專利名稱：一種炎癥前期趨化因子拮抗肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種炎癥前期趨化因子拮抗肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥反應(yīng)是機(jī)體保護(hù)自身的正常防御反應(yīng)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體是有害的， 會(huì)傷害機(jī)體自身的組織，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致多器官衰竭，危及生命?；撔阅X膜炎、全身炎癥反應(yīng)綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等炎癥性疾病嚴(yán)重影響了人們的身體健康。在炎癥反應(yīng)前期，內(nèi)毒素的主要成分脂多糖可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞微絲的降解、促進(jìn)血液凝固性增強(qiáng)、白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附等多種途徑直接參與或放大炎性反應(yīng)，是引起休克和炎性反應(yīng)的關(guān)鍵性介質(zhì)之一。炎性反應(yīng)中作為一種重要的炎癥介質(zhì)，趨化因子在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在炎癥反應(yīng)發(fā)展的過(guò)程中，機(jī)體主要釋放IL-8、 MCP-U IL-U IL-6、RANTES, TNF-a、SCYA3、SCYBlO 等炎性因子。抗炎癥反應(yīng)的研究是近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，主要策略包括拮抗細(xì)胞因子及相關(guān)受體，中和內(nèi)毒素的抗體，應(yīng)用LPS啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中間分子阻斷劑等。采用拮抗細(xì)胞因子及相關(guān)受體，從而減輕細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體的損害，已引起許多學(xué)者的關(guān)注。之前絕大多數(shù)抗炎治療的靶點(diǎn)是主要針對(duì)募集于局部炎癥區(qū)域的炎性細(xì)胞。研究表明，炎癥反應(yīng)所引起的多種生物學(xué)效應(yīng)往往并非直接作用于靶細(xì)胞的結(jié)果。細(xì)菌內(nèi)毒素通常首先是激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，誘導(dǎo)其分泌多種介質(zhì)因子，然后通過(guò)這些介質(zhì)因子在局部或循環(huán)中播散至機(jī)體其它部分而發(fā)揮效應(yīng)作用。因此，目前的抗炎治療是致力于抑制特定炎性細(xì)胞向炎癥區(qū)域的遷移，而炎癥反應(yīng)前期產(chǎn)生的炎性介質(zhì)因子成為主要的治療靶點(diǎn)。大多數(shù)趨化因子在炎癥中所扮演的角色是吸引特定的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于炎癥部位參與炎癥反應(yīng)，其作用的發(fā)揮通過(guò)與其受體的結(jié)合來(lái)完成。因此，我們可以通過(guò)抑制炎癥初期某些趨化因子的活動(dòng)來(lái)減少有害的免疫應(yīng)答。目前主要有以下三種類型趨化因子及其受體的拮抗劑趨化因子受體的小分子抑制劑、抗趨化因子及其受體的中和單克隆抗體、修飾的趨化因子或N-端肽。噬菌體展示技術(shù)(Phage Display Techniques, PDT)是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型技術(shù)，它是探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子，探測(cè)未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位的有利工具。其原理是利用基因重組技術(shù)，將合成的寡核苷酸或者cDNA插入到絲狀噬菌體(M13，fd或fl)主要外殼蛋白gp VDI或次要外殼蛋白 gp III基因的5’端，從而使相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽融合表達(dá)于gp VDI或gp III的N-端，展示于噬菌體的表面。因此，噬菌體展示技術(shù)將外源蛋白的基因型與表現(xiàn)型緊密聯(lián)系在一起，通過(guò) “吸附-洗脫一擴(kuò)增”的親和篩選過(guò)程，可以將展示特異性外源蛋白的噬菌體從表達(dá)有各種各樣外源蛋白的噬菌體肽庫(kù)(IO8-IO12)中篩選出來(lái)，經(jīng)擴(kuò)增可以得到上千倍乃至IO8倍的富集，從而可以很容易地對(duì)所篩選到的克隆進(jìn)行序列測(cè)定，確定表達(dá)的肽的氨基酸序列。
親和富集的方法進(jìn)行噬菌體肽庫(kù)篩選作為噬菌體肽庫(kù)篩選的基本過(guò)程被一直沿用至今，其流程是將肽庫(kù)中各種肽分別展示在各個(gè)噬菌體表面，眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，通過(guò)與特定的靶標(biāo)進(jìn)行反應(yīng)，使展示特定多肽的噬菌體牢牢吸附在靶標(biāo)上，通過(guò)大約1(Γ15次的洗滌把未結(jié)合和非特異性吸附的噬菌體洗掉，留下與靶標(biāo)特異性結(jié)合的噬菌體，然后用洗脫的方法把特異性吸附的噬菌體從靶標(biāo)上洗脫下來(lái)，通過(guò)感染大腸桿菌使篩選出來(lái)的噬菌體得到擴(kuò)增和富集，然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定，獲得相應(yīng)的多肽序列和功能信息，實(shí)現(xiàn)了高通量篩選。其步驟一般如下①靶分子固定化，一般包被于96 孔板或連接于固相惰性載體上；②將肽庫(kù)的噬菌體與靶分子共同孵育，使靶分子與噬菌體肽庫(kù)液特異性的結(jié)合；③洗去未結(jié)合的噬菌體；④采用酸洗脫或拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫特異性結(jié)合的噬菌體；⑤再次感染大腸桿菌擴(kuò)增陽(yáng)性噬菌體克隆，進(jìn)行下一輪篩選，大約經(jīng)過(guò) 3、輪反復(fù)“吸附一洗脫一擴(kuò)增”的篩選，結(jié)合目的多肽的噬菌體得到高度富集。最后，則可將表面呈現(xiàn)有高親和力的特異性多肽的噬菌體從表達(dá)有各種的多肽噬菌體肽庫(kù)中篩選出來(lái)。近年來(lái)，隨著噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的不斷深入，它在炎癥反應(yīng)的研究中發(fā)揮的作用也越來(lái)越大。以炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的趨化因子為靶標(biāo)，篩選得到與趨化因子具有高親和力的短肽，可以抑制炎癥感染前期產(chǎn)生的趨化因子，從而阻斷機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并且能克服常規(guī)大分子藥物的分子量大、組織滲透性弱、不穩(wěn)定、有免疫原性及體內(nèi)運(yùn)輸能力差的等缺點(diǎn)，為炎癥反應(yīng)藥物的開(kāi)發(fā)研究提供了新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)抗炎反應(yīng)的常規(guī)大分子藥物的上述不足，提供一種炎癥前期趨化因子拮抗肽及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種炎癥前期趨化因子拮抗肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。表達(dá)SEQ ID NO: 1所示多肽的噬菌體。一種篩選炎癥前期趨化因子拮抗肽的方法，包括以下步驟
(1)內(nèi)毒素刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生趨化因子，離心收集上清液，分離純化趨化因子；
(2)噬菌體十二肽庫(kù)的親和篩選以步驟(1)中細(xì)胞上清液作為靶標(biāo)，加入噬菌體十二肽庫(kù)與靶標(biāo)結(jié)合，酸性洗脫液洗脫，篩選出的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，此篩選步驟進(jìn)行4輪，第4輪不再擴(kuò)增，直接保存?zhèn)溆茫?br> (3)對(duì)步驟(2)所得噬菌體進(jìn)行陽(yáng)性篩選分析，分別進(jìn)行結(jié)合活性分析、競(jìng)爭(zhēng)抑制分析和趨化因子生成抑制分析，篩選陽(yáng)性單克隆噬菌體；
(4)陽(yáng)性單克隆噬菌體DNA的測(cè)序及序列分析，獲得炎癥前期趨化因子拮抗肽。上述步驟(1)所述親和篩選是第1輪將LPS加入到無(wú)LPS刺激的人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液，包被過(guò)夜后加封閉液封閉，洗滌后加入原始肽庫(kù)溶液，緩慢搖動(dòng)，收集未結(jié)合的噬菌體液；用未結(jié)合的噬菌體液加入到經(jīng)過(guò)LPS刺激24h的人外周血單核細(xì)胞上清液中，收集洗脫液進(jìn)行擴(kuò)增；第2輪用第1輪獲得的噬菌體擴(kuò)增液與經(jīng)過(guò)LPS刺激24h的人外周血單核細(xì)胞上清液結(jié)合，收集洗脫液擴(kuò)增 ’第3輪重復(fù)第2輪的步驟，第4輪重復(fù)第3輪的步驟，噬菌體洗脫液保存。所述噬菌體十二肽庫(kù)為美國(guó)New England Biolabs公司構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)。所述酸性洗脫液為TBST，且第1輪篩選時(shí)TBST中Tween-20的濃度為0. 1 %，第 2輪篩選時(shí)TBST中Tween-20的濃度為0. 3%，第3輪篩選時(shí)TBST中Tween-20的濃度為 0. 5%。步驟(2)中第1輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間lh，第2輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間40min，第3輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間20min，第4輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間為10分鐘；4輪洗脫時(shí)間均在IOmin以內(nèi)。炎癥前期趨化因子拮抗肽在制備阻斷炎癥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
1.本發(fā)明利用LPS刺激人外周血單核細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停@得廣譜炎性趨化因子拮
抗肽
在病理?xiàng)l件下，許多毒素、炎癥感染均可以損傷內(nèi)皮屏障的功能，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增高，血液中的有形成分和血漿蛋白質(zhì)滲出，引起組織水腫，加劇臟器損傷，從而造成組織器官功能障礙。因此，血管內(nèi)皮受損目前已被視為創(chuàng)傷、休克、感染等多種疾病和綜合癥發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)。過(guò)度炎癥性疾病的特征是炎癥細(xì)胞的過(guò)度激活及炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放。炎癥細(xì)胞主要包括單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板等。革蘭陰性菌及其主要致病成分內(nèi)毒素是感染性炎癥最為常見(jiàn)的致病因素。LPS是內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分，LPS刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞，使之失控性激活可引起大量炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，IOyg /mL刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC) M小時(shí)后，細(xì)胞上清液中炎性介質(zhì)大量釋放，趨化因子 IL-8、MCP-I、IL-I、IL-6、RANTES、TNF-a、SCYA3、SCYBlO 在細(xì)胞上清液的含量均比刺激前大大的增加，有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)毒素刺激細(xì)胞后，IL-8的量達(dá)到了 5. 86 土 0.68 ng/ml。因此我們采用了 IOyg /mL LPS作為刺激劑，人外周血單核細(xì)胞(PBMC) 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，成功建立了體外炎癥細(xì)胞模型，可以獲得廣譜炎癥前期趨化因子拮抗肽。2.采用噬菌體展示技術(shù)篩選炎癥前期趨化因子拮抗肽
噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)是近些年建立和發(fā)展的利用噬菌體表達(dá)外源基因的一項(xiàng)新技術(shù)。 噬菌體展示技術(shù)通過(guò)親和篩選出與靶分子結(jié)合的多肽，即讓多肽模擬天然配體的結(jié)合部位與靶分子結(jié)合，直接測(cè)知配體與受體的結(jié)合位點(diǎn)，多肽序列可以通過(guò)測(cè)定噬菌體所插入的外源DNA序列而得知。它實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的有效轉(zhuǎn)換，提供了高效率的篩選系統(tǒng)。用噬菌體表面展示技術(shù)篩選與配體結(jié)合的多肽時(shí)，不需了解配體的空間結(jié)構(gòu)及其活性結(jié)構(gòu)域，同時(shí)可以直接利用噬菌體單克隆，分析篩選的多肽分子與配體的結(jié)合及其對(duì)配體生物學(xué)效應(yīng)的影響。噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)是探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子、探測(cè)未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位的有利工具，在蛋白分子相互識(shí)別的研究、新型疫苗的研制以及疾病治療等研究領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。目前，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)開(kāi)發(fā)小分子多肽藥物仍是近年來(lái)十分活躍的研究領(lǐng)域，并取得了不少進(jìn)展。如應(yīng)用該技術(shù)分別獲得了促血小板生成素和促紅細(xì)胞生成素的模擬小分子肽，它們的長(zhǎng)度均只有天然分子的十分之一左右，與天然分子無(wú)一級(jí)序列上的同源性，但能夠激活各自的受體，在體內(nèi)外都具有相應(yīng)的生物活性。此外，在艾滋病的研究方面也取得了一些進(jìn)展。如Meta A等人以抗CCR5單克隆抗體2D7為靶標(biāo)，用噬菌體肽庫(kù)進(jìn)行篩選，得到了十五個(gè)氨基酸組成的短肽，該肽能夠模擬CCR5與趨化因子MIP-la、RANTES、 MIP-10的結(jié)合部位，并且能抑制M嗜性HIV的感染。Ferrer Μ.等以HIV的外殼蛋白gpl20 為靶標(biāo)，通過(guò)噬菌體肽庫(kù)篩選得到兩個(gè)12肽，這兩個(gè)肽沒(méi)有明顯的序列相似性，但都能與 gpl20結(jié)合，并且能抑制gpl20與CD4的相互作用。本發(fā)明選用噬菌體展示技術(shù)，不必考慮炎性因子空間結(jié)構(gòu)和活性結(jié)構(gòu)域等因素，可以省去很多步驟，節(jié)省時(shí)間。3.在篩選過(guò)程中在以下方面對(duì)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)
(1)靶分子純度在噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的篩選過(guò)程中，靶分子的純度是第一需要考慮的， 若用于篩選的靶分子中混有其它的干擾物質(zhì)，將會(huì)大大影響靶分子與配體結(jié)合的特異性。 我們采用的是LPS刺激細(xì)胞的上清液作為靶標(biāo)，上清液中含有大量的培養(yǎng)液、細(xì)胞碎片及其他的雜蛋白，為了除去這些干擾因素，在LPS刺激前，將人外周血單核細(xì)胞(PBMC)轉(zhuǎn)入無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)，脂多糖刺激細(xì)胞M小時(shí)后，離心除去細(xì)胞碎片，再根據(jù)趨化因子的分子量大小在8-10kDd# 40mL細(xì)胞上清液超濾濃縮到4mL，使培養(yǎng)液中的趨化因子濃度大大增加，再用透析帶(截留范圍6000-8000)透析細(xì)胞上清液，透析出培養(yǎng)基中的小分子無(wú)機(jī)物質(zhì)，這樣使細(xì)胞上清液中的趨化因子得到了粗純化，為成功地篩選到趨化因子的結(jié)合肽提供了保證。(2)細(xì)胞上清液的非特異性結(jié)合采用表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞上清液作為靶標(biāo)比以純化的蛋白作為靶標(biāo)更具復(fù)雜性。機(jī)體在脂多糖未刺激前，會(huì)分泌正常的細(xì)胞因子，當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)后，刺激因子如脂多糖會(huì)刺激炎性細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量趨化因子，包括IL-8、MCP-U RANTES、SCYA3、SCYBlO等。為了篩選到機(jī)體炎癥前期釋放的炎癥趨化因子的廣譜拮抗劑， 排除脂多糖未刺激之前機(jī)體正常分泌的細(xì)胞因子對(duì)篩選的干擾，我們?cè)谶M(jìn)行每一輪親和篩選之前，都將噬菌體肽庫(kù)預(yù)先與培養(yǎng)M小時(shí)后的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)上清液孵育2小時(shí)，以去除與脂多糖未刺激前人外周血單核細(xì)胞(PBMC)上清液中分泌的正常細(xì)胞因子結(jié)合的噬菌體，然后再將未結(jié)合的噬菌體與LPS刺激后的細(xì)胞上清液進(jìn)行篩選。同時(shí)，為了降低噬菌體與人外周血單核細(xì)胞(PBMC)上清液的非特異性結(jié)合，將孵育的溫度放在4°C進(jìn)行。(3)肽庫(kù)的選擇在肽類分子與蛋白質(zhì)識(shí)別過(guò)程中，肽的最佳長(zhǎng)度在8-12個(gè)氨基酸之間，其中起主要作用的是5-8個(gè)氨基酸殘基，甚至是2-3個(gè)氨基酸殘基。較長(zhǎng)的肽鏈更能保證結(jié)合部位的完整性。因此，在篩選過(guò)程中選用的是美國(guó)New England Biolabs公司構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，它是將隨機(jī)十二肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(PlII)上，因而是一個(gè)組合文庫(kù)。所展示的十二肽表達(dá)在PlII的N末端，S卩成熟蛋白的第一個(gè)氨基酸就是隨機(jī)十二肽的第一個(gè)氨基酸，十二肽后面是一段短小的間隔多肽， 由Gly-Gly-Gly-Ser組成，然后是野生型pill蛋白。該肽庫(kù)滴度為1. 5X 1013pfu/ml，肽的隨機(jī)多樣性為2.7X109，受體菌為E.coli ER2738?？梢哉J(rèn)為，隨機(jī)12肽庫(kù)與7肽庫(kù)具有相同的多樣性，但卻分布在12肽范圍內(nèi)。該文庫(kù)對(duì)于那些要求其結(jié)合位點(diǎn)具有7個(gè)或更少數(shù)目的殘基，但此結(jié)合位點(diǎn)又不能被包含在7殘基“框架”內(nèi)的靶分子是非常有用的。另外， 12殘基足可以折疊成短的結(jié)構(gòu)元件，這對(duì)要求淘選構(gòu)象型配體的靶分子可能是有用的。(4)去污劑的濃度噬菌體展示肽庫(kù)的親和篩選過(guò)程，去污劑的濃度對(duì)篩選的結(jié)果有重要的影響。由于在原始肽庫(kù)中與靶分子有親和力的配體分子數(shù)量是相當(dāng)少的，若在第一輪篩選時(shí)去污劑的濃度過(guò)高，將會(huì)導(dǎo)致配體分子的丟失，因此，為了能淘選到與靶分子結(jié)合更強(qiáng)的噬菌體，通常隨著淘選輪數(shù)的增加，TBST洗滌液中Tween-20的濃度也隨之增加。 在其后的篩選過(guò)程中，由于配體分子經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，其數(shù)量大大增加，這時(shí)再將去污劑的濃度提高，將會(huì)使篩選到高親和力配體分子的可能性大大增加。文獻(xiàn)表明篩選過(guò)程中，各輪淘選中的使用濃度分別為0. 1%、0. 3%、0. 5%，有效避免了非特異性噬菌體的吸附。因此，我們?cè)诤Y選過(guò)程中，洗滌液TBST中Tween-20的濃度分別選0. 1 %、0. 3%和0. 5%，并且延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，有效提高了篩選到高親和力配體分子的可能性。最終，通過(guò)四輪的篩選，噬菌體克隆回收率從9.20X 10_8增加到5.09X 10_5，目標(biāo)噬菌體克隆得到了有效富集。(5)結(jié)合時(shí)間和洗脫時(shí)間噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)與趨化因子結(jié)合時(shí)間越短，越容易淘選到快速結(jié)合的肽，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)，越容易篩選到解離速度慢的多肽。因此可以通過(guò)縮短結(jié)合時(shí)間和延長(zhǎng)洗脫時(shí)間的方式來(lái)提高篩選配體的親和性。俞海青等對(duì)Gly-HCl洗脫液 (pH2. 2)的洗脫時(shí)間進(jìn)行了研究，結(jié)果表明當(dāng)Gly-HCl洗脫液(pH2. 2)反復(fù)洗脫3次，每次洗脫時(shí)間不超過(guò)IOmin時(shí)，噬菌體的感染力幾乎不會(huì)降低；當(dāng)每次洗脫時(shí)間為15min，噬菌體的感染力就會(huì)大大降低。因此本實(shí)驗(yàn)中各輪洗脫時(shí)間均控制IOmin內(nèi)在，第一輪淘選的結(jié)合時(shí)間為lh，其后時(shí)間逐漸縮短。4.本發(fā)明的拮抗肽具有以下優(yōu)點(diǎn)
噬菌體展示技術(shù)篩選出來(lái)的模擬短肽作為藥物有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)分子量小、無(wú)免疫原性、比較安全；結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，功能較明確、特異性強(qiáng)，毒副作用??；易于合成，生產(chǎn)成本低； 合成的多肽純度較高，不存在熱原問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)。早期活性多肽的分離提取主要來(lái)自天然動(dòng)植物、昆蟲(chóng)等生物體內(nèi)，這些方法周期長(zhǎng)、提取復(fù)雜且成本高。目前主要是從生物肽庫(kù)(噬菌體、細(xì)菌、酵母菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示肽庫(kù))內(nèi)篩選生物活性多肽，利用此方法篩選生物活性多肽領(lǐng)域主要包括抗菌活性肽、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、抗凝肽、多肽疫苗和多肽導(dǎo)向藥物等，這對(duì)藥物的篩選有深刻的影響意義。炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎因素引起組織損害而產(chǎn)生的一種基本病理過(guò)程，和許多難以治愈的自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、心血管疾病、免疫缺陷疾病(如艾滋病) 及老年性癡呆等嚴(yán)重疾病具有密切關(guān)系。大量研究結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切交織，參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子眾多，其中尤以趨化因子IL-8、MCP-1、IL-U IL_6、RANTES, TNF-a、SCYA3、SCYBlO等與炎癥的病理過(guò)程關(guān)系最為密切。因此，通過(guò)降低或控制上述炎性趨化因子活性可以達(dá)到治療炎癥、腫瘤及心血管等疾病的目的。以炎性趨化因子為靶標(biāo)建立拮抗劑的新型篩選模型，對(duì)噬菌體十二肽庫(kù)進(jìn)行篩選，有可能獲得相應(yīng)趨化因子的拮抗劑，這些拮抗劑通過(guò)和天然配基(炎性趨化因子受體)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合趨化因子，可以達(dá)到抑制炎性趨化因子分泌、治療炎癥等疾病的目的。我們從噬菌體12肽庫(kù)中篩選出多肽可特異阻斷炎癥前期趨化因子的分泌，具有多肽類藥物的優(yōu)點(diǎn)。篩選出來(lái)的拮抗肽(SEQ ID NO: 1)以機(jī)體炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的多種炎性趨化因子為靴標(biāo)，包括 IL-8、MCP-I、IL-I、IL_6、RANTES、TNF_a、SCYA3、SCYB10，這對(duì)于以單一趨化因子作為靶標(biāo)的拮抗劑，有更廣泛的拮抗性。由于機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)相互作用、錯(cuò)綜復(fù)雜的系統(tǒng)，從一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，很難取得明顯效果；另一方面炎癥反應(yīng)可能存在其它未知的炎性介質(zhì)，因此，以內(nèi)毒素刺激細(xì)胞后的細(xì)胞上清液作為靶標(biāo)， 可以模擬炎癥時(shí)期機(jī)體內(nèi)的各種趨化因子的變化，篩選到炎癥前期炎性趨化因子體系的廣譜拮抗劑，從而應(yīng)用到炎癥反應(yīng)的治療過(guò)程中。該類模型的篩選與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究相比，其拮抗性廣譜性強(qiáng)，靈敏度高，無(wú)放射性污染的危害，具有突出創(chuàng)新性；同時(shí)也為闡明抗炎免疫藥作用機(jī)理提供了研究工具，因而有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。已獲得的上述多肽序列在進(jìn)一步深入研究的基礎(chǔ)上，有可能發(fā)展成為炎癥疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腫瘤等疾病有效的新藥，應(yīng)用前景光明。


圖1.本發(fā)明篩選方法技術(shù)路線圖； 圖2.細(xì)胞上清液超濾濃縮流程圖3.宿主ER2738菌株在LB-Tet液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線； 圖4.噬菌體在IPTG-Xgal平板上形成的藍(lán)色噬菌斑，其中A為第1輪篩選滴度測(cè)定結(jié)果，B為第2輪篩選滴度測(cè)定結(jié)果，C為第3輪篩選滴度測(cè)定結(jié)果，D為第4輪篩選滴度測(cè)定
結(jié)果；
圖5. IL-8各濃度的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖6.噬菌體克隆對(duì)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)分泌IL-8抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖7.噬菌體DNA的電泳結(jié)果；
圖8.噬菌體克隆DNA測(cè)序結(jié)果，下劃線部分為外源融合肽DNA序列； 圖9.陽(yáng)性噬菌體克隆的展示肽與IL-8RB的序列同源性比較結(jié)果； 圖10. Kyte & Doolittle平均疏水性輪廓分析圖，A為12肽(SEQ ID N0:1)的疏水輪廓，B為IL-8RB上10(Γ117位氨基酸的疏水性輪廓。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所用到的材料人靜脈血、人外周血單核細(xì)胞(PBMC)和RPMI1640 培養(yǎng)基(購(gòu)自HyClone公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)試劑盒和大腸桿菌菌種 ER2738 (New England Biolabs 公司)、LPS (Sigma 公司)、透析袋 D36mm Xh419 (北京鼎國(guó))、牛血清白蛋白和甘氨酸(Sigma公司)、HRP標(biāo)記羊抗M13單克隆抗體 (JfnfA Pharmacia實(shí)施例1內(nèi)毒素刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生趨化因子 1.外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)
(1)購(gòu)買人靜脈血3mL，加入鋰肝素抗凝管中混勻，等量PBS液稀釋，小心而緩慢地將細(xì)胞混合液加在人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，P為1. 077)上面，1500rpm水平離心20min。 單個(gè)核細(xì)胞懸于分離液的表面，呈乳白色層，將該層細(xì)胞吸出，移入另一個(gè)無(wú)菌離心管中，
(2)用3mLPBS液離心洗滌單個(gè)核細(xì)胞2 3次，每次離心速750rpm，IOmin,去除上清，最后用不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基離心洗滌1次，去除上清。加入Iml含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，用試管將管底的細(xì)胞沉淀洗脫下來(lái)，移到培養(yǎng)皿內(nèi)，再加入完全培養(yǎng)基直到鋪滿底部。將培養(yǎng)皿放到5 % C02、37 °C潮濕C02孵箱，培養(yǎng)M h。(3)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，漂浮的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，貼壁的為外周血單核細(xì)胞，貼壁細(xì)胞數(shù)〉90 %用于實(shí)驗(yàn)?；蛑苯淤?gòu)買外周血單核細(xì)胞進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。
2.內(nèi)毒素刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)
人外周血單核細(xì)胞(PBMC)轉(zhuǎn)入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)，細(xì)胞完全貼壁后，加入LPS(終濃度為10 μ g/mL),置37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時(shí)，以刺激趨化因子的分泌。3.細(xì)胞上清液趨化因子的粗純化
超濾濃縮細(xì)胞上清液4°C 1500rpm離心15min，去除細(xì)胞碎片，收集上清液，根據(jù)趨化因子的分子量在8 10kD，利用超濾濃縮和透析，對(duì)細(xì)胞上清液中的趨化因子進(jìn)行粗純化， 流程圖見(jiàn)圖2。(1)加入15mL滅菌的鈍化溶液(5% SDS溶液)到超濾離心管(截留分子量5000) 中。蓋上蓋子，室溫下讓柱子在溶液中浸浴至少1小時(shí)；
(2)倒出離心管中的鈍化液，然后用滅菌水沖洗柱子。為了保證除去殘留的鈍化溶液， 加入15mL蒸餾水到柱子里，IOOOOg離心lOmin，棄去濾液；
(3)將40mL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，超濾濃縮到4mL；
(4)用含50mmol/LNaCl的20mmol/L pH8. 0 iTris-HCl緩沖液透析上清液過(guò)夜(截留范圍 6000-8000)。實(shí)施例2噬菌體十二肽庫(kù)的親和篩選 1.宿主ER2738菌株的保藏與活化
宿主ER2738菌株在4°C條件下保存3_5天后，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)F因子會(huì)丟失， 同時(shí)失去四環(huán)素抗性特征，因此采用-70°C凍藏保存，具體方法如下
將肽庫(kù)試劑盒中的ER2738菌株IOyL接入裝有3mL LB-Tet液體培養(yǎng)基的試管中，于37°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)約9小時(shí)。將該培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入裝有20mL LB-Tet液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)5_6小時(shí)。將上述20mL培養(yǎng)液分裝于40支2mL凍存管中，每管0.5mL，再加入等體積滅菌甘油，充分混勻后置于-70°C冰箱中凍存。每次用前取凍存管1支，融化后全部轉(zhuǎn)入20mL LB-Tet液體培養(yǎng)基中，37°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到所需A600為止。2.宿主ER2738菌株生長(zhǎng)曲線的繪制
取凍存管1支接于20mL LB-Tet液體培養(yǎng)基中，于37°C、150 rpm振蕩培養(yǎng)，每隔 1小時(shí)取樣，測(cè)定樣品600nm下吸光值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A600值為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
進(jìn)入宿主菌的噬菌體的增殖是通過(guò)利用宿主原有的蛋白、氨基酸和堿基等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行其自身的核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成而得以完成的，因此只有當(dāng)宿主菌處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，侵染的噬菌體才能夠獲得最佳的增殖條件。所以，準(zhǔn)確掌握宿主菌的生長(zhǎng)規(guī)律非常重要。同時(shí)，宿主ER2738菌株是一種雄性大腸桿菌，其編碼F纖毛的F因子在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中極易失去，而缺乏F纖毛的大腸桿菌不能被M13噬菌體所侵染，因此噬菌體侵染宿主菌的最佳時(shí)機(jī)應(yīng)選在宿主菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中前期。測(cè)定大腸桿菌ER2738的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，宿主ER2738菌株在LB-Tet液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)池后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，選用對(duì)數(shù)前期即2 4h的宿主菌培養(yǎng)物進(jìn)行噬菌體的侵染。3.噬菌體肽庫(kù)的親和篩選第1輪篩選
(1)收集無(wú)LPS刺激的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)上清液，加入脂多糖(終濃度為 10 μ g/mL)，將其包被于96微孔板中，4°C密閉濕盒中孵育過(guò)夜，封閉液4°C封閉池，洗滌微孔板，然后，加入11 μ 1原始肽庫(kù)溶液于包被好人外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)上清液的微孔中，4°C，緩慢搖動(dòng)池；收集未結(jié)合的噬菌體液，重復(fù)一次上述步驟。(2) LPS刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC) 24h的上清液用包被液配制成濃度為 100 μ 1/ml，加入96微孔板中，150 μ 1/孔，在4°C密閉濕盒中孵育過(guò)夜。(3)次日倒掉包被液，將平板置于干凈的紙巾上用力拍甩以去除殘余溶液，孔中加滿封閉液，4°C密閉濕盒內(nèi)孵育池。(4)洗滌棄封閉液，用TBST (TBS +0.1% [V/V] Tween-20)緩沖液洗板6次，每次均旋轉(zhuǎn)以使微孔的底部及邊緣均被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液。此操作要在潔凈超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作要快以避免微孔板干燥。(5)結(jié)合取10μ1步驟(1)中未結(jié)合的噬菌體肽庫(kù)溶液，用TBST稀釋100 μ 后，加到已包被好的微孔中，室溫下微量振蕩器上緩慢振蕩lh。(6)洗滌棄掉未結(jié)合噬菌體，倒置板在干凈的紙巾上拍甩除去殘余溶液。按(3) 中所述方法用TBST緩沖液洗板10次，每次換一干凈紙巾以避免交叉污染。(7)洗脫每孔加入 100 μ 1 0.2 M Glycine-HCl (ρΗ 2.2)，1 mg/ml BSA，轉(zhuǎn)搖不超過(guò)lOmin。(8)中和洗脫液轉(zhuǎn)移至預(yù)先已加好15 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ 9. 1)的微離心管中，用微量移液器混勻。(9)滴定取10 μ 中和洗脫液用LB培養(yǎng)基稀釋，測(cè)滴度，其余進(jìn)行擴(kuò)增。(10)接種環(huán)挑取少量-70°C凍存的E.coli ER2738菌種，劃線接種于LB瓊脂板上，翻轉(zhuǎn)平皿，37 °C孵箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。(11)挑取ER2738單菌落，加入5ml LB培養(yǎng)基中，在37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng) 4.釙，轉(zhuǎn)速 225rpm。(12)將余下的洗脫物和200 μ 1菌液加入到盛有20ml LB培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，在37°C恒溫?fù)u床擴(kuò)增4. 5h，轉(zhuǎn)速225rpm。(13)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至離心管中，4°C，10000rpm，離心lOmin。將上清夜轉(zhuǎn)入另一離心管中，同樣條件再離心。(14)將上清液的80%轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入1/6上清液體積的PEG/NaCl，混合均勻后4°C沉降過(guò)夜。(15)將PEG/NaCl沉降液于4°C，IOOOOrpm,離心15min，棄上清夜，再短暫離心，
吸去殘留上清液。(16)沉淀重懸于1 ml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入1. 5mL微量離心管中，4°C，IOOOOrpm離心5 min使殘余細(xì)胞沉淀。(17)上清液轉(zhuǎn)入另一微量離心管，重新以1/6上清液體積的PEG/NaCl再沉降，冰上孵育60 min后，4°C，IOOOOrpm離心10 min，用微量移液器吸去殘余上清。
(18)沉淀物重懸于200 μ TBS, 0. 02% NaN3中，離心1 min，沉淀任何殘余的不溶物，上清液轉(zhuǎn)入新鮮管中，此即為擴(kuò)增后的洗脫物。(19)用LB/IPTG/Xgal平板測(cè)擴(kuò)增后的噬菌體滴度，4°C貯存。(20)再包被一個(gè)板或孔準(zhǔn)備第2輪淘選時(shí)用。第2輪篩選
方法同上，取第1輪篩選的噬菌體擴(kuò)增液1-2 X IO11 pfu的噬菌體量，經(jīng)過(guò)結(jié)合、洗脫、 擴(kuò)增后，分別測(cè)定洗脫液(KT1-IO-4稀釋)和擴(kuò)增后(KT8-IO-11稀釋)的噬菌體滴度，在清洗步驟中將Tween的濃度增至0. 3% (ν/ν)，結(jié)合時(shí)間減少為40min。第3輪篩選
步驟基本同第1輪篩選。TBST溶液中Tween-20濃度[V/V]增加到0.5%，結(jié)合時(shí)間減少為20min。第4輪篩選
步驟基本同第3輪篩選，結(jié)合時(shí)間減少為lOmin，噬菌體洗脫液不再擴(kuò)增，貯于4°C備用。4.滴度測(cè)定
(1)接種環(huán)挑取少量-70°C凍存E.coli ER2738菌種，劃線接種于LB瓊脂板上，翻轉(zhuǎn)平皿，37 °C孵箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。(2)無(wú)菌牙簽挑取ER2738單菌落至5ml LB培養(yǎng)基中，在37°C恒溫?fù)u床擴(kuò)增 4. 5h至對(duì)數(shù)中期(0D_-0. 5)，轉(zhuǎn)速225rpm。(3)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，微波爐融化上層瓊脂，分成3 ml等份于滅菌試管中，每個(gè)噬菌體稀釋度一管。保存于45°C備用。(4) 37°C預(yù)溫LB/IPTG/Xgal平板，每個(gè)噬菌體稀釋度取一個(gè)平板備用。(5)在LB中準(zhǔn)備10倍系列稀釋的噬菌體。擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)物上清=IO8-IO11 ； 未擴(kuò)增的淘選洗脫物=IO1-IO4tj每個(gè)稀釋度換一新鮮吸頭，使用帶濾芯吸頭以避免交叉污染。(6)當(dāng)菌體培養(yǎng)物達(dá)對(duì)數(shù)中期，分成200 μ 等份于微量離心管中，每個(gè)噬菌體稀釋度一管。(7)每管加入10 μ 不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育1_5 min。(8)將感染細(xì)胞加入45°C預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當(dāng)傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開(kāi)。(9)待平板冷卻5 min后，倒置于37°C培養(yǎng)過(guò)夜。(10)檢查平板，計(jì)數(shù)有 IO2個(gè)噬菌斑的平板上的藍(lán)斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μι噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度
權(quán)利要求
1.一種炎癥前期趨化因子拮抗肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.表達(dá)權(quán)利要求1所述多肽的噬菌體。
3.一種篩選權(quán)利要求1所述多肽的方法，包括以下步驟(1)內(nèi)毒素刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，離心收集上清液，分離純化趨化因子；(2)噬菌體十二肽庫(kù)的親和篩選以步驟(1)中細(xì)胞上清液作為靶標(biāo)，加入噬菌體十二肽庫(kù)與靶標(biāo)結(jié)合，酸性洗脫液洗脫，篩選出的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，此篩選步驟進(jìn)行4輪，第4輪不再擴(kuò)增，直接保存?zhèn)溆茫?3)對(duì)步驟(2)所得噬菌體進(jìn)行陽(yáng)性篩選分析，分別進(jìn)行結(jié)合活性分析、競(jìng)爭(zhēng)抑制分析和趨化因子生成抑制分析，篩選陽(yáng)性單克隆噬菌體；(4)陽(yáng)性單克隆噬菌體DNA的測(cè)序及序列分析，獲得炎癥前期趨化因子拮抗肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)所述親和篩選第1輪將LPS加入到無(wú)LPS刺激的人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液，包被過(guò)夜后加封閉液封閉，洗滌后加入原始肽庫(kù)溶液，緩慢搖動(dòng)，收集未結(jié)合的噬菌體液；用未結(jié)合的噬菌體液加入到經(jīng)過(guò)LPS刺激 24h的人外周血單核細(xì)胞上清液中，收集洗脫液進(jìn)行擴(kuò)增；第2輪用第1輪獲得的噬菌體擴(kuò)增液與經(jīng)過(guò)LPS刺激24h的人外周血單核細(xì)胞上清液結(jié)合，收集洗脫液擴(kuò)增；第3輪重復(fù)第 2輪的步驟，第4輪重復(fù)第3輪的步驟，噬菌體洗脫液保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述噬菌體十二肽庫(kù)為美國(guó)New England Biolabs公司構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述酸性洗脫液為TBST，且第1輪篩選時(shí) TBST中Tween-20的濃度為0. 1 %，第2輪篩選時(shí)TBST中Tween-20的濃度為0. 3 %，第3 輪篩選時(shí)TBST中Tween-20的濃度為0. 5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中第1輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間lh，第 2輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間40min，第3輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間20min，第4輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間為10分鐘；4輪洗脫時(shí)間均在IOmin以內(nèi)。
8.權(quán)利要求1所述炎癥前期趨化因子拮抗肽在制備阻斷炎癥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種炎癥前期趨化因子拮抗肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。所述拮抗肽氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。上述拮抗肽的篩選方法，是用內(nèi)毒素刺激PBMC細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，離心收集上清液，分離純化趨化因子；以細(xì)胞上清液作為靶標(biāo)，加入噬菌體十二肽庫(kù)與靶標(biāo)結(jié)合，酸性洗脫液洗脫，篩選出的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，此篩選步驟進(jìn)行4輪，第4輪不再擴(kuò)增；對(duì)第4輪所得噬菌體進(jìn)行陽(yáng)性篩選分析，分別進(jìn)行結(jié)合活性分析、競(jìng)爭(zhēng)抑制分析和趨化因子生成抑制分析，篩選陽(yáng)性單克隆噬菌體；對(duì)陽(yáng)性單克隆噬菌體DNA進(jìn)行測(cè)序及序列分析，獲得炎癥前期趨化因子拮抗肽。本發(fā)明的拮抗肽可特異阻斷炎癥前期趨化因子的分泌，且具有生產(chǎn)成本低，特異性強(qiáng)、功效明確，安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102260324SQ20111015079
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者孫晗笑, 張光, 李秀英, 莫雪梅, 黃曉泉 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)