō)最終生產(chǎn)的一種產(chǎn)物(木糖醇或核糖醇)中只有最少量的副產(chǎn)物形成。
實(shí)施例25
克隆鼠李糖乳桿菌的木糖醇磷酸脫氫酶(XPDH)基因
主要利用Hausman和London(J.Bacteriol.169(4)1651-1655(1987))的方法從鼠李糖乳桿菌ATCC 15820中純化出XPDH。
對(duì)同源蛋白進(jìn)行N-末端序列分析得到如下序列MKASMLEDLNKFSVKEIDIPSPKKD[SEQ ID NO42]。還從XPDH胰蛋白酶的消化物中分離出幾個(gè)肽并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定出的序列如下EWTNSIQLVR[SEQ IDNO43]，F(xiàn)GGFEQYVSVPAR[SEQ ID NO44]，GLDEGCTHVINSAK[SEQ ID NO45]。
根據(jù)XPDH的部分氨基酸序列合成幾種簡(jiǎn)并寡核苷酸，并利用鼠李糖乳桿菌染色體DNA為模板在PCR中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。利用組合的兩種引物oLRXPD 53(ATGAARGCITCIATGTTIGARGATTT[SEQ ID NO46]，有義引物)和oLRXPD 31(GCRTTIACIAR-YTGIATIGARTTNGTCCAYTC[SEQ ID NO47，反義引物]獲得最大的PCR產(chǎn)物(表觀大小約為850bp)。利用32P對(duì)此PCR產(chǎn)物進(jìn)行放射性標(biāo)記并作為探針篩選鼠李糖乳桿菌染色體DNA文庫(kù)。
利用基于噬菌體的載體(ZAP ExpressTM，Stratagene)構(gòu)建此文庫(kù)。更具體地，用經(jīng)過(guò)預(yù)消化(BamHI/CIAP-處理)的ZAP ExpressTM載體試劑盒從鼠李糖乳桿菌染色體DNA的Sau3A部分消化物克隆約2-5kb的DNA片斷組分。文庫(kù)的大小超過(guò)105個(gè)原始重組體。根據(jù)廠商的建議進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，貯藏和篩選(除了文庫(kù)在-70℃，20％的甘油中冰凍冷藏)。
將上述的能夠與PCR產(chǎn)物進(jìn)行強(qiáng)雜交的幾個(gè)噬菌斑分離出，純化并利用Stratagene提供的方法將它們轉(zhuǎn)變?yōu)槭删?。在分離的噬菌粒內(nèi)XPDH基因編碼區(qū)的位置利用PCR進(jìn)行測(cè)定，其中PCR是以噬菌?？寺槟０?，oLRXPD 53(在編碼區(qū)的5′末端退火)為有義引物并且使用在噬菌粒的載體部分退火的兩個(gè)通用引物之一。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)篩選出一個(gè)克隆(pBK-CMV(LRXPDH)-21)，它含有完全的XPDH基因編碼序列(假定這種酶屬于中等鏈長(zhǎng)脫氫酶家族并具有大約350個(gè)氨基酸殘基的一條多肽鏈)。制備出此克隆的限制性圖譜。經(jīng)鑒定KpnI位點(diǎn)位于所估計(jì)的XPDH編碼區(qū)的下游大約200bp。根據(jù)此信息，構(gòu)建質(zhì)粒pBK-CMV(LRXPDH)-21的一個(gè)較小的衍生物，它仍包含XPDH基因的全長(zhǎng)序列。對(duì)pBK-CMV(LRXPDH)-21進(jìn)行KpnI水解產(chǎn)生兩個(gè)DNA片斷(約6和0.9kb)，較大的片斷利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化并自身進(jìn)行連接。將所得的質(zhì)粒命名為pBK(LRXPDH)并進(jìn)行DNA序列分析。
插入質(zhì)粒pBK(LRXPDH)中的DNA序列(SEQ ID NO48)包含一個(gè)349個(gè)密碼子的開(kāi)放閱讀框，以較不常用的起始密碼子TTG起始。推導(dǎo)出的N-末端氨基酸序列與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的XPDH的N-末端氨基酸序列精確地匹配。推導(dǎo)出的鼠李糖乳桿菌XPDH的一級(jí)序列(SEQ ID NO49)與許多中等鏈長(zhǎng)的脫氫酶的序列同源。尤其是，可以觀察到與在B.halodurans和艱難梭菌的基因組序列測(cè)定工程中鑒定的幾種推測(cè)的脫氫酶的序列(SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53)有高度的同源性。雖然這些脫氫酶的序列是已知的，但是具有這些序列的酶的底物特異性在以前或是被錯(cuò)誤地確定，或者還未確定。例如，來(lái)自B.halodurans的酶(SEQ ID NO8)一直被注釋為山梨糖醇脫氫酶(GenBank PIDg10172799)。
實(shí)施例26
構(gòu)建表達(dá)載體pGTK74(LRXPDH)和pGTK24(BHDH)
表達(dá)載體pGTK74(LRXPDH)和pGTK74(BHDH)從pGTK24分兩步進(jìn)行構(gòu)建。
第一步，存在于pGTK24中的枯草芽孢桿菌醛縮酶啟動(dòng)子被來(lái)自同種生物的經(jīng)過(guò)修飾的degQ啟動(dòng)子取代。同野生型degQ啟動(dòng)子相比，其中一種修飾是引入已知的degQ36突變[Msadek T，等，J.Bacteriol.1732366-2377(1991)]。通過(guò)以枯草芽孢桿菌的染色體DNA為模板和兩個(gè)寡核苷酸ODEGQ 5(SEQ ID NO54，GGAGTCGAC-CATGGGAGCACCTCGCAAAAAAGG)和DEGQ 3(SEQ ID NO55，GGAGAATTCACCTCCTTTCAGAGTCCCGGGTATTTGATCTGTTACTAATAGTGTATCGTCTTTCGG)為引物的PCR對(duì)修飾的degQ啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增。以限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRI消化此PCR產(chǎn)物，并與用同種酶消化的pGTK24的大片斷連接。所得的質(zhì)粒構(gòu)建體命名為pGTK74(附圖23)。
第二步，通過(guò)以鼠李糖乳桿菌的染色體DNA為模板和兩個(gè)寡核苷酸oLRXPD 501(SEQ ID NO56，GGTGAATTCATGAAAGCATCAATGTTGGAAA)和oLRXPD 301(SEQ ID NO57，GGTTCTAGACCATTATAAAATGCCTCCAATTTCACC)為引物的PCR對(duì)鼠李糖乳桿菌XPDH基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。此反應(yīng)產(chǎn)生的DNA片斷以EcoRI和XbaI消化并與以EcoRI和XbaI消化的pGTK74連接。所得的枯草芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭載體pGTK74(LRXPDH)的構(gòu)建示圖和結(jié)構(gòu)通過(guò)附圖24A進(jìn)行說(shuō)明。
類似地，表達(dá)載體pGTK74(BHDH2)的構(gòu)建是在兩個(gè)寡核苷酸引物oBHDH2 51(SEQ ID NO58，GGTCAATTGATGA-AAGCCCTTAATTTATACGGCATT CAAGAC)和oBHDH2 31(SEQ ID NO59，GCATCTAGAGTATAGTTGATCATCCTCGTGTTCGG)的協(xié)助下，通過(guò)擴(kuò)增與鼠李糖乳桿菌XPDH同源的B.halodurans基因的編碼區(qū)進(jìn)行的。所得的DNA片斷以MfeI和XbaI消化并連接到以EcoRI和XbaI水解的pGTK74上，產(chǎn)生表達(dá)載體pGTK74(BHDH2)(附圖24B)。
實(shí)施例27
鼠李糖乳桿菌和B.Halodurans的木糖醇磷酸脫氫酶基因的表達(dá)
利用pGTK74(LRXPDH)和pGTK74(BHDH2)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌株BD170。轉(zhuǎn)化體在含有25mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)夜，通過(guò)超聲制備細(xì)胞提取物并測(cè)定XPDH的活性。除了以木酮糖5-磷酸代替木酮糖作為底物(通常濃度為5mM)不同外，測(cè)定XPDH活性的條件與用于測(cè)定木糖醇脫氫酶活性的條件相似。鼠李糖乳桿菌的XPDH的活性約為0.3U/mg蛋白質(zhì)，B.halodurans的酶約為0.5U/mg蛋白質(zhì)。
通過(guò)以下程序證實(shí)B.halodurans XPDH對(duì)木酮糖磷酸的還原具有立體專一性。D-木酮糖5-磷酸和NADH之間的反應(yīng)在37℃進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)，條件如下100mM Tris-HCl緩沖液，pH7.0，10mM木酮糖5-磷酸，10mMNADH，5μl酶裂解液。以堿性磷酸酶對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化，并利用HPLC進(jìn)行分析。反應(yīng)混合物中只發(fā)現(xiàn)木糖醇和木酮糖(相應(yīng)于未反應(yīng)的木酮糖5-磷酸)而沒(méi)有阿拉伯糖醇，證明B.halodurans的“木酮糖5-磷酸還原酶”(SEQ ID NO50)實(shí)質(zhì)上就是木糖醇磷酸脫氫酶。應(yīng)當(dāng)注意的是在鼠李糖乳桿菌XPDH的最高得分的四種同源物中，B.holodurans的酶是同源性最少的。這一點(diǎn)可以說(shuō)明其它三種同源物(SEQ ID NO51，52和53)極可能也是木糖醇磷酸脫氫酶。
實(shí)施例28
利用表達(dá)XPDH的重組枯草芽孢桿菌菌株生產(chǎn)木糖醇
枯草芽孢桿菌菌株GX7以pGTK74(LRXPDH)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化體置于含有20％葡萄糖的LB培養(yǎng)基的試管中，“中等通氣”的條件(如實(shí)施8的定義)下培養(yǎng)10天。此時(shí)，通過(guò)HPLC分析培養(yǎng)液的等分試樣，發(fā)現(xiàn)其中含有大約35g/l的木糖醇。在同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)的對(duì)照菌株(未轉(zhuǎn)化的GX7)的培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)到木糖醇。
實(shí)施例29
枯草芽孢桿菌glcUgdh操縱子的過(guò)表達(dá)
利用兩個(gè)寡核苷酸引物oGDH52(SE ID NO60，GGTGAATTCATGGATTTTTATGGCTCTTCTCCC)和oGDH3(SEQ ID NO61，GGTAGATCTAGACATTACAGGATGGTGCTGTC)通過(guò)PCR對(duì)枯草芽孢桿菌的完全glcUgdh操縱子進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR中獲得的DNA片斷以EcoRI和XbaI消化，既可以連接到以EcoRI和XbaI消化的pGTK24上也可以連接到以相同的酶對(duì)消化的pGTK74上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得兩個(gè)表達(dá)載體pGTK24(GDOP)和pGTK74(GDOP)(分別通過(guò)附圖25A和25B說(shuō)明)。將兩個(gè)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌株BD170。
枯草芽孢桿菌BD170[pGTK24(GDOP)]和BD170[pGTK74(GDOP)]菌株在7℃ LB(25mg/l卡那霉素)中過(guò)夜培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)物并按照如上所述制備細(xì)胞提取物。葡萄糖脫氫酶活性通過(guò)利用葡萄糖為底物30℃ 340nm下NAD+的還原速率來(lái)測(cè)定。反應(yīng)條件是50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM NAD+，2mM MgCl2，10mM葡萄糖。發(fā)現(xiàn)兩種類型的轉(zhuǎn)化體含有相似水平的葡萄糖脫氫酶活性(大約1.5-2U/mg蛋白質(zhì))。在沒(méi)作轉(zhuǎn)化的BD170中沒(méi)有檢測(cè)到酶活性(已知野生型枯草芽孢桿菌中葡萄糖脫氫酶只有在芽孢形成期間進(jìn)行表達(dá))。
將枯草芽孢桿菌BD170[pGTK24(GDOP)]在37℃高通氣的條件下在LB(25mg/l卡那霉素)中過(guò)夜培養(yǎng)。離心收獲15ml的培養(yǎng)液并用冰凍的反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl，pH6,5；150mM NaCl)洗細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮于800μl的反應(yīng)緩沖液中。37℃下利用14C-葡萄糖(在不同的未標(biāo)記葡萄糖濃度存在的條件下)檢驗(yàn)糖的吸收。在t＝0時(shí)加入14C-葡萄糖，每分鐘取一個(gè)等分試樣(100μl)。將等分試樣加在硝化纖維素濾膜(0.2m)上，并利用3ml冰凍的反應(yīng)緩沖液洗滌。干燥濾膜并利用閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)放射活性進(jìn)行定量。在所有檢測(cè)的條件下，發(fā)現(xiàn)以pGTK24(GDOP)轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌具有高得多的葡萄糖吸收。例如，在含有1％葡萄糖的溶液中，轉(zhuǎn)化菌株的吸收速率比未轉(zhuǎn)化的野生型菌株大約高四倍(附圖26)。
這些結(jié)果表明當(dāng)從植物啟動(dòng)子表達(dá)glcUgdh操縱子時(shí)，它在枯草芽孢桿菌中仍具有功能，而且實(shí)際上這個(gè)操縱子可以用于增強(qiáng)葡萄糖流入戊糖磷酸途徑。
實(shí)施例30
鳥(niǎo)腸球菌的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的純化和部分序列分析
將鳥(niǎo)腸球菌ATCC 35655在30℃ 5升的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中包含蛋白胨-10g/l，酵母提取物-5g/l，牛肉膏10g/l，K2HPO42g/l，NaCl-5g/l，MgSO4-0.02g/l，MnCl2-0.05g/l，檸檬酸銨2g/l，Tween 20-1.1ml/l，木糖醇-20g/l，pH6.5。當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)穩(wěn)定期早期時(shí)(典型地是發(fā)酵48小時(shí)之后)終止培養(yǎng)，通過(guò)離心分離細(xì)胞(3000_g，20min)，用水洗滌并重新懸浮在含有3mM二硫蘇糖醇的20mM Tris鹽酸，pH7.2(緩沖液A)中。將細(xì)胞與0.3％溶菌酶(w/v)在20℃下培育60min，通過(guò)超聲(3_20sec)裂解并通過(guò)離心對(duì)提取物進(jìn)行澄清(12,000_g，20min)。將得到的上清液在緩沖液A中透析，然后加至以同種緩沖液平衡的Toyopearl DEAE 5PW柱(21.5_159mm)上，以線性梯度(0至1M)的NaCl對(duì)其進(jìn)行洗脫。匯集含有阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶活性的組分(分析方法如實(shí)施27的描述，在Amicon PM-30膜上濃縮為10ml，然后在緩沖液A中透析。利用同種緩沖液中的線性梯度(0-1M)NaCl在Mono Q HR(5/5)柱(Pharmacia LKB)上進(jìn)行層析，對(duì)制備物進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)分離。匯集活性組分，并加至以50mM Tris HCl緩沖液，pH8.0、100mM NaCl、3mM DTT平衡的Sepharose Blue CL6B(Pharmacia)柱(10_50mm)上，以同種緩沖液中的3mM NADH進(jìn)行洗脫。最后，匯集Sepharose Blue層析得到的活性組分，將其加到以30mM Tris HCl，pH7.4、1.7M(NH4)2SO4平衡的Phenyl Superose HR 5/5(Pharmacia)柱上，以30mM Tris HCl緩沖液，pH7.4進(jìn)行洗脫。純化的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶(約為0.2mg，以5mM木酮糖5-磷酸為底物的比活性約為12U/mg蛋白質(zhì))在水中進(jìn)行透析并凍干。
可以通過(guò)以下程序驗(yàn)證鳥(niǎo)腸球菌阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶還原D-木酮糖5-磷酸的立體專一性。D-木酮糖5-磷酸和NADH之間的反應(yīng)在37℃進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)，條件如下100mM Tris-HC緩沖液，pH7.0，10mM木酮糖5-磷酸，10mM NADH，1U酶。以堿性磷酸酶對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化，并利用HPLC進(jìn)行分析。反應(yīng)混合物中只發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖醇和木酮糖(相應(yīng)于沒(méi)有反應(yīng)的木酮糖5-磷酸)，證明鳥(niǎo)腸球菌的“木酮糖5-磷酸還原酶”是D-阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶。在本領(lǐng)域中沒(méi)有描述過(guò)其它的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶。
通過(guò)由Helsinki大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院(the Institute ofBiotechnology，university of Helsinki)提供的商業(yè)化服務(wù)獲得了蛋白質(zhì)序列。下列四種肽序列被用于克隆阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶基因(QYNLCPHR，SEQ ID NO62；EIEYIGSR，SEQ ID NO63；KQGQFIQVGLFANK，SEQ ID NO64；GAINIDEMITK，SEQ ID NO65)。許多簡(jiǎn)并寡核苷酸是根據(jù)這些序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的，并作為PCR的引物以鳥(niǎo)腸球菌染色體DNA為模板進(jìn)行了檢驗(yàn)。最好的結(jié)果是利用引物對(duì)oXP-1F(有義引物，CARTATAATTTITGTCCICATMG，SEQID NO66)和oXP-4R，(反義引物，ATCATTTCRTCIATRTTIATIGCICC；SEQID NO67)獲得的，產(chǎn)生了一個(gè)約為0.65kb的PCR產(chǎn)物。利用此PCR產(chǎn)物作為雜交探針，篩選鳥(niǎo)腸球菌的基因文庫(kù)，文庫(kù)構(gòu)建方法同在實(shí)施例25中描述的鼠李糖乳桿菌基因文庫(kù)的篩選。按照Stratagene推薦的方法，對(duì)幾個(gè)強(qiáng)雜交的噬菌體克隆進(jìn)行分離，純化并轉(zhuǎn)變成噬菌粒的形式。將一個(gè)克隆(它顯示的限制性圖譜與起始0.65kb PCR產(chǎn)物的限制性圖譜重疊)用于阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的序列測(cè)定。序列(SEQ ID NO68)包含一個(gè)352個(gè)密碼子的開(kāi)放閱讀框，該閱讀框的前面是典型的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。推導(dǎo)出的鳥(niǎo)腸球菌的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的氨基酸序列(SEQ ID NO69)與許多中等鏈長(zhǎng)脫氫酶的序列具有同源性。尤其可以觀察到與來(lái)自B.Halodurans的一個(gè)蛋白質(zhì)的推導(dǎo)序列有高的同源性，這個(gè)蛋白質(zhì)在GenBank中被注釋為“山梨糖醇脫氫酶”(SEQ ID NO70)。
實(shí)施例31
在枯草芽孢桿菌中表達(dá)鳥(niǎo)腸球菌和B.Halodurans的
阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶
利用與表達(dá)木糖醇磷酸脫氫酶(實(shí)施例26)相同的工具和方法對(duì)兩種阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶基因進(jìn)行表達(dá)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，利用分離出此酶的微生物的染色體DNA，以及適當(dāng)?shù)腜CR引物對(duì)這兩個(gè)阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)于鳥(niǎo)腸球菌，引物是oAPDH 51GGTGAATTCATGAGTAAAACAATGAAGGGTGTTTCCAAGC(SEQ ID No26)和反義引物oAPDH 31 GGTGGAT-CCTCTAGAATTTTTGGACAGCTTCCTTGATTC(SEQ ID No27)。對(duì)于B.halodurans，有義引物是oBHDH 5(GAGGGAAT-TCATGAAAGCATTAGTAAAAACACAACATGGC，SEQ ID No28)和反義引物是oBHDH 3(CAAAGATCTAGAAG-CTTCGTCCATACGGTCCTCCTTTTCCCTAAT，(SEQ ID No29)。得到的PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI的混合物消化，并連接到以同種酶混合物水解的pGTK74上(圖27A和27B)。利用所得到的表達(dá)載體pGTK74(APDH)(附圖27A)和pGTK74(BHDH)(附圖27B)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌株BD170，發(fā)現(xiàn)這兩種表達(dá)載體都能夠以高水平表達(dá)“D-木酮糖5-磷酸還原酶”。按照實(shí)施例30描述的方法測(cè)定此以前未知的B.halodurans酶還原D-木酮糖5-磷酸的立體專一性。發(fā)現(xiàn)此酶實(shí)質(zhì)上是D-阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶。
實(shí)施例32
利用重組枯草芽孢桿菌菌株生產(chǎn)阿拉伯糖醇
利用質(zhì)粒pGTK74(APDH)轉(zhuǎn)化產(chǎn)戊酮糖的枯草芽孢桿菌菌株GX7。菌株在“中等通氣”(如實(shí)施例8定義)條件下在含有10％葡萄糖的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)?？梢杂^察到在培養(yǎng)基中累積的阿拉伯糖醇達(dá)到約35-40g/l。
附錄I-表32和表331)mc＝多拷貝質(zhì)粒2)int＝整合在基因組中1)多拷貝基因的選擇基因
至此我們已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明可以在寬范圍的等價(jià)條件、參數(shù)等等下進(jìn)行，而不影響本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的精神和范圍。本文所引用的所有參考文獻(xiàn)均特此完整地并入本文作為參考。
序列表<110>達(dá)尼斯科甜味劑股份有限公司<120>五碳糖和糖醇的生產(chǎn)<130>1427.001PC05<140><141><150>US 09/488,581<151>2000-01-21<160>70<170>PatentIn Ver.3.0<210>1<211> 21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>1caatagcgac ggagagttag g 21<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>2cgacgaattc cggcgtcagc ctgaatgg 28<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>3cgacaagctt atcgaatcgg ctgatttgg 29<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>5cccgaattct gtcctcctta tgtagcctg 29<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>7cctctagagg atccaaaagc gacgccgcga atatcttcaa ac 42<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>9cccaagcttt ccctctatca aaaaatgcgg 30<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>10gttgaattcg cgtcgacgcg ttgctggcgt ttttcc 36<210>11<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>17gaggaagctt ggatccagca caattttcac atcagtcgc39<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>18ccacggatcc gtcaagagta cttgaaagg 29<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>19caccgtcgac gttccatctt ttcatcccc29<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>20gaacaggatc cagcatgact gacttaacta 30<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>21gtattggatc ccttggatgc caaaagtta29<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>22ccagtgatat cgaggatgag attagtac 28<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>23ccagtgatat ctgtacttgt cagggcat 28<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>24tcagggtcct gccagca 17<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>25cgctaggaac gatctcc 17<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>26tgagtaagct tatggcagaa ttttcagct 29<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>28ggaagatcta taatgacaat tgaaaaacca aaaatatcg 39<210>29<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>29ggaagatctt tataactctt tttttaaaaa ctgtttgg 38<210>30<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>30agaagaggat ccataatgac tcagggtgaa aagatctc 38<210>31<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>34gacagcctgc aattgtatgt 20<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>37cactagtgtc agtggaagc 19<210>38<211>483<212>DNA<213>鼠李糖乳桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(480)<400>38atg act cag ggc gaa aag atc tca gta gca ttc gta tgc ctt ggt aac48Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15atc tgt cgt tcg cct atg gct gaa gcg gtt ttc cgc cac act gta aag96Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys
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20 25 30agt aaa ggt ttg gag gat aga ttt agt aag atc gat tca ttt ggt act144Ser Lys Gly Leu Glu Asp Arg Phe Ser Lys Ile Asp Ser Phe Gly Thr
35 40 45ggt ggt tgg cac act ggg gag aca cca gat cgc aga tcc gtc tct acc192Gly Gly Trp His Thr Gly Glu Thr Pro Asp Arg Arg Ser Val Ser Thr
50 55 60tgt cgt tct cat gga gtc cca gtt gat cat agg gca aag caa ata aaa240Cys Arg Ser His Gly Val Pro Val Asp His Arg Ala Lys Gln Ile Lys 65 70 75 80cca gca cat ttc aat gaa ttt gat tat atc ctc tgt atg gat gac atg288Pro Ala His Phe Asn Glu Phe Asp Tyr Ile Leu Cys Met Asp Asp Met
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115 120 125att gtt gat gat cct tat tac ggt ggt gtt gat gga ttt gaa cat aat432Ile Val Asp Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Val Asp Gly Phe Glu His Asn
130 135 140ttc cgt caa atc aca cat ttt tgt gaa tca ttc tta gat agt gaa ttg480Phe Arg Gln Ile Thr His Phe Cys Glu Ser Phe Leu Asp Ser Glu Leu145 150 155 160taa483<210>41<211>160<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物的描述PPPase2<400>41Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys
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180 185 190Asp Val Phe Asp Glu Lys Leu Asp Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ala Asp
195 200 205Ile Cys Ile Asn Ala Lys Glu Lys Asn Ile Val Glu Glu Ile Lys Arg
210 215 220Leu Thr Asp Gly Asp Gly Ala Asp Ile Val Ile Glu Ser Ala Gly Thr225 230 235 240Pro Leu Thr Cys Gly Gln Val Leu Leu Leu Ala Lys Lys Gly Gly Thr
245 250 255Val Leu Tyr Ala Gly Val Pro Tyr Gly Asp Val Ala Leu Thr Arg Glu
260 265 270Gln Phe Glu Lys Ile Val Arg Ser Glu Leu Thr Val Lys Gly Thr Trp
275 280 285Phe Gly Asn Ser Phe Pro Phe Pro Gly Lys Glu Trp Ser Ala Gly Leu
290 295 300Tyr His Met Gln Lys Gly Asp Met Asn Val Glu Lys Leu Val Thr His305 310 315 320Arg Ile Asn Leu Glu Glu Ala Pro Ala Tyr Phe Glu Lys Val Tyr Lys
325 330 335Arg Asp Ile Phe Phe Gly Lys Ile Met Ile Asn Ile Asp Asn
340 345 350<210>54<211>33<212>DNA<213>人工<220><223>oDEGQ 5引物<400>54ggagtcgacc atgggagcac ctcgcaaaaa agg 33<210>55<211>66<212>DNA<213>人工<220><223>DEGQ 3引物<400>55ggagaattca cctcctttca gagtcccggg tatttgatct gttactaata gtgtatctgc 60tttcgg66<210>56<211>31<212>DNA<213>人工<220><223>oLRYPD 501引物<400>56ggtgaattca tgaaagcatc aatgttggaa a31<210>57<211>36<212>DNA<213>人工<220><223>oLRXPD 301引物<400>57ggttctagac cattataaaa tgcctccaat ttcacc 36<210>58<211>42<212>DNA<213>人工<220><223>oBHDH2 51引物<400>58ggtcaattga tgaaagccct taatttatac ggcattcaag ac42<210>59<211>35<212>DNA<213>人工<220><223>oBHDH2 31引物<400>59gcatctagag tatagttgat catcctcgtg ttcgg35<210>60<211>35<212>DNA<213>人工<220><223>oGDH52引物<400>60ggtgaattca tggatttatt attggctctt ctccc 35<210>61<211>33<212>DNA<213>人工<220><223>oGDH3引物<400>61ggtagatcta gacattacag cgatggtgct gtc33<210>62<211>8<212>PRT<213>鳥(niǎo)腸球菌<400>62Gln Tyr Asn Leu Cys Pro His Arg1 5<210>63<211>8<212>PRT<213>鳥(niǎo)腸球菌<400>63Glu Ile Glu Tyr Ile Gly Ser Arg1 5<210>64<211>14<212>PRT<213>鳥(niǎo)腸球菌<400>64Lys Gln Gly Gln Phe Ile Gln Val Gly Leu Phe Ala Asn Lys1 5 10<210>65<211>11<212>PRT<213>鳥(niǎo)腸球菌<400>65Gly Ala Ile Asn Ile Asp Glu Met Ile Thr Lys1 5 10<210>66<211>23<212>DNA<213>人工<220><223>oXP-1F引物<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n是次黃苷殘基<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n是次黃苷殘基<400>66cartataatt tntgtccnca tmg 23<210>67<211>26<212>DNA<213>人工<220><223>oXP-4R<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n是次黃苷殘基<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n是次黃苷殘基<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n是次黃苷殘基<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>n是次黃苷殘基<400>67atcatttcrt cnatrttnat ngcncc26<210>68<211>1400<212>DNA<213>鳥(niǎo)腸球菌<400>68cattgacagt cgtgatggct gttgccttgt taatggcgac caattttgcg ccagtgatta 60ctgaaatggc gcaagggatc gtgaagttcc cagaaggcgc tgctgaaatt acgaacttgg 120atacaggcgg aaatttctta aaatggatct tcttgaaatt ctcagaatta gttgccacag 180tgatgtagga ggtttttgta aatgagtaaa acaatgaagg gtgtttccaa gcaggcaccc 240ggttatgacc aaatggcatt tatcgattta tctgttccag aagcaacaga tgacaaggtc 300ttgattaaag tcgcttatac aggtatttgc ggatcagata tccatacgtt taaaggtgaa 360tacaaaaatc ccactactcc cgtcgtccta ggacatgaat tttctgggca ggtagttgaa 420gtcggagcca atgtaacaaa ggtcaaggtt ggtgatcggg taaccagtga gacgaccttt 480tatgtctgcg gcgaatgcga ttattgcaag gaaaagcagt ataatttgtg tccccatcga 540aaaggaatcg gcacgcagca aaatggctcc atggcgaact atgtgttggc tcgagaagaa 600agcattcatt tactgccgga tcatttaagc tatgaaggtg cggcgatgag cgaaccatta 660gcgtgctgtg tccacgcgat gtatcaaaag agtcacttgg aattaaaaga cacgatcatt 720atcatgggcc ctggaccaat cggactgtat cttttgcaga ttgccaagga aattggagcc 780ttcgtcatta tgacggggat cacaaaagat gctcatcgct tagcattagc aaaaaaacta 840ggcgcggatg tgatcgttga tacgatgaag gaagatctag cgaaagtcgt caatgagatc 900acggatggct acggtgtcga taaagtgtat gatgcctcag gagcagttcc tgctgttaat 960gctagtctgc cattgattcg caagcagggg caatttattc aagtaggctt gttcgctaat1020aaaatggtgg atttagacac tgaatcgatc attcaacgag agatcgaata catcggcagt1080cgttcacaga acccttatga ctggccgatt gcgatccact tattagcgaa aggtgcgatc1140aatatcgatg agatgattac gaaaaaatac ccgttgactg aatggcggga agcctttgat1200aaagtgatgg aaggcaatga aatcaaggta atgatcgaat ccaatccaga agaattttaa1260tttgaatcaa ggaagctgta ccagaatttt tggtgcagct ttttgtgagt ttgttttata1320ggaggatttt tttgatacta ttttcatgag aacagtgtaa taaataatca ttagcaagaa1380attgtaaaag aatattgtat1400<210>69<211>352<212>PRT<213>鳥(niǎo)腸球菌<400>69Met Ser Lys Thr Met Lys Gly Val Ser Lys Gln Ala Pro Gly Tyr Asp1 5 10 15Gln Met Ala Phe Ile Asp Leu Ser Val Pro Glu Ala Thr Asp Asp Lys
20 25 30Val Leu Ile Lys Val Ala Tyr Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His
35 40 45Thr Phe Lys Gly Glu Tyr Lys Asn Pro Thr Thr Pro Val Val Leu Gly
50 55 60His Glu Phe Ser Gly Gln Val Val Glu Val Gly Ala Asn Val Thr Lys65 70 75 80Val Lys Val Gly Asp Arg Val Thr Ser Glu Thr Thr Phe Tyr Val Cys
85 90 95Gly Glu Cys Asp Tyr Cys Lys Glu Lys Gln Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110Arg Lys Gly Ile Gly Thr Gln Gln Asn Gly Ser Met Ala Asn Tyr Val
115 120 125Leu Ala Arg Glu Glu Ser Ile His Leu Leu Pro Asp His Leu Ser Tyr
130 135 140Glu Gly Ala Ala Met Ser Glu Pro Leu Ala Cys Cys Val His Ala Met145 150 155 160Tyr Gln Lys Ser His Leu Glu Leu Lys Asp Thr Ile Ile Ile Met Gly
165 170 175Pro Gly Pro Ile Gly Leu Tyr Leu Leu Gln Ile Ala Lys Glu Ile Gly
180 185 190Ala Phe Val Ile Met Thr Gly Ile Thr Lys Asp Ala His Arg Leu Ala
195 200 205Leu Ala Lys Lys Leu Gly Ala Asp Val Ile Val Asp Thr Met Lys Glu
210 215 220Asp Leu Ala Lys Val Val Asn Glu Ile Thr Asp Gly Tyr Gly Val Asp225 230 235 240Lys Val Tyr Asp Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala Val Asn Ala Ser Leu
245 250 255Pro Leu Ile Arg Lys Gln Gly Gln Phe Ile Gln Val Gly Leu Phe Ala
260 265 270Asn Lys Met Val Asp Leu Asp Thr Glu Ser Ile Ile Gln Arg Glu Ile
275 280 285Glu Tyr Ile Gly Ser Arg Ser Gln Asn Pro Tyr Asp Trp Pro Ile Ala
290 295 300Ile His Leu Leu Ala Lys Gly Ala Ile Asn Ile Asp Glu Met Ile Thr305 310 315 320Lys Lys Tyr Pro Leu Thr Glu Trp Arg Glu Ala Phe Asp Lys Val Met
325 330 335Glu Gly Asn Glu Ile Lys Val Met Ile Glu Ser Asn Pro Glu Glu Phe
340 345 350<210>70<211>343<212>PRT<213>Bacillus halodurans(推導(dǎo)的序列)<400>70Met Lys Ala Leu Val Lys Thr Gln His Gly Thr Gly His Phe Ala Val1 5 10 15Gln Glu Lys Pro Glu Pro Thr Pro Gly Lys His Gln Val Lys Ile Lys
20 25 30Val Lys Tyr Thr Gly Val Cys Gly Ser Asp Ile His Thr Tyr Glu Gly
35 40 45His Tyr Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Leu Gly His Glu Phe Ser Gly
50 55 60Glu Ile Val Glu Leu Gly Glu Gly Val Thr Gly Phe Asn Val Gly Asp65 70 75 80Arg Val Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Ser Ile Cys Gly Lys Cys Ser Tyr
85 90 95Cys Thr Ser Gly Asp Tyr Asn Leu Cys Ser His Arg Lys Gly Leu Gly
100 105 110Asn Gln Gln Asp Gly Ser Phe Ala Lys Tyr Val Ile Ala Arg Gln Glu
115 120 125Ser Leu His His Leu Pro Ala Gly Val Asp Asp Arg Ser Ala Ala Met
130 135 140Thr Glu Pro Leu Ala Cys Thr His His Ala Ile Ala Lys Thr Ser Ile145 150 155 160Asn Lys Gly Asp Leu Val Val Val Thr Gly Pro Gly Pro Ile Gly Leu
165 170 175Leu Ala Ala Gln Val Ala Lys Ser His Gly Gly Thr Val Ile Ile Thr
180 185 190Gly Leu Ser Asn Asp Gln Val Arg Leu Lys Lys Ala Lys Glu Val Gly
195 200 205Ile Asp Tyr Ala Ile Asp Thr Gln Glu Val Asp Ile Lys Glu Leu Val
210 215 220Ser Glu Leu Thr Asp Gly Tyr Gly Ala Asp Val Val Leu Glu Cys Ser225 230 235 240Gly Ala Val Pro Ala Ala Lys Gln Gly Ile Asp Leu Leu Arg Lys Lys
245 250 255Gly Gln Tyr Ala Gln Val Gly Leu Phe Ala Gln Pro Glu Ile Gln Phe
260 265 270Asn Phe Glu Lys Ile Ile Gln Lys Glu Ile Ser Val Val Gly Ser Arg
275 280 285Ser Gln Lys Pro Ala Asp Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Leu Asn Glu
290 295 300Lys Lys Val Asn Ala Lys Thr Leu Val Thr His Glu Tyr Thr Ile Ser305 310 315 320Glu Trp Asp Lys Ala Tyr His Ala Ile Lys Ser Gly Glu Ala Ile Lys
325 330 335Val Leu Leu Thr Pro Ile Asp
340
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)木糖醇的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成份的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培養(yǎng)遺傳修飾微生物宿主；
(B)通過(guò)利用所述宿主將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物經(jīng)
過(guò)阿拉伯糖醇不是中間物的途徑在所述宿主中轉(zhuǎn)化成所
述木糖醇，在部分(A)的所述培養(yǎng)中生產(chǎn)木糖醇；和
(C)回收部分(B)中產(chǎn)生的所述木糖醇；
其中在所述遺傳修飾微生物宿主中所述木糖醇的產(chǎn)量或產(chǎn)率與所述遺傳修飾前所述宿主中木糖醇的所述產(chǎn)量或產(chǎn)率相比增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述代謝途徑包含核酮糖-5-P作為中間物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝途徑包含核酮糖5-P、木酮糖-5-P和木糖醇-5-P作為中間物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝途徑包含(1)核酮糖-5-P、(2)核酮糖、和(3)木酮糖及木糖中的至少一個(gè)作為中間物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中木酮糖激酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比降低。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中木糖醇脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述，木糖醇脫氫酶是T.reesei木糖醇脫氫酶。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中木糖醇磷酸脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是鼠李糖乳桿菌木糖醇1-磷酸脫氫酶。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO49的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶由包含SEQ ID NO48的核酸序列的基因編碼。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是B.halodurans木糖醇1-磷酸脫氫酶。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述B.halodurans木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO50的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是艱難梭菌木糖醇1-磷酸脫氫酶。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述艱難梭菌木糖醇磷酸脫氫酶包含具有選自SEQ ID NO51、52和53的序列的氨基酸序列。
17.生產(chǎn)木酮糖5-P衍生產(chǎn)物的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成份的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培養(yǎng)遺傳修飾微生物宿主；
(B)通過(guò)利用所述宿主將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物在
所述宿主中轉(zhuǎn)化成所述木酮糖-5-P，在部分(A)的所述培
養(yǎng)中生產(chǎn)木酮糖-5-P；
(C)將所述宿主在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的所述木酮
糖-5-P轉(zhuǎn)化成所述木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物；
(D)回收部分(C)中產(chǎn)生的所述木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物；
其中在所述遺傳修飾宿主中所述木酮糖-5-P的產(chǎn)量或產(chǎn)率與所述遺傳修飾前所述宿主中所述木酮糖-5-P的產(chǎn)量或產(chǎn)率相比增加。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核酮糖5-P 3-差向異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中木糖異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中甘露糖異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中木糖醇1-磷酸脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是鼠李糖乳桿菌木糖醇1-磷酸脫氫酶。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO49的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶由包含SEQ ID NO48的核酸序列的基因編碼。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是B.halodurans木糖醇1-磷酸脫氫酶。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述B.halodurans木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO50的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是艱難梭菌木糖醇磷酸脫氫酶。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述艱難梭菌木糖醇磷酸脫氫酶包含具有選自SEQ ID NOs51、52和53的序列的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)物是D-木酮糖。
30.權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)物是D-木糖。
31.權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)物是D-來(lái)蘇糖。
32.生產(chǎn)核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培養(yǎng)遺傳修飾的微生物宿主；
(B)通過(guò)利用所述宿主將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物在
所述宿主中轉(zhuǎn)化成所述核酮糖5-P，在部分(A)的所述培
養(yǎng)過(guò)程中生產(chǎn)核酮糖5-P；
(C)將所述宿主在步驟(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的所述核酮
糖-5-P轉(zhuǎn)化成所述核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物；
(D)回收步驟(c)中產(chǎn)生的所述核酮糖5-P衍生產(chǎn)物；
其中所述遺傳修飾微生物宿主中所述核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物的產(chǎn)量或產(chǎn)率與所述遺傳修飾前所述宿主中所述核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物的產(chǎn)量或產(chǎn)率相比增加。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比減少。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核酮糖還原酶(NADPH)的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核糖醇脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述遺傳修飾宿主表達(dá)L-果糖異構(gòu)酶。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述遺傳修飾宿主表達(dá)塔格糖差向異構(gòu)酶和木糖異構(gòu)酶。
38.權(quán)利要求32的方法，其中所述產(chǎn)物是核酮糖。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述產(chǎn)物是D-阿拉伯糖醇。
40.權(quán)利要求32的方法，其中所述產(chǎn)物是D-阿拉伯糖。
41.權(quán)利要求32的方法，其中所述產(chǎn)物是核糖醇。
42.權(quán)利要求32的方法，其中所述產(chǎn)物是D-木糖。
43.權(quán)利要求32的方法，其中所述產(chǎn)物是包含核酮糖、D-阿拉伯糖醇、D-阿拉伯糖和核糖醇的混合物。
44.生產(chǎn)核糖-5-P衍生產(chǎn)物的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培養(yǎng)遺傳修飾的微生物宿主；
(B)通過(guò)利用所述宿主將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物在
所述宿主中轉(zhuǎn)化成所述核糖-5-P，在部分(A)的所述培養(yǎng)
過(guò)程中生產(chǎn)核糖-5-P；
(C)將所述宿主在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的所述核糖
-5-P轉(zhuǎn)化成所述核糖-5-P衍生產(chǎn)物；
(D)回收部分(C)中產(chǎn)生的所述核糖-5-P衍生產(chǎn)物；
其中所述遺傳修飾宿主中所述核糖-5-P衍生產(chǎn)物的產(chǎn)量或產(chǎn)率與所述遺傳修飾前所述宿主中的所述核糖-5-P衍生產(chǎn)物的產(chǎn)量或產(chǎn)率相比增加。
45.權(quán)利要求45的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核糖-5-P異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述宿主缺少轉(zhuǎn)酮酶。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比減少。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述宿主缺少轉(zhuǎn)酮酶活性。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核酮糖還原酶(NADPH)的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
50.權(quán)利要求44的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中核糖醇脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
51.權(quán)利要求44的方法，其中所述遺傳修飾宿主表達(dá)L-果糖異構(gòu)酶。
52.權(quán)利要求44的方法，其中所述產(chǎn)物是核糖-5-P。
53.權(quán)利要求44的方法，其中所述產(chǎn)物是核糖醇。
54.權(quán)利要求44的方法，其中所述產(chǎn)物是核糖。
55.權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，所述宿主使得進(jìn)入戊糖磷酸途徑氧化階段的碳流增加。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述宿主經(jīng)遺傳修飾含有使用ATP作為磷酸供體的葡萄糖吸收系統(tǒng)。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述系統(tǒng)是葡糖激酶-己糖激酶系統(tǒng)。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述宿主經(jīng)遺傳修飾使glcUgdh操縱子的表達(dá)增加。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述glcUgdh操縱子是枯草芽孢桿菌glcUgdh操縱子。
60.權(quán)利要求55的方法，其中所述宿主以一定方式進(jìn)行了遺傳修飾，使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中糖酵解途徑中葡萄糖-6-P的利用與所述遺傳修飾前所述宿主中的所述利用相比減少。
61.權(quán)利要求60的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述宿主缺少葡糖磷酸異構(gòu)酶活性。
62.權(quán)利要求60的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述宿主缺少果糖磷酸激酶活性。
63.權(quán)利要求60的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述宿主缺少果糖二磷酸醛縮酶活性。
64.權(quán)利要求1、17、32或44的方法，其中通過(guò)在所述宿主中引入至少一個(gè)基因?qū)λ鏊拗鬟M(jìn)行遺傳修飾，其中所述基因能夠表達(dá)能夠在戊糖磷酸途徑氧化階段中參與NADPH再生的酶。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述酶是轉(zhuǎn)氫酶。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述酶選自NAD(P)H依賴性脫氫酶和NAD(P)H依賴性還原酶。
67.權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法，其中所述遺傳修飾宿主轉(zhuǎn)化了編碼葡糖激酶或己糖激酶的基因。
68.權(quán)利要求1、17、或32之任一項(xiàng)的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述遺傳修飾宿主缺少核糖-5-P異構(gòu)酶活性。
69.權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述遺傳修飾宿主缺少轉(zhuǎn)酮酶活性。
70.權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中所述遺傳修飾宿主缺少轉(zhuǎn)醛醇酶活性。
71.權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法，其中所述遺傳修飾宿主的遺傳修飾使得在部分(A)的所述培養(yǎng)過(guò)程中去磷酸化酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述去磷酸化酶蛋白選自DOG1、DOG2、LPT1、PPase1、PPase2和低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶。
73.權(quán)利要求71的方法，其中所述去磷酸化蛋白由包含選自SEQ ID NO38和SEQ ID NO40的序列或其部分的基因編碼。
74.權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法，其中所述遺傳修飾宿主缺少戊糖激酶、戊酮糖激酶、或兩種均缺少。
75.通過(guò)權(quán)利要求1、17、32或44之任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物。
76.生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培養(yǎng)遺傳修飾的微生物宿主；
(B)通過(guò)利用所述宿主將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物在
所述宿主中轉(zhuǎn)化成所述D-阿拉伯糖醇，在部分(A)的所述
培養(yǎng)過(guò)程中生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇；
(C)回收部分(B)中產(chǎn)生的所述D-阿拉伯糖醇；
其中所述遺傳修飾微生物宿主中所述D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量或產(chǎn)率與所述遺傳修飾前所述宿主中所述D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量或產(chǎn)率相比增加。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述微生物宿主被編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的基因轉(zhuǎn)化。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶來(lái)自鳥(niǎo)腸球菌。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO69的氨基酸序列。
80.權(quán)利要求78的方法，其中所述阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶由包含SEQ ID NO68的核酸序列的基因編碼。
81.權(quán)利要求77的方法，其中所述阿拉伯糖醇5-磷酸脫氫酶來(lái)自B.halodurans并且其中所述阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO69的氨基酸序列。
82.權(quán)利要求76-79之任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主還被編碼木糖醇磷酸脫氫酶的基因轉(zhuǎn)化。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是鼠李糖乳桿菌、B.halodurans、或艱難梭菌的木糖醇磷酸脫氫酶。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO49、50、51、52或53之任一個(gè)的氨基酸序列。
85.權(quán)利要求1、17、32、44或76之任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物宿主是細(xì)菌。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物宿主是芽孢桿菌。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌。
88.權(quán)利要求1、17、32、44或76之任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物宿主是真菌。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述真菌是酵母。
90.遺傳修飾的微生物宿主，其中當(dāng)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培養(yǎng)時(shí)，所述宿主能夠產(chǎn)生木糖醇，方式是通過(guò)阿拉伯糖醇不是中間物的代謝途徑將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物轉(zhuǎn)化成所述木糖醇，并且其中與所述遺傳修飾前宿主產(chǎn)生的木糖醇水平相比，所述宿主經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生增加量的木糖醇。
91.遺傳修飾的微生物宿主，其中當(dāng)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培養(yǎng)時(shí)，所述宿主能夠產(chǎn)生核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物，方式是通過(guò)代謝途徑將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物轉(zhuǎn)變成所述核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物，其中與所述遺傳修飾前宿主產(chǎn)生的水平相比，所述宿主經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生增加量的所述核酮糖-5-P衍生產(chǎn)物。
92.遺傳修飾的微生物宿主，其中當(dāng)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培養(yǎng)時(shí)，所述宿主能夠產(chǎn)生木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物，方式是通過(guò)代謝途徑將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物轉(zhuǎn)變成所述木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物，其中與所述遺傳修飾前宿主產(chǎn)生的水平相比，所述宿主經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生增加量的所述木酮糖-5-P衍生產(chǎn)物。
93.遺傳修飾的微生物宿主，其中當(dāng)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作為主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培養(yǎng)時(shí)，所述宿主能夠產(chǎn)生核糖-5-P衍生產(chǎn)物，方式是通過(guò)代謝途徑將一種或多種戊糖磷酸途徑中間物轉(zhuǎn)變成所述核糖-5-P衍生產(chǎn)物，其中與所述遺傳修飾前宿主產(chǎn)生的水平相比，所述宿主經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生增加量的所述核糖-5-P衍生產(chǎn)物。
94.權(quán)利要求91或93的宿主，其中與所述遺傳修飾前所述宿主中發(fā)現(xiàn)的核酮糖-5-P 3-差向異構(gòu)酶活性相比，所述遺傳修飾宿主缺少此活性。
95.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中與所述遺傳修飾前的所述宿主相比，所述宿主使得進(jìn)入戊糖磷酸途徑氧化階段的碳硫增加。
96.權(quán)利要求95的宿主，其中所述宿主經(jīng)遺傳修飾含有使用ATP作為磷酸供體的葡萄糖吸收系統(tǒng)。
97.權(quán)利要求96的宿主，其中所述系統(tǒng)是葡糖激酶-己糖激酶系統(tǒng)。
98.權(quán)利要求95的宿主，其中所述宿主經(jīng)遺傳修飾使glcUgdh操縱子的表達(dá)增加。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述glcUgdh操縱子是枯草芽孢桿菌glcUgdh操縱子。
100.權(quán)利要求95的宿主，其中所述宿主以一定方式進(jìn)行了遺傳修飾，使得糖酵解途徑中葡萄糖-6-P的利用與所述遺傳修飾前所述宿主的相比減少。
101.權(quán)利要求100的宿主，其中與所述遺傳修飾前所述宿主中的葡糖磷酸異構(gòu)酶活性相比，所述宿主缺少此活性。
102.權(quán)利要求100的宿主，其中與所述遺傳修飾前所述宿主中的果糖磷酸激酶活性相比，所述宿主缺少此活性。
103.權(quán)利要求100的宿主，其中與所述遺傳修飾前所述宿主中的果糖二磷酸醛縮酶活性相比，所述宿主缺少此活性。
104.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中通過(guò)在所述宿主中引入至少一個(gè)基因?qū)λ鏊拗鬟M(jìn)行遺傳修飾，其中所述基因能夠表達(dá)能夠在戊糖磷酸途徑氧化階段參與NADPH再生的酶。
105.權(quán)利要求104的宿主，其中所述酶是轉(zhuǎn)氫酶。
106.權(quán)利要求104的宿主，其中所述酶是NAD(P)H依賴性脫氫酶或NAD(P)H依賴性還原酶。
107.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中所述遺傳修飾宿主缺少轉(zhuǎn)醛醇酶。
108.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中所述遺傳修飾宿主缺少轉(zhuǎn)酮酶。
109.權(quán)利要求90、91、92或93的宿主，其中所述遺傳修飾宿主使脫磷酸化蛋白的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
110.權(quán)利要求109的宿主，其中所述去磷酸化蛋白選自DOG1、DOG2、LPT1、PPase1、PPase2和低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶。
111.權(quán)利要求109的宿主，其中所述去磷酸化蛋白由包含選自SEQ ID NO38和SEQ ID NO40的序列或其部分的基因編碼。
112.權(quán)利要求90的宿主，其中所述遺傳修飾宿主使得木糖醇脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
113.權(quán)利要求112的宿主，其中所述木糖醇脫氫酶是T.reesei木糖醇脫氫酶。
114.權(quán)利要求90或91之任一項(xiàng)的宿主，其中所述遺傳修飾宿主使得塔格糖異構(gòu)酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
115.權(quán)利要求90或92之任一項(xiàng)的宿主，其中所述遺傳修飾宿主使得木糖醇1-P脫氫酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
116.權(quán)利要求115的宿主，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶。
117.權(quán)利要求116的宿主，其中所述鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO49的氨基酸序列。
118.權(quán)利要求117的宿主，其中所述鼠李糖乳桿菌木糖醇磷酸脫氫酶由包含SEQ ID NO48的核酸序列的基因編碼。
119.權(quán)利要求115的宿主，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是B.halodurans木糖醇磷酸脫氫酶。
120.權(quán)利要求119的宿主，其中所述B.halodurans木糖醇磷酸脫氫酶包含SEQ ID NO50的氨基酸序列。
121.權(quán)利要求115的宿主，其中所述木糖醇磷酸脫氫酶是艱難梭菌木糖醇磷酸脫氫酶。
122.權(quán)利要求121的方法，其中所述艱難梭菌木糖醇磷酸脫氫酶包含具有選自SEQ ID NOs51、52和53的序列的氨基酸序列。
123.權(quán)利要求90或91之任一項(xiàng)的宿主，其中所述遺傳修飾宿主缺少戊糖激酶、戊酮糖激酶、或兩種均缺少。
124.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中所述遺傳修飾宿主使得葡糖激酶或己糖激酶的總活性與遺傳修飾前所述宿主中的所述活性相比增加。
125.權(quán)利要求90、91或92之任一項(xiàng)的宿主，其中與所述遺傳修飾前所述宿主中發(fā)現(xiàn)的核糖-5-P異構(gòu)酶活性相比，所述遺傳修飾宿主缺少此活性。
126.權(quán)利要求90、91或92之任一項(xiàng)的宿主，其中與所述遺傳修飾前所述宿主中發(fā)現(xiàn)的核糖-5-P異構(gòu)酶活性和轉(zhuǎn)酮酶活性相比，所述遺傳修飾宿主缺少這些活性。
127.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中所述微生物宿主是細(xì)菌。
128.權(quán)利要求127的宿主，其中所述細(xì)菌是芽孢桿菌。
129.權(quán)利要求128的宿主，其中所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌。
130.權(quán)利要求90、91、92或93之任一項(xiàng)的宿主，其中所述微生物宿主是真菌。
131.權(quán)利要求130的宿主，其中所述真菌是酵母。
132.分離的多核苷酸，其包含編碼具有SEQ ID NO49的氨基酸序列的木糖醇磷酸脫氫酶或其具有相同功能的同系物的核苷酸序列。
133.包含編碼木糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求132的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少95％同一性。
134.包含編碼木糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求132的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少85％同一性。
135.包含編碼木糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求132的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少75％同一性。
136.包含編碼木糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求132的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少65％同一性。
137.包含編碼木糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求132的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少55％同一性。
138.包含編碼木糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求132的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少35％同一性。
139.權(quán)利要求132的多核苷酸，其中所述序列編碼SEQ IDNO49的氨基酸序列。
140.權(quán)利要求132的多核苷酸，其中所述SEQ ID NO49的所述氨基酸序列由SEQ ID NO48的多核苷酸序列編碼。
141.包含權(quán)利要求132、139和140之任一項(xiàng)的多核苷酸的載體。
142.權(quán)利要求141的載體，其中所述多核苷酸可操作地與啟動(dòng)子序列連接。
143.包含權(quán)利要求132、139-142之任一項(xiàng)的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
144.權(quán)利要求143的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌。
145.權(quán)利要求144的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌是芽孢桿菌。
146.權(quán)利要求145的宿主細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌。
147.制備木糖醇磷酸脫氫酶的方法，所述方法包括在所述脫氫酶能夠得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求143-146之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，和表達(dá)所述脫氫酶。
148.分離的多核苷酸，其包含編碼具有SEQ ID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列的阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶或其具有相同功能的同系物的核苷酸序列。
149.包含編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求148的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQID NO69或S EQ ID NO70的氨基酸序列有至少99％同一性。
150.包含編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求148的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少95％同一性。
151.包含編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求148的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少85％同一性。
152.包含編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求148的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少75％同一性。
153.包含編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求148的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少55％同一性。
154.包含編碼阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的核苷酸序列的根據(jù)權(quán)利要求148的分離多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列與SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少35％同一性。
155.權(quán)利要求148的多核苷酸，其中所述序列編碼SEQ IDNO69的氨基酸序列。
156.權(quán)利要求155的多核苷酸，其中所述SEQ ID NO69的所述氨基酸序列由SEQ ID NO68的多核苷酸序列編碼。
157.包含權(quán)利要求148、155-156之任一項(xiàng)的多核苷酸的載體。
158.權(quán)利要求157的載體，其中所述多核苷酸可操作地與啟動(dòng)子序列連接。
159.包含權(quán)利要求148、155-158之任一項(xiàng)的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
160.權(quán)利要求159的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌。
161.權(quán)利要求160的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌是芽孢桿菌。
162.權(quán)利要求161的宿主細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌。
163.制備阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶的方法，所述方法包括在所述脫氫酶能夠得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求159-162之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，和表達(dá)所述脫氫酶。
164.阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶對(duì)于微生物宿主細(xì)胞中阿拉伯糖醇的重組生產(chǎn)的用途。
165.阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶對(duì)于微生物宿主細(xì)胞中木糖醇的重組生產(chǎn)的用途。
166.權(quán)利要求165的用途，其中所述生產(chǎn)還利用了阿拉伯糖醇磷酸脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用代謝工程化的微生物宿主，從容易獲得的底物如己糖，生產(chǎn)五碳糖和糖醇以及其它來(lái)源于戊糖磷酸途徑的化合物的方法。
文檔編號(hào)C12P7/02GK1395618SQ01803948
公開(kāi)日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
發(fā)明者A·米亞斯尼科夫, H·奧亞莫, M·波韋拉萊納, H·格羅斯, M·托伊瓦里, P·理查德, L·羅霍寧, K·科伊武蘭塔, J·隆代伯勒夫, A·阿里斯蒂祖, M·彭蒂萊, C·普拉扎內(nèi)－默尼, J·多伊徹 申請(qǐng)人:達(dá)尼斯科甜味劑股份有限公司