專利名稱：從人分離的編碼C6β－趨化因子Lkn－1的cDNA的制作方法
背景技術(shù)：
趨化因子具有生物活性如HIV-1的抑制作用，免疫調(diào)節(jié)作用，白細(xì)胞遷移，和抗造血干細(xì)胞分裂的抑制作用(參見，Cocchi，F(xiàn).等人，科學(xué)，2701811(1995)；Wolpe，S.D.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，167570(1988)；Graham，G.J.等人，自然，344442(1990)；Broxmeyer，H.E.等人，血液，761110(1990)；Youn，B.-S.等人，免疫學(xué)雜志，1552661-2667(1995))。
趨化因子還與偶聯(lián)跨膜區(qū)G蛋白質(zhì)的受體結(jié)合以活化白細(xì)胞，并且一些受體也可以在HIV-1感染過程中用作協(xié)同受體(參見Oh，K.-O.等人，免疫學(xué)雜志，1472978(1991)；Alkabatih，G.等人，科學(xué)，2721955(1996))。例如，在β-趨化因子(CC趨化因子)受體的8個(gè)亞型，即CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8中有4個(gè)亞型CCR4、CCR6、CCR7、CCR8顯示對(duì)一種物質(zhì)有高親和力，而CCR1、CCR2、CCR3、和CCR5具有結(jié)合各種趨化因子的親和力。
迄今，本領(lǐng)域已知屬于β-趨化因子亞家族的9個(gè)趨化因子(參見，Wilson，S.D.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1711301(1990)；Modi，W.S.等人，人類遺傳學(xué)，84185(1990))。在它們中間，小鼠MRP-1(“mMRP-1”，MIP(巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì))-相關(guān)蛋白質(zhì)-1或C10)(參見，Orlofsky，A.等人，細(xì)胞調(diào)節(jié)，2403(1991))和小鼠MRP-2(“mMRP-2”)(參見Youn，B.-S.等人，免疫學(xué)雜志，1552661(1995))與其它β-趨化因子的區(qū)別在于它們具有兩個(gè)額外的半胱氨酸殘基，從而形成第三個(gè)二硫鍵，并且它們的N末端區(qū)非常長。根據(jù)以前的發(fā)現(xiàn)，將它們劃分為C6β-趨化因子。
在上述情況下，有重要的原因需開發(fā)和研制人的新MRP，因?yàn)槿说腗RP可以用作治療HIV-1感染或在化學(xué)治療或放射性治療過程中保護(hù)骨髓干細(xì)胞的潛在藥物。
所以，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供編碼C6β-趨化因子(Lkn-1)的新cDNA和由此推斷的氨基酸序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述的Lkn-1 cDNA的表達(dá)載體和利用該載體轉(zhuǎn)化的重組微生物。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供從所述的微生物制備重組Lkn-1的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供利用重組的Lkn-1保護(hù)骨髓細(xì)胞不受細(xì)胞毒性抗癌藥物或不受輻射毒害的方法。


圖1(B)顯示了Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)和mMRP-2的第87到第110位氨基酸序列(SEQ ID NO3)的比較。
圖2是顯示從各種人細(xì)胞系分離的總RNA的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的結(jié)果的圖。
圖3顯示了Lkn-1cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)和由此推斷出的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
圖4顯示了成熟的Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO7)與mMRP-1(SEQ ID NO8)，mMRP-2(SEQ ID NO9)，hMIP-1α(SEQ ID NO10)，mMIP-1α(SEQ ID NO11)和hMIPβ(SEQ ID NO12)的那些序列的比較。
圖5(A)是顯示Lkn-1對(duì)骨髓中的骨髓細(xì)胞的集落形成的影響的圖。
圖5(B)是顯示Lkn-1對(duì)脾中髓樣細(xì)胞的集落形成的影響的圖。
圖5(C)是顯示Lkn-1對(duì)骨髓中骨髓細(xì)胞的增殖速度的影響的圖。
圖5(D)是顯示Lkn-1對(duì)在脾中的髓樣細(xì)胞的增殖速度的影響的圖。
圖6(A)是顯示Lkn-1對(duì)骨髓中骨髓細(xì)胞的增殖速度的依賴劑量的抑制效果的圖。
圖6(B)是顯示Lkn-1對(duì)脾中髓樣細(xì)胞的增殖速度的依賴劑量的抑制效果的圖。
圖7(A)是顯示Lkn-1對(duì)骨髓中CFU-GM的增殖速度的依賴時(shí)間的抑制效果的圖。
圖7(B)是顯示Lkn-1對(duì)骨髓中BFU-E的增殖速度的依賴時(shí)間的抑制效果的圖。
圖7(C)是顯示Lkn-1對(duì)骨髓中CFU-GEMM的增殖速度的依賴時(shí)間的抑制效果的圖。
圖7(D)是顯示Lkn-1對(duì)脾中CFU-GM的增殖速度的依賴時(shí)間的抑制效果的圖。
圖7(E)是顯示Lkn-1對(duì)脾中BFU-E的增殖速度的依賴時(shí)間的抑制效果的圖。
圖7(F)是顯示Lkn-1對(duì)脾中CFU-GEMM的增殖速度的依賴時(shí)間的抑制效果的圖。
圖8(A)是顯示重組的Lkn-1和RANTES(受活化調(diào)節(jié)，正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌)吸引淋巴細(xì)胞的趨化性的圖。
圖8(B)是顯示重組的Lkn-1和hMIP-1α吸引單核細(xì)胞的趨化性的圖。
圖8(C)是顯示重組的Lkn-1和IL-8吸引嗜中性粒細(xì)胞的趨化性的圖。
圖9(A)顯示受加入一系列RANTES和重組Lkn-1刺激的淋巴細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光。
圖9(B)顯示受加入一系列重組Lkn-1和RANTES刺激的淋巴細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光。
圖9(C)是顯示受加入一系列hMIP-1α和重組Lkn-1刺激的單核細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光。
圖9(D)顯示受加入一系列重組Lkn-1和hMIP-1α刺激的單核細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光。
圖9(E)顯示受加入一系列IL-8和重組Lkn-1刺激的嗜中性粒細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光的圖。
圖9(F)是顯示受加入一系列重組Lkn-1和IL-8刺激的嗜中性粒細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光。
圖10(A)顯示受加入一系列各種試劑刺激的表達(dá)CCR1的HOS細(xì)胞系中測量的相對(duì)熒光。
圖10(B)顯示受加入一系列各種試劑刺激的表達(dá)CCR3的HOS細(xì)胞系中測量的相對(duì)熒光。
圖10(C)是顯示依賴于Lkn-1和hMIP-1α濃度的鈣應(yīng)答的峰幅的圖。
圖10(D)是顯示依賴于Lkn-1、eotaxin和RANTES的濃度的鈣應(yīng)答的峰幅的圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述為了從人細(xì)胞系分離Lkn-1基因，本發(fā)明人首先克隆了可以用于制備探針的Lkn-1基因的外顯子。即，利用HindIII消化人基因組DNA，在瓊脂糖凝膠上分離，以32P-標(biāo)記的mMRP-2 cDNA(參見Youn，B.S.等人，免疫學(xué)雜志，1552661(1995))作為探針，利用Southern印跡分析獲得可以與mMRP-2雜交的7.0kb的DNA片段。然后，為了從7.0kb的HindIII消化的DNA片段分離出Lkn-1 cDNA的外顯子序列，利用HindIII完全消化人基因組DNA，并且在瓊脂糖凝膠上分離，以獲得7.0kb的DNA片段。將這樣獲得的片段插入載體，并將這樣獲得的載體導(dǎo)入宿主。在轉(zhuǎn)化后，選擇顯示與所述的mMRP-2 cDNA探針雜交的集落。在從該集落分離出7.0kb的DNA片段和利用A1uI消化后，克隆出了可以與mMRP-2 cDNA雜交的202bp的DNA片段。然后，確定該片段的核苷酸序列，該序列區(qū)分出來自所述DNA片段的部分內(nèi)含子和外顯子。
然后，為了從人細(xì)胞系克隆出新的Lkn-1 cDNA，制備了如上證實(shí)的允許從Lkn-1外顯子序列擴(kuò)增100bp DNA片段的Lkn-1 PCR引物，并且分別利用從各種人細(xì)胞系分離的總RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR，從而篩選出具有Lkn-1 mRNA的細(xì)胞系。選用如此選出的一個(gè)細(xì)胞系，白細(xì)胞介素-4(IL-4)活化的人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞系，并制備它的cDNA文庫。在另一方面，用所述THP-1細(xì)胞系的總RNA作為模板并用所述的Lkn-1PCR引物進(jìn)行RT-PCR，制備Lkn-1外顯子的100bp-DNA片段。將如上構(gòu)建的THP-1細(xì)胞系的cDNA文庫與Lkn-1外顯子的100bp-DNA片段的探針雜交。結(jié)果，獲得了顯示陽性反應(yīng)的Lkn-1cDNA。
所述的Lkn-1 cDNA的核苷酸序列的確定和推斷的氨基酸序列表明Lkn-1 cDNA是一個(gè)新的DNA，Lkn-1 cDNA的開放讀碼框架編碼含有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的113個(gè)氨基酸，并且推斷出含有92個(gè)氨基酸的成熟Lkn-1蛋白質(zhì)的分子量是10162道爾頓。發(fā)現(xiàn)Lkn-1沒有潛在的N-糖基化位點(diǎn)，并且屬于具有除了β-趨化因子家族通常出現(xiàn)的四個(gè)半胱氨酸殘基外還具有如在mMRP-1和mMRP-2中的兩個(gè)半胱氨酸的C6β-趨化因子家族。
在表達(dá)載體中插入如上克隆的新的Lkn-1 cDNA，并且將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞如大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞以表達(dá)重組的Lkn-1。
另一方面，研究了重組Lkn-1對(duì)骨髓干細(xì)胞和起源于人骨髓和脾的祖細(xì)胞的骨髓抑制活性，證明重組Lkn-1在體內(nèi)和體外都以依賴濃度和時(shí)間的方式抑制集落的形成和髓樣細(xì)胞的增殖。另外，觀察到重組的Lkn-1強(qiáng)烈地吸引人外周血中嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而引起趨化性，和在所述的細(xì)胞中誘導(dǎo)鈣流。特別是發(fā)現(xiàn)重組的Lkn-1與RANTES和hMIP-1α的受體結(jié)合，并且不與IL-8的受體結(jié)合(雖然它強(qiáng)烈吸引嗜中性粒細(xì)胞而引起趨化性，象IL-8一樣)。此外，發(fā)現(xiàn)重組的Lkn-1的受體是CC趨化因子受體1(CCR1)和CCR3。重組的Lkn-1是比hMIP-1α或RANTES更強(qiáng)的CCR1拮抗劑(已知hMIP-1α和RANTES能與CCR1結(jié)合)，并且它是比RANTES更強(qiáng)的CCR3拮抗劑，雖然它是比eotaxin弱的受體拮抗劑。
顯示上面提到的特征的本發(fā)明的重組Lkn-1可以用于抗體生產(chǎn)，HIV-1感染的治療，在化學(xué)治療或放射性治療過程中骨髓干細(xì)胞的保護(hù)，和白血病的抑制等等。
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但不能將這些實(shí)施例看成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1Lkn-1基因組DNA的外顯子的克隆為了克隆與來自人的mMRP-2同源的基因組DNA，利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、XbaI和XhoI消化總?cè)嘶蚪MDNA，在1.0％瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離，并以32p-標(biāo)記的mMRP-2 cDNA作為探針，利用Southern印跡分析來獲得7.0kb的顯示陽性信號(hào)的HindIII片段。
為了制備所述HindIII片段的亞文庫，利用HindIII完全消化100Fg的人基因組DNA，在20V，在1％的瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離16小時(shí)。然后，利用Gene-clean試劑盒(Bio101，美國)分離出接近7.0kb的DNA片段并且將其插入經(jīng)HindIII消化的去磷酸化pBluescript SK+載體(Stratagene，美國)。利用這樣制備的重組載體，輔助以電穿孔來轉(zhuǎn)化Electro-max(Gibco-BRL，美國)感受態(tài)細(xì)胞，并且在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。利用mMRP-2探針與形成的約2×105個(gè)集落雜交。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)集落顯示雜交的陽性信號(hào)，并且含有插入的7.0kb的DNA。
為了分離來自所述的7.0kb的DNA片段的外顯子序列，從所述顯示了雜交的陽性信號(hào)的集落分離出含有插入了7.0kb的DNA的pBluescript SK+載體，利用AluI消化，在1.5％瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離，通過Southern印跡分析來克隆出與mMRP-2 cDNA雜交的202bp的DNA片段。
確定所述的202bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，找到內(nèi)含子和翻譯成氨基酸的一部分外顯子(參見，圖1(A))。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一部分外顯子的氨基酸序列(SEQ ID NO2)顯示與mMRP-2的第87到第110個(gè)氨基酸有50％的同源性，并在Lkn-1中，mMRP-1和mMRP-2中常見的兩個(gè)另外的半胱氨酸中的第二個(gè)半胱氨酸(表示為“*”)是保守的(參見圖1(B))。在圖1(B)中，框線顯示在Lkn-1和mMRP-2中保守的氨基酸。實(shí)施例2Lkn-1 cDNA的克隆為了克隆來自人細(xì)胞系的Lkn-1 cDNA，根據(jù)圖1(B)公開的氨基酸序列(SEQ ID NO2)首先制備允許擴(kuò)增100bp的Lkn-1外顯子的PCR引物，即正向引物5’-TTCCTCACCAAGAAGGGG-3’(SEQ IDNO13)和反向引物5’-CTTTTTCATGCAATCCTG-3’(SEQ ID NO14)。然后，分別利用實(shí)施例1中制備的202bp-DNA片段，以100Fg/毫升的由IL-4活化24小時(shí)的人單核THP-1細(xì)胞系(ATCC TIB202)的總RNA、巨噬細(xì)胞系U937(ATCC CTL1593)的總RNA和HL-60細(xì)胞系(ATCC CCL240)的總RNA作為模板進(jìn)行PCR(參見圖2)。
在圖2中，泳道1到4分別顯示了利用202bp-DNA片段作為陽性對(duì)照，THP-1細(xì)胞系的總RNA，U937細(xì)胞系的總RNA和HL-60細(xì)胞系的總RNA進(jìn)行的PCR的結(jié)果，泳道M顯示了作為DNA大小標(biāo)記的100bp序列梯。正如圖2中所示，由IL-4活化的THP-1細(xì)胞系產(chǎn)生了Lkn-1 mRNA。
為了制備THP-1 cDNA文庫，從由IL-4活化的THP-1細(xì)胞系分離人mRNA，利用Time Saver cDNA試劑盒(Pharmacia Biotech，美國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈cDNA，并且與BstXI銜接頭(Invitrogen，美國)連接。然后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠上的分級(jí)分離以便分離出0.5kb或更大的cDNA，將分離的cDNA插入進(jìn)利用BstXI消化的PRc/CMV載體(Invitrogen，美國)以制備cDNA文庫。將該cDNA文庫與作為探針的上面PCR擴(kuò)增的Lkn-1外顯子的100bp-DNA片段雜交。作為結(jié)果，分離到了顯示陽性信號(hào)的一個(gè)cDNA克隆。實(shí)施例3Lkn-1 cDNA的核苷酸序列圖3顯示了實(shí)施例2中獲得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ IDNO4)，和由此推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。在圖3中，下面劃線的是信號(hào)肽，在框線中的序列是圖1(B)顯示的Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，它可以在THP-1 cDNA文庫的篩選中用作探針，并且(***)表示為翻譯終止密碼。
正如圖3所示，Lkn-1 cDNA(SEQ ID NO6)的開放讀碼框架編碼含有形成信號(hào)肽的21個(gè)氨基酸和形成分子量被推斷為10162道爾頓的成熟蛋白質(zhì)的92個(gè)氨基酸的113個(gè)氨基酸。另外，在Lkn-1的推斷出的氨基酸序列(SEQ ID NO5)中沒有發(fā)現(xiàn)N-糖基化位點(diǎn)。
圖4顯示了成熟Lkn-1(SEQ ID NO7)的氨基酸序列與mMRP-1(SEQ ID NO8)、mMRP-2(SEQ ID NO9)、hMIP-1α(SEQ ID NO10)(參見Youn，B.S.等人，免疫學(xué)雜志，1552661(1995))、mMIP-1α(SEQ IDNO11)(參見Kown，B.S.和Weissman，S.M.，美國科學(xué)院年報(bào)，861963(1989))和hMIP-1β(SEQ ID NO12)(參見Sherry，B.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1682251(1988))中的那些的比較。在圖4中，框線和(·)分別表示四個(gè)保守的半胱氨酸殘基和另外的兩個(gè)半胱氨酸殘基。正如圖4所示，表明(1)在β-趨化因子家族中常見的四個(gè)半胱氨酸殘基的頭兩個(gè)半胱氨酸殘基之前，Lkn-1具有長的N末端區(qū)；(2)Lkn-2屬于正如在mMRP-1和mMRP-2中，除了具有β-趨化因子家族常見的四個(gè)半胱氨酸殘基外還具有另兩個(gè)半胱氨酸殘基的C6β-趨化因子家族。另外，發(fā)現(xiàn)成熟的Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO7)顯示與mMRP-1(SEQ ID NO8)或mMRP-2(SEQ ID NO9)只有43％的同源性，與hMIP-1α(SEQ ID NO10)只有40％的同源性，雖然Lkn-1是作為人的mMRP-2對(duì)應(yīng)物而分離的。實(shí)施例4重組Lkn-1的表達(dá)實(shí)施例4-1在大腸桿菌中重組Lkn-1的表達(dá)為了只表達(dá)作為重組蛋白質(zhì)的沒有推斷的信號(hào)肽的成熟的Lkn-1蛋白質(zhì)，利用實(shí)施例2中克隆的Lkn-1 cDNA作為模板，用下面的PCR引物和Pfu聚合酶(Stratagene，美國)進(jìn)行成熟的Lkn-1的開放讀碼框架的PCR擴(kuò)增正向引物5’-CGAATTCCATATGCAGTTCACAAATGATGCAGAG-3’(SEQ ID NO15)反向引物5’-CGCCGCTCGAGTTGAGTAGGGCTTCAGC-3’(SEQ ID NO16)利用NdeI/XhoI消化如此擴(kuò)增出的DNA片段，并且克隆進(jìn)入質(zhì)粒pET21a(Novagen，美國)。將這樣構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET21a-Lkn-1并且導(dǎo)入大腸桿菌XL-1Blue。該重組質(zhì)粒pET21a-Lkn-1允許在成熟的Lkn-1的N末端具有另外一個(gè)甲硫氨酸殘基和在C末端具有另外6個(gè)組氨酸的重組Lkn-1的表達(dá)。
將這樣制備的轉(zhuǎn)化體命名為‘大腸桿菌(XL-1 Blue)hMRP-2’，并且在1996年9月10日以保藏號(hào)ATCC98166保藏于國際保藏授權(quán)單位，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD20852，美國)。
培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體以表達(dá)Lkn-1并且獲得內(nèi)含體，將內(nèi)含體溶解于20毫升變性緩沖液(6摩爾/升鹽酸胍，20毫摩爾/升Tris-HCl，pH7.9，500毫摩爾/升NaCl，4毫摩爾/升正-辛基吡喃葡糖苷)并且離心獲得上清液。然后，利用活化的Ni-柱(Novagen，美國)和肝素瓊脂糖柱(Pharmacia精細(xì)化學(xué)品公司，美國)進(jìn)行層析純化His-標(biāo)記的重組Lkn-1。電泳表明該重組Lkn-1的分子量約為12千道爾頓。實(shí)施例4-2在昆蟲細(xì)胞中重組Lkn-1的表達(dá)為了表達(dá)含有信號(hào)肽的重組Lkn-1，將含有信號(hào)肽序列的Lkn-1cDNA插入在N末端的PstI限制位點(diǎn)和在C末端的XbaI限制位點(diǎn)，并且通過PCR擴(kuò)增。然后，分離這樣擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并將其插入用PstI/XbaI消化的PVL1392載體(Invitrogen，美國)中以構(gòu)建重組質(zhì)粒PVL1392-Lkn-1。然后，利用所述的重組質(zhì)粒和AcNPV(Autographacalifornia核多角體桿狀病毒)轉(zhuǎn)染Sf-21昆蟲細(xì)胞以便將所述的重組質(zhì)粒中的Lkn-1 cDNA轉(zhuǎn)移到AcNPV中。根據(jù)病毒粒子是陰性閉塞的特征分離AcNPV-Lkn-1病毒噬菌斑，并讓之在無血清Ex-細(xì)胞400培養(yǎng)基(JRH生物科學(xué)，美國)中的Sf-21昆蟲細(xì)胞中生長以用于以后使用。
在Ex-細(xì)胞400培養(yǎng)基中培養(yǎng)的高5細(xì)胞系(Invitrogen，美國)表達(dá)重組的Lkn-1，并且利用HiTrap-肝素柱(藥學(xué)生物技術(shù)公司，美國)和HiTrap-SP柱(藥學(xué)生物技術(shù)公司，美國)純化該表達(dá)出的Lkn-1。Western印跡分析表明在純化后立即得到分析的重組的Lkn-1的分子量約為12千道爾頓。實(shí)施例5重組Lkn-1的骨髓抑制活性實(shí)施例5-1重組Lkn-1在體外抑制骨髓細(xì)胞的集落形成因?yàn)橐恍│?趨化因子在體外具有骨髓抑制活性，所以我們研究了在實(shí)施例4-1中純化得到的重組Lkn-1對(duì)人骨髓中存在的骨髓祖細(xì)胞形成集落的影響。即，為了由CFU-GM(集落形成單位-粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞)形成骨髓細(xì)胞的集落，在含有10％FBS的0.3％瓊脂培養(yǎng)基上以5×104細(xì)胞/毫升涂布利用Ficoll-Hypaque梯度(1.070gm/厘米3，西格瑪化學(xué)公司，美國)離心獲得的低密度人骨髓細(xì)胞，并且利用rhGM-CSF(重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落形成因子，100U/毫升，Immunex公司，美國)+rhSLF(重組人青灰因子，50納克/毫升，Immunex公司，美國)來刺激上述人骨髓細(xì)胞。在另一方面，為了由CFU-GM、BFU-E(爆發(fā)集落形成單位-紅細(xì)胞)和CFU-GEMM(集落形成單位-粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞)形成骨髓細(xì)胞的集落，在含有30％FBS的1％甲基纖維素培養(yǎng)基上以5×104細(xì)胞/毫升涂布所述的骨髓細(xì)胞，并且利用rhEPO(重組人紅細(xì)胞生成素，1單位/毫升，Amgen公司，美國)、rhIL-3(重組人白細(xì)胞介素-3，100單位/毫升，Immunex公司，美國)或rhSLF進(jìn)行刺激。
在刺激后，在5％CO2和5％O2的環(huán)境下在BNP-210溫育器(TabaiESPEC公司，美國)中培養(yǎng)細(xì)胞，在14天后計(jì)數(shù)集落的數(shù)目(參見表1)。在這一實(shí)驗(yàn)中，重組Lkn-1以3-50納克/毫升的濃度加入平板。
表1.重組Lkn-1對(duì)低密度的人骨髓細(xì)胞的集落形成的影響
a.在反應(yīng)溶液中沒有加入重組Lkn-1的實(shí)驗(yàn)組b用于刺激集落形成的生長因子。
c與對(duì)照比較的變化的水平(％)d與對(duì)照比較，變化的水平是顯著的(p＜0.001)。
從上面表1可見，重組的Lkn-1以依賴濃度的方式明顯地抑制CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM形成集落。與對(duì)照比較，集落形成的抑制水平是22-63％。在另一方面，發(fā)現(xiàn)重組的Lkn-1不能抑制由GM-CSF單獨(dú)刺激的CFU-GM或由EPO單獨(dú)刺激的BFU-E形成集落，這證明重組的Lkn-1對(duì)可由各種生長因子刺激的不成熟的祖細(xì)胞具有抑制效果。實(shí)施例5-2重組Lkn-1體內(nèi)抑制骨髓細(xì)胞的增殖在體內(nèi)評(píng)估Lkn-1的生物活性。即，給C3H/HeJ小鼠靜脈內(nèi)注射純化的Lkn-1并且分別測定粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞(CFU-GM)、紅細(xì)胞系(BFU-E)和多潛能祖細(xì)胞(CFU-GEMM)的絕對(duì)數(shù)目和在骨髓和脾中它們的增殖速度利用0.1毫升無菌無致熱原鹽水或在無菌的無致熱源的鹽水中稀釋的8微克純化的Lkn-1經(jīng)尾靜脈給C3H/HeJ小鼠注射。在注射后24小時(shí)，類似于在實(shí)施例5-1中，在股骨的骨髓和在小鼠的脾中制備低密度的骨髓細(xì)胞。然后，在0.3％瓊脂培養(yǎng)基上涂布CFU-GM，并且利用10％PWM小鼠脾細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激。同樣，在0.9％甲基纖維素培養(yǎng)基上分別涂布BFU-E和CFU-GEMM，并且利用1單位的rhEPO、0.1毫摩爾/升氯高鐵原卟啉和1％ PWM小鼠脾細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激。在這一實(shí)驗(yàn)中，分別以7.5×104和1.0×106細(xì)胞/毫升的濃度涂布骨髓和脾細(xì)胞。在刺激后，在實(shí)施例5-1中所述的相同條件下培養(yǎng)細(xì)胞，在溫育5到7天后計(jì)數(shù)集落的數(shù)目(參見圖5(A)和5(B))。在另一方面，借助于比活性為20居里/毫摩爾的氚標(biāo)記的胸腺嘧啶(50微居里/毫升)殺死技術(shù)，測量DNA合成期(即，細(xì)胞周期的S期)期祖細(xì)胞的比例，以細(xì)胞周期中的S期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)確定CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的循環(huán)速度，(參見圖5(C)和5(D))，所述殺死技術(shù)基于在細(xì)胞與氚標(biāo)記的熱胸腺嘧啶脈沖接觸20分鐘后形成的集落數(shù)目比與相當(dāng)量的冷胸腺嘧啶接觸時(shí)形成的集落數(shù)目在體外計(jì)算的減少。圖5(A)到5(D)表明Lkn-1快速降低了骨髓干/祖細(xì)胞形成的集落的數(shù)目和在骨髓和脾中的它們的增殖速度(即，細(xì)胞循環(huán)速度)。在另一方面，評(píng)估了骨髓、脾和血液中帶核的細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照比較沒有受到明顯的影響。
為了研究Lkn-1的這些抑制效果的劑量依賴性，除了Lkn-1的濃度從0.1變化到20微克外，如上所述類似地確定CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的循環(huán)速度(參見圖6(A)和6(B))。正如圖6(A)和6(B)可見，證明在骨髓和脾中，來自接受了3到10微克Lkn-1的小鼠的CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM處于非循環(huán)或慢循環(huán)狀態(tài)，而來自接受了0.1到1微克Lkn-1的小鼠的細(xì)胞的循環(huán)速度沒有變化，而只有脾的CFU-GEMM的循環(huán)速度有變化。Lkn-1降低整個(gè)細(xì)胞的循環(huán)速度達(dá)80到90％，并且BFU-E和CFU-GEMM似乎是對(duì)Lkn-1比對(duì)CFU-GM更敏感。
另外，為了研究Lkn-1的這些抑制效果的時(shí)間依賴性，將8微克Lkn-1注射給C3H/HeJ小鼠，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測來自骨髓和脾的CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的細(xì)胞循環(huán)狀態(tài)(參見圖7(A)到7(F))。正如圖7(A)到7(F)所示，Lkn-1的抑制效果是依賴于時(shí)間的并且在骨髓和脾中是可逆的。即，在12小時(shí)中，Lkn-1使CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM處于以非循環(huán)或慢循環(huán)狀態(tài)，并且在72小時(shí)后將它們恢復(fù)到對(duì)照水平。
Lkn-1對(duì)體內(nèi)骨髓細(xì)胞增殖的劑量和時(shí)間依賴性和可逆的抑制效果強(qiáng)烈表明Lkn-1在保護(hù)正常的造血細(xì)胞不受細(xì)胞毒性抗癌藥物的毒害或放射性的輻射中具有潛在的臨床用途。實(shí)施例6研究作為趨化因子的重組Lkn-1為了研究重組的Lkn-1是否可能引起趨化性，利用Ficoll-Hypaque梯度(1.077gm/厘米3)離心獲得了健康男人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。然后，基于它們附著于塑料表面的活性，從如此獲得的PBMC中分離單核細(xì)胞，重復(fù)所述的分離步驟2次。在這一實(shí)驗(yàn)中，單核細(xì)胞分離步驟后殘留的細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞獲得。通過Diff-Quick(Baxter科學(xué)公司，美國)染色的cytospin的顯微鏡檢測確定這樣獲得的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的純度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的純度分別為90％和88％。
同樣，利用3％的葡聚糖T500(藥學(xué)精細(xì)化學(xué)公司，美國)進(jìn)行沉淀并且利用Ficoll-Hypaque梯度離心獲得紅血細(xì)胞。在低滲溶液中溶解如此獲得的紅血細(xì)胞以獲得人嗜中性粒細(xì)胞。通過形態(tài)學(xué)確定這樣獲得的嗜中性粒細(xì)胞的純度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)純度是95％。
在含有0.5％低內(nèi)毒素BSA(西格瑪化學(xué)公司，美國)和20毫摩爾Hepes的RPMI 1640(Gibco，美國)中分別以2×106細(xì)胞/毫升和8×106細(xì)胞/毫升懸浮上面分離的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。在HBSS中以1×106細(xì)胞/毫升懸浮嗜中性粒細(xì)胞。
然后，如下確定在48孔微室(Neuroprobe，美國)中細(xì)胞遷移的水平。只用緩沖溶液(對(duì)照)或含有重組Lkn-1、hMIP-1α(PeproTech，美國)、RANTES(PeproTech，美國)、IL-8(PeProTech，美國)或eotaxin(PeproTech，美國)的緩沖液填充微室的下面的孔，用50F1所述的細(xì)胞懸浮液填充上面的孔。通過適當(dāng)?shù)臎]有聚乙烯吡咯烷酮的過濾器分配孔成下層的孔和上層的孔。當(dāng)利用嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞時(shí)，過濾器的孔的直徑是3Fm。當(dāng)利用單核細(xì)胞時(shí)，它是5Fm。在37℃溫育所述的微室1小時(shí)(嗜中性粒細(xì)胞)，2小時(shí)(單核細(xì)胞)或4小時(shí)(淋巴細(xì)胞)。從室中取出過濾器并且洗滌。固定在過濾器上的細(xì)胞，并且利用Diff-Quick染色。然后，計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目(參見圖8(A)到8(C))。
在圖8(A)到8(C)中，將在趨化因子處理的實(shí)驗(yàn)組中遷移細(xì)胞的數(shù)目除以對(duì)照中的遷移細(xì)胞的數(shù)目獲得的值表示為趨化指數(shù)。圖8(A)是顯示重組Lkn-1和RANTES吸引淋巴細(xì)胞的趨化性的圖。圖8(B)是重組Lkn-1和hMIP-1α吸引單核細(xì)胞的趨化性的圖。圖8(C)是顯示重組Lkn-1和IL-8吸引嗜中性粒細(xì)胞的趨化性的圖。
正如圖8(A)到8(C)中所示，表明重組Lkn-1是吸引人外周血嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的強(qiáng)趨化因子。而且，重組Lkn-1顯示能以相似于IL-8的方式吸引嗜中性粒細(xì)胞的趨化性(參見圖8(C))，和以相似于hMIP-1α的方式吸引單核細(xì)胞的趨化性(參見圖8(B))；并且它顯示了以濃度依賴方式(濃度可高達(dá)10Fg/毫升的Lkn-1)吸引淋巴細(xì)胞的提高的趨化性，雖然顯示出它的趨化性比RANTES的趨化性水平低(參見圖8(A))。實(shí)施例7重組Lkn-1對(duì)鈣流影響的分析實(shí)施例7-1在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中鈣流的分析研究了重組Lkn-1是否可以結(jié)合受體以活化淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞而誘導(dǎo)鈣流出。還檢測了與其它抗受體的拮抗劑的競爭性關(guān)系。利用MSIII熒光計(jì)(Photon技術(shù)國際公司，美國)測量分離的外周血白細(xì)胞的亞群(淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，和嗜中性粒細(xì)胞)中鈣離子的變化，從而確定受體的活化。即，在37℃將細(xì)胞與2FM fura-2AM(西格瑪化學(xué)公司，美國)反應(yīng)45分鐘，洗滌兩次，在含有0.05％BSA的HBSS(pH7.4)中以1×107細(xì)胞/毫升的濃度再懸浮。在受攪拌的、套水小杯中加入2毫升細(xì)胞懸浮液，在37℃，在340納米和380納米連續(xù)使之活化。在加入25納摩爾/升拮抗劑(重組Lkn-1，hMIP-1α，RANTES，IL-8或eotaxin)之前或之后，在510納米測量所發(fā)出的熒光(參見圖9(A)到9(F))。
在圖9(A)到9(F)中，相對(duì)熒光表示為在340納米和380納米活化的熒光的相對(duì)比例。圖9(A)顯示了受加入一系列RANTES和重組的Lkn-1刺激的淋巴細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光；圖9(B)顯示了受加入一系列重組的Lkn-1和RANTES刺激的淋巴細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光；圖9(C)顯示了受加入一系列hMIP-1α和重組的Lkn-1刺激的單核細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光；圖9(D)顯示了受加入一系列重組的Lkn-1和hMIP-1α刺激的單核細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光；圖9(E)顯示了受加入一系列IL-8和重組的Lkn-1刺激的嗜中性粒細(xì)胞中測量的相對(duì)熒光；圖9(F)顯示了受加入一系列重組的Lkn-1和IL-8刺激的嗜中性粒細(xì)胞測量的相對(duì)熒光。如圖9(A)-9(F)所示，發(fā)現(xiàn)在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中重組的Lkn-1誘導(dǎo)鈣流入。
另一方面，在偶聯(lián)G蛋白質(zhì)的受體連續(xù)地與具有與受體信號(hào)相同的結(jié)合位點(diǎn)的配體接觸短時(shí)間時(shí)，所述的受體脫敏感。當(dāng)表達(dá)受體的所述細(xì)胞受到重組Lkn-1的刺激時(shí)，這樣的現(xiàn)象就發(fā)生。
正如圖9(A)到9(F)中所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)受到RANTES和接著hMIP-1α刺激時(shí)，重組Lkn-1使淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞完全脫敏感(參見圖9(B)和9(D))。但是，當(dāng)受到重組的Lkn-1刺激時(shí)，RANTES或hMIP-1α不完全使淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞脫敏感(參見圖9(A)和9(C))，這證明重組Lkn-1與RANTES和hMIP-1α共享受體，比RANTES和hMIP-1α誘導(dǎo)了更多的鈣流。另外，在IL-8的進(jìn)一步刺激過程中重組的Lkn-1沒有使嗜中性粒細(xì)胞脫敏感，雖然重組的Lkn-1誘導(dǎo)了嗜中性粒細(xì)胞中的鈣流(參見圖9(F))。另外，在重組Lkn-1的進(jìn)一步刺激過程中IL-8也沒有使嗜中性粒細(xì)胞脫敏感(參見圖9(E))。所以，清楚地證明了重組的Lkn-1不與IL-8共享受體雖然它是在嗜中性粒細(xì)胞中如IL-8一樣誘導(dǎo)鈣流的強(qiáng)因子。實(shí)施例7-2在表達(dá)CC趨化因子受體的細(xì)胞系中分析鈣流研究了重組Lkn-1是否可以活化表達(dá)CC或CXC趨化因子的受體的細(xì)胞系，因?yàn)樵趯?shí)施例7-1中分析發(fā)現(xiàn)重組Lkn-1活化了可以被RANTES和hMIP-1α活化的受體。除了使用表達(dá)重組CCR1、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5或CXCR4的HOS細(xì)胞系(參見AIDS研究和NIH的參考反應(yīng)試劑程序，美國)而代替使用分離的白細(xì)胞亞群外，以相似于實(shí)施例7-1的方式進(jìn)行分析。已知hMIP-1α與CCR1和CCR5結(jié)合，而RANTES與CCR1、CCR3和CCR5結(jié)合。
圖10(A)顯示了受加入一系列各種試劑刺激的表達(dá)CCR1的HOS細(xì)胞系中測量的相對(duì)熒光，圖10(B)顯示受加入一系列各種試劑刺激的表達(dá)CCR3的HOS細(xì)胞系中測量的相對(duì)熒光。
正如圖10(A)和10(B)中所示，表明在表達(dá)CCR1或CCR3的HOS細(xì)胞系中重組的Lkn-1強(qiáng)烈誘導(dǎo)鈣流。但是，在表達(dá)其它受體的HOS細(xì)胞系中沒有觀察到重組Lkn-1誘導(dǎo)的鈣流。
同樣，正如圖10(A)中所示，在受重組Lkn-1刺激后，CCR1-HOS細(xì)胞不再受hMIP-1α或RANTES的另外刺激，而在hMIP-1α或RANTES刺激后重組Lkn-1對(duì)CCR1-HOS細(xì)胞的進(jìn)一步刺激卻不受影響。
圖10(A)表明重組Lkn-1是比hMIP-1α或RANTES更強(qiáng)烈的抗CCR1拮抗劑，這可以得到正如圖10(C)所示的依賴于重組Lkn-1和hMIP-1α的濃度的鈣應(yīng)答清楚地證明。
另外，正如圖10(B)所示，在eotaxin刺激CCR3-HOS細(xì)胞后，在eotaxin或重組Lkn-1進(jìn)一步刺激的過程中CCR3-HOS細(xì)胞差不多完全脫敏感；在以重組Lkn-1刺激后而又以RANTES進(jìn)一步刺激的過程中，CCR3-HOS細(xì)胞差不多完全脫敏感；但是，在以重組Lkn-1或RANTES刺激細(xì)胞后，eotaxin對(duì)CCR3-HOS細(xì)胞的進(jìn)一步刺激卻沒有受影響。另外，鈣應(yīng)答依賴于eotaxin、重組的Lkn-1和RANTES的濃度；這一點(diǎn)顯示，重組Lkn-1是比RANTES更強(qiáng)的抗CCR3拮抗劑，雖然它不是比eotaxin更強(qiáng)的一個(gè)(參見圖10(D))。
正如上面所清楚說明和證明的，本發(fā)明提供編碼屬于C6β-趨化因子的新Lkn-1蛋白質(zhì)的cDNA和由此推斷的氨基酸序列。Lkn-1 cDNA的開放讀碼框架編碼113個(gè)氨基酸，其中含有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和含有92個(gè)氨基酸的分子量推斷為10162道爾頓的成熟蛋白質(zhì)。利用所述的Lkn-1 cDNA在大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組的Lkn-1，并將之純化，它明顯抑制集落形成和細(xì)胞增殖，吸引嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而引起趨化性，和能與CCR1和CCR3受體結(jié)合。因此，確定可以利用重組Lkn-1蛋白質(zhì)作為在抗體生產(chǎn)、HIV-1感染過程中的治療、在化學(xué)治療或放射性治療過程中保護(hù)骨髓干細(xì)胞和抑制白血病等等的潛在的藥物。
序列表(1)總的信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱株式會(huì)社綠十字；等人(B)街道227，Gugal-Ri，Kiheung-Eup(C)城市Yongin，Kyonggi-Do(D)州無(E)國家韓國(F)郵編(ZIP)449-900(G)電話02-584-0131(H)電傳02-582-6331(ii)發(fā)明題目從人分離的編碼C6β-趨化因子Lkn-1的cDNA(iii)序列數(shù)目16(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度202個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iv)反義沒有(vi)原始來源(A)生物體人(vii)即時(shí)來源
(A)文庫來自人的基因組DNA文庫(xi)SEQ ID NO1的序列描述CTGCCATCAG CAGAGAAAGG AAAAAACAGG CTGTGTTGAC TGGGAAATCT50GAGGAGCAGG GAGGATGGGG CCCCCTGTCT CCATCTGCCC ACACCTCAGT 100TTGTAATCTT TCTCTCCCTT GTTCCCCAGA TTCCTCACCA AGAAGGGGCG 150GCAAGTCTGT GCCAAACCCA GTGGTCCGGG AGTTCAGGAT TGCATGAAAA 200AG 202(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體；人(xi)SEQ ID NO2的序列描述Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser15 10Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys15 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列描述(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體小鼠
(xi)SEQ ID NO3的序列描述Phe Ile Ser Lys Arg Gly Phe Gln Val Cys Ala Asn Pro Ser15 10Asp Arg Arg Val Gln Arg Cys Ile Glu Arg15 20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度582個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)DNA(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體人(vii)即時(shí)來源(A)文庫來自人的DNA文庫(xi)SEQ ID NO4的序列描述CGGAGCCAGG AAGCAGTGAG CCCAGGAGTC CTCGGCCAGC CCTGCCTGCC 50CACCAGGAGG ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTCATGCTTA 100TTGCTGTCCT TGGATCCCAG GCCCAGTTCA CAAATGATGC AGAGACAGAG 150TTAATGATGT CAAAGCTTCC ACTGGAAAAT CCAGTAGTTC TGAACAGCTT 200TCACTTTGCT GCTGACTGCT GCACCTCCTA CATCTCACAA AGCATCCCGT 250GTTCACTCAT GAAAAGTTAT TTTGAAACGA GCAGCGAGTG CTCCAAGCCA 300GGTGTCATAT TCCTCACCAA GAAGGGGCGG CAAGTCTGTG CCAAACCCAG 350TGGTCCGGGA GTTCAGGATT GCATGAAAAA GCTGAAGCCC TACTCAATAT 400AATAATAAAC AGACAAAAGA GGCCAGCCAC CCACCTCCAA CACCTCCTGT 450GAGTTTCTTG GTCTGAAATA CTTAAAAAAT ATATATATTG TTGTGTCTGG 500TAATGAAAGT AATGCATCTA ATAAAGGTAT TCAATTTTTT AACTTTGCTT 550GAGTTTTAAG AGGAAATAAA CTAATATAAA AC582(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度113個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體人(xi)SEQ ID NO5的序列描述Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Ile15 10Ala Val Leu Gly Ser Gln Ala Gln Phe Thr Asn Asp Ala Glu15 20 25Thr Glu Leu Met Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val30 35 40Val Leu Asn Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser45 50 55Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr60 65 70Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe75 80Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly85 90 95Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser100 105 110Ile(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度342個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iv)反義沒有(vi)原始來源(A)生物體人(vii)即時(shí)來源(A)文庫來自人的DNA文庫
(xi)SEQ ID NO6的序列描述ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTCATGCTTA TTGCTGTCCT 50TGGATCCCAG GCCCAGTTCA CAAATGATGC AGAGACAGAG TTAATGATGT 100CAAAGCTTCC ACTGGAAAAT CCAGTAGTTC TGAACAGCTT TCACTTTGCT 150GCTGACTGCT GCACCTCCTA CATCTCACAA AGCATCCCGT GTTCACTCAT 200GAAAAGTTAT TTTGAAACGA GCAGCGAGTG CTCCAAGCCA GGTGTCATAT 250TCCTCACCAA GAAGGGGCGG CAAGTCTGTG CCAAACCCAG TGGTCCGGGA 300GTTCAGGATT GCATGAAAAA GCTGAAGCCC TACTCAATAT AA 342(2)SEQ IDNO7的信息(i)序列特征(A)長度92個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體人(xi)SEQ ID NO7的序列描述Gln Phe Thr Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met Met Ser Lys15 10Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His Phe15 20 25Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro30 35 40Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys45 50 55Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln60 65 70Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met75 80Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser Ile85 90(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)長度95個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體小鼠(xi)SEQ ID NO8的序列描述Gly Leu Ile Gln Ile Met Glu Lys Glu Asp Arg Arg Tyr Asn15 10Pro Pro Ile Ile His Gln Gly Phe Gln Asp Thr Ser Ser Asp15 20 25Cys Cys Phe Ser Tyr Ala Thr Gln Ile Pro Cys Lys Arg Phe30 35 40Ile Tyr Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys Ile Lys Pro Gly45 50 55Ile Ile Phe Ile Ser Arg Arg Gly Thr Gln Val Cys Ala Asp60 65 70Pro Ser Asp Arg Arg Val Gln Arg Cys Leu Ser Thr Leu Lys75 80Gln Gly Pro Arg Ser Gly Asn Lys Val Ile Ala85 90 95(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度101個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體小鼠(xi)SEQ ID NO9的序列描述Gln Ile Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val Gln Ser Ser15 10Leu Lys Ala Gln Gln Gly Leu Glu Ile Glu Met Phe His Met15 20 25Gly Phe Gln Asp Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser30 35 40Arg Ile Gln Cys Ser Arg Phe Ile Gly Tyr Phe Pro Thr Ser45 50 55Gly Gly Cys Thr Arg Pro Gly Ile Ile Phe Ile Ser Lys Arg60 65 70Gly Phe Gln Val Cys Ala Asn Pro Ser Asp Arg Arg Val Gln75 80Arg Cys Ile Glu Arg Leu Glu Gln Asn Ser Gln Pro Arg Thr85 90 95Tyr Tyr Lys100(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度67個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體人(xi)SEQ ID NO10的序列描述Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser15 10Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr15 20 25Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe30 35 40Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu45 50 55Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu60 65(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度66個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體小鼠(xi)SEQ ID NO11的序列描述Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser15 10Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val Glu Val Phe15 20 25Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe Leu30 35 40Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr45 50 55Trp Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu60 65(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度67個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體人(xi)SEQ ID NO12的序列描述Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser15 10Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr15 20 25Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe30 35 40Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu45 50 55Ser Trp Val Gln Glu Val Tyr Tyr Asp Leu Glu60 65(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(vii)即時(shí)來源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO13的序列描述TTCCTCACCA AGAAGGGG(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(vii)即時(shí)來源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO14的序列描述CTTTTTCATG CAATCCTG(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(vii)即時(shí)來源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO15的序列描述CGAATTCCAT ATGCAGTTCA CAAATGATGC AGAG(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(vii)即時(shí)來源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO16的序列描述CGCCGCTCGA GTTGAGTAGG GCTTCAGC
權(quán)利要求
1.人C6β-趨化因子Lkn-1的cDNA，它的核苷酸序列表示如下(SEQ ID NO6)ATG AAG GTC TCC GTG GCT GCC CTC TCC TGC CTC ATG CTT 39ATT GCT GTC CTT GGA TCC CAG GCC CAG TTC ACA AAT GAT 78GCA GAG ACA GAG TTA ATG ATG TCA AAG CTT CCA CTG GAA 117AAT CCA GTA GTT CTG AAC AGC TTT CAC TTT GCT GCT GAC 156TGC TGC ACC TCC TAC ATC TCA CAA AGC ATC CCG TGT TCA 195CTC ATG AAA AGT TAT TTT GAA ACG AGC AGC GAG TGC TCC 234AAG CCA GGT GTC ATA TTC CTC ACC AAG AAG GGG CGG CAA 273GTC TGT GCC AAA CCC AGT GGT CCG GGA GTT CAG GAT TGC 312ATG AAA AAG CTG AAG CCC TAC TCA ATA TAA 342
2.人C6β-趨化因子Lkn-1，它的氨基酸序列表示如下(SEQ IDNO5)Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Ile15 10Ala Val Leu Gly Ser Gln Ala Gln Phe Thr Asn Asp Ala Glu15 20 25Thr Glu Leu Met Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val30 35 40Val Leu Asn Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser45 50 55Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr60 65 70Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe75 80Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly85 90 95Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser100 105 110
3.人C6β-趨化因子Lkn-1的cDNA，其中缺失了第1到第63位核苷酸序列。
4.包括權(quán)利要求1的cDNA的表達(dá)載體。
5.包括權(quán)利要求1的cDNA的表達(dá)載體PVL 1392-Lkn-1。
6.制備重組Lkn-1的方法，包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，以及從培養(yǎng)物中獲得重組的Lkn-1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞。
8.-種重組的Lkn-1，它是由包括如下步驟的方法制備的用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組的Lkn-1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組的Lkn-1，它抑制集落形成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組的Lkn-1，它強(qiáng)烈吸引人外周血中嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而引起趨化性。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組的Lkn-1，它與CCR1和CCR3受體結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組Lkn-1，它與RANTES(受活化調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)的序列)和hMIP-1α(人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)-1α)共享受體，而不與IL-8(白細(xì)胞介素-8)共享受體。
13.一種表達(dá)載體，它包括權(quán)利要求3所述的cDNA。
14.包括權(quán)利要求3所述的cDNA的表達(dá)載體pET21a-Lkn-1。
15.用權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(XL-1 Blue)hMRP-2(ATCC 98166)。
16.制備重組的Lkn-1的方法，該方法包括如下步驟利用權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，和從培養(yǎng)物中獲得重組的Lkn-1。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞。
18.一種重組的Lkn-1，它是由包括如下步驟的方法制備的用權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，和從培養(yǎng)物中獲得重組的Lkn-1。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組的Lkn-1，它抑制集落形成。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組的Lkn-1，它強(qiáng)烈吸引人外周血中嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而以引起趨化性。
21.權(quán)利要求18所述的重組的Lkn-1，它與CCR1和CCR3受體結(jié)合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組的Lkn-1，它與RANTES(受活化調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)的序列)和hMIP-1α(人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)-1α)共享受體，而不與IL-8(白細(xì)胞介素-8)共享受體。
23.保護(hù)骨髓細(xì)胞不受細(xì)胞毒性抗癌藥物毒害或輻射的方法，包括以人C6β-趨化因子Lkn-1給需受保護(hù)的個(gè)體給藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述人C6β-趨化因子Lkn-1是權(quán)利要求8所述的重組的Lkn-1。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中人C6β-趨化因子Lkn-1是權(quán)利要求18所述的重組的Lkn-1。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼屬于C6β－趨化因子并且吸引外周血白細(xì)胞的亞群的新蛋白質(zhì)的cDNA,和利用其表達(dá)載體制備所述蛋白質(zhì)的方法。Lkn－lcDNA的開放讀碼框架編碼含有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的113個(gè)氨基酸,并且推測其中含有92個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)的分子量是10162道爾頓。利用所述的Lkn－lcDNA在大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組的Lkn－1并且純化,它明顯抑制集落的形成和細(xì)胞的增殖,吸引嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而引起趨化性,并且結(jié)合CCR1和CCR3受體。因此,重組的Lkn－1蛋白質(zhì)可以用作生產(chǎn)抗體、治療HIV－1感染、在化學(xué)治療或放射性治療過程中保護(hù)骨髓干細(xì)胞和抑制白血病等等的潛在藥物。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1282371SQ98811574
公開日2001年1月31日 申請(qǐng)日期1998年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月27日
發(fā)明者拜昂·S·夸恩, 尹秉壽, 鄭守一, 樸斗鴻, 白承宰, 李恩京 申請(qǐng)人:株式會(huì)社綠十字