專(zhuān)利名稱：用真菌過(guò)氧酶區(qū)域選擇性羥化脂族烴類(lèi)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有過(guò)氧酶(peroxygenase)活性的多肽用于脂族烴類(lèi)化合物的位點(diǎn)特異性羥化的用途。背景發(fā)現(xiàn)來(lái)自傘菌類(lèi)擔(dān)子菌菌株Agrocybe aegerita (菌株TM-A1)、稱為AaP的過(guò)氧酶氧化芳族醇和醛。AaP過(guò)氧酶從A.aegerita TM Al通過(guò)數(shù)個(gè)步驟的離子層析和SDS-PAGE 純化，其分子量和N端14氨基酸序列在2D電泳之后確定，但并未分離編碼的基因(Ullrich等，2004，Appl. Env. Microbiol. 70(8):4575-4581)。WO 2006/034702 公開(kāi)了使用 Agrocybe aegerita TM Al 的 AaP 過(guò)氧酶對(duì)未活化的烴如萘、甲苯和環(huán)己烷進(jìn)行酶羥化的方法。這亦描述于Ullrich和Hofrichter, 2005, FEBSLetters 579:6247-6250。WO 2008/119780 公開(kāi)了來(lái)自 Agrocybe aegerita、灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea)、Laccaria bicolor和幅毛鬼傘(Coprinus radians)的八種不同的過(guò)氧酶，在本申請(qǐng)中亦示為SEQ ID NO: 1-8。DE 103 32 065 Al 公開(kāi)了通過(guò)使用 Agrocybe aegerita TM Al 的 AaP 過(guò)氧酶從醇通過(guò)中間形成醛酶法制備酸的方法。報(bào)道了迅速和選擇性分光光度法直接檢測(cè)AaP過(guò)氧酶芳族羥化的方法(Kluge等，2007，Appl Microbiol Biotechnol 75:1473-1478)。公知將氧官能團(tuán)直接區(qū)域選擇性導(dǎo)入有機(jī)分子(加氧)在化學(xué)合成中構(gòu)成問(wèn)題。脂族糖的選擇性羥化的催化是特別困難的。其產(chǎn)物可在廣泛種類(lèi)的不同合成中用作重要的中間物。具體而言，烷的化學(xué)強(qiáng)化相對(duì)復(fù)雜，需要強(qiáng)烈的/毒性化學(xué)品/催化劑，并導(dǎo)致一系列不希望的副產(chǎn)物。已知一種胞內(nèi)酶，甲烷單加氧酶(ΜΜ0，EC 14. 13. 25)，使一些烴化合物的末端碳氧合/羥化。所述MMO酶由數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)組分組成，并由甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌(例如莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus))形成；其需要復(fù)合的電子供體如NADH或NADPH,輔助蛋白(黃素還原酶，調(diào)節(jié)蛋白)和分子氧(O2)。MMO的天然底物是甲烷，其氧化為甲醇。作為特別非特異性的生物催化劑，除甲烷之外，MMO還氧合/羥化一系列其他底物如正烷烴及其衍生物，環(huán)烷烴，芳族化合物，一氧化碳和雜環(huán)化合物。該酶在生物技術(shù)中的應(yīng)用目前尚不可能，因?yàn)槠湎翊蟛糠职麅?nèi)酶一樣，難于分離；其具有低穩(wěn)定性；且其所需的共底物相對(duì)昂貴
發(fā)明內(nèi)容
在第一個(gè)方面，本發(fā)明的發(fā)明人提供了在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類(lèi)化合物的任一末端的2或3位進(jìn)行羥化的方法，所述脂族烴類(lèi)化合物具有至少3個(gè)碳并具有在2或3位附接于碳的氫，所述方法包括將所述脂族烴類(lèi)化合物與過(guò)氧化氫和具有過(guò)氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO:9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂族烴類(lèi)化合物是脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在脂質(zhì)的?；哪┒说?或3位進(jìn)行羥化的方法，其包括將所述脂質(zhì)與過(guò)氧化氫和具有過(guò)氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。定義過(guò)氧酶活性術(shù)語(yǔ)“過(guò)氧酶活性”在本文中定義為使用過(guò)氧化氫羥化萘的能力，亦稱作“非特異性過(guò)氧酶”，EC I. 11. 2. I。其為血紅素硫醇鹽蛋白(heme-thiolate protein)。該類(lèi)型的酶包括由傘菌類(lèi)擔(dān)子菌分泌的糖蛋白。它們催化從H2O2將氧原子插入廣泛種類(lèi)的底物，包括芳環(huán)如萘、甲苯、菲、花和對(duì)硝基苯酹，頑固的(recalcitrant)雜環(huán)化合物如批啶、二苯并呋喃，多種醚(導(dǎo)致O-去烷基化)，和烷如丙烷、己烷和環(huán)己烷。其他可由過(guò)氧酶催化的反應(yīng)包括輕化、環(huán)氧化、N-氧化、硫氧化(sulfooxidation)、0_和N-去燒基化、溴化和單電子氧化。它們對(duì)于氯幾乎無(wú)或無(wú)活性。就本發(fā)明而言，過(guò)氧酶活性根據(jù)Kluge等(2007，ApplMicrobiolBiotechnol75:1473-1478)描述的分光光度方法確定。本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8的成熟多肽的過(guò)氧酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”用于本文指從來(lái)源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽如通過(guò)SDS-PAGE確定，為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，其含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多O. 5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99. 5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過(guò)以下實(shí)現(xiàn)通過(guò)公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。
成熟多肽術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”在本文中定義為具有過(guò)氧酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽具有基于N端肽測(cè)序數(shù)據(jù)(Ullrich等,2004, Appl. Env. Microbiol. 70 (8) :4575-4581)(其闡明AaP過(guò)氧酶的成熟蛋白的開(kāi)始部分)的SEQ ID NO: I的位置I至330中所示的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽具有示于SEQ ID NO:2中位置I至328的氨基酸序列。同一性由參數(shù)“同一性”描述的兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000，Trendsin Genetics 16:276-277)的Needle程序，優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本中執(zhí)行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443-453)來(lái)確定。使用的任選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extension penalty)0. 5和EBL0SUM62取代矩陣(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longestidentity) ” (使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的輸出結(jié)果作為百分比同一性，并計(jì)算如下(相同的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見(jiàn)上文)的Needle程序，優(yōu)選3. 0. O或更高版本中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，見(jiàn)上文)來(lái)測(cè)定。使用的任選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL取代矩陣(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性，并計(jì)算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù))修飾術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文中意指對(duì)由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8或其同源序列的成熟多肽組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼此種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可為取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸，以及替代一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈。
發(fā)明詳述具有過(guò)氧酶活性的多肽(過(guò)氧酶)本發(fā)明涉及具有過(guò)氧酶活性的分離的多肽(其優(yōu)選為重組產(chǎn)生的)的用途，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NOiUSEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 的多肽具有至少 50% 同一性，優(yōu)選至少 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 或 98% 同一性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含由一個(gè)或多個(gè)下述基序表示的氨基酸序列，優(yōu)選包含兩個(gè)或更多個(gè)，三個(gè)或更多個(gè)，四個(gè)或更多個(gè)，五個(gè)或六個(gè)下述基序基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有取代、缺失和 / 或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的 SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2，SEQID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 的成熟多肽。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)方面的多肽包含SEQ ID NO: 1,SEQ IDN0:2,SEQ IDNO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列或其具有過(guò)氧酶活性的片段，或由所述氨基酸序列或片段組成；優(yōu)選所述多肽包含SEQ IDNO: 1，SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID N0:8的成熟多肽或由所述成熟多肽組成。優(yōu)選地,氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或結(jié)合域(binding domain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivty)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill, 1979,于TheProteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、VGl/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過(guò)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫腦氨酸、3_ 和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。或者，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells, 1989, Science 244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，過(guò)氧酶活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見(jiàn)Hilton等，1996，J.Biol. Chem. 271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)例如de Vos等，1992，Science 255:306-312 ；Smith等，1992，J.Mol· Biol. 224:899-904 ；fflodaver 等，1992, FEBSLett. 309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來(lái)推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。
能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuff Iing)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如由 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988，Science 241:53-57 ；Bowie 和Sauer, 1989, Proc. NGtl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 ；W0 95/17413;或 WO 95/22625 公開(kāi)的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991, Biochem. 30:10832-10837 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，223，409 ；W0 92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46:145 ；Ner等，1988，DNA 7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQ ID NO: I, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5, SEQ IDNO:6, SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選I。優(yōu)選第一個(gè)方面的多肽由包含于大腸桿菌NN049991中的質(zhì)粒中所含的多核苷酸編碼，所述大腸桿菌NN049991在2008年3月14日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款以登錄號(hào)DSM21289保藏于DSMZ ;或者所述多肽由包含于大腸桿菌NN049992中的質(zhì)粒中所含的多核苷酸編碼，所述大腸桿菌NN049992在2008年3月14日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款以登錄號(hào)DSM 21290 保藏于 DSMZ。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ IDNO: I的氨基酸I至330。還有另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸I至328。
還有另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至344。過(guò)氧化氫過(guò)氧酶所需的過(guò)氧化氫可作為過(guò)氧化氫的水溶液,或作為用于原位產(chǎn)生過(guò)氧化氫的過(guò)氧化氫前體提供。任何在溶解時(shí)釋放可由過(guò)氧酶使用的過(guò)氧化物的固體實(shí)體均可用作過(guò)氧化氫的來(lái)源。當(dāng)溶解于水或合適的水基介質(zhì)時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫的化合物包括但不限于金屬過(guò)氧化物，過(guò)碳酸，過(guò)硫酸，過(guò)磷酸，過(guò)氧酸，烷基過(guò)氧化物，?；^(guò)氧化物，過(guò)氧酯(peroxyesters),尿素過(guò)氧化物,過(guò)硼酸和過(guò)氧羧酸,或它們的鹽。過(guò)氧化氫的另一種來(lái)源是過(guò)氧化氫生成酶系統(tǒng)，如氧化酶和氧還酶的底物。氧化酶和底物的組合的實(shí)例包括但不限于氨基酸氧化酶(參見(jiàn)例如US6，248，575)和合適的氨基酸，葡糖氧化酶(參見(jiàn)例如WO 95/29996)和葡萄糖，乳酸氧化酶和乳酸，半乳糖氧化酶(參見(jiàn)例如WO 00/50606)和半乳糖，以及醛糖氧化酶(參見(jiàn)例如WO 99/31990)和合適的醛 糖。通過(guò)研究EC I. I. 3.，EC I. 2. 3.，EC I. 4. 3.和 EC I. 5. 3.或類(lèi)似的類(lèi)型(根據(jù)International Union of Biochemistry),本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識(shí)別此類(lèi)氧化酶和底物的組合的其他實(shí)例。可在本發(fā)明的方法開(kāi)始時(shí)或過(guò)程中添加過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫源，例如作為過(guò)氧化氫的一次或多次單獨(dú)添加，或連續(xù)地作為補(bǔ)料分批添加。過(guò)氧化氫的通常量對(duì)應(yīng)于0. OOlmM至25mM水平，優(yōu)選0. 005mM至5mM的水平，且特別是0. 01至ImM過(guò)氧化氫的水平。過(guò)氧化氫亦可以對(duì)應(yīng)于0. ImM至25mM的水平，優(yōu)選0. 5mM至15mM的水平，更優(yōu)選ImM至IOmM的水平，且最優(yōu)選2mM至8mM過(guò)氧化氫的水平的量使用。表面活性劑本發(fā)明的方法可包括施用表面活性劑(例如作為洗滌劑配制物的一部分或作為濕潤(rùn)劑)。適合于施用的表面活性劑可以是非離子的(包括半極性的)、陰離子的、陽(yáng)離子和/或兩性離子的；優(yōu)選所述表面活性劑是陰離子的(如線性烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate)、α -烯經(jīng)橫酸酯(alpha-olefinsulfonate)、燒基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂)或非離子的(如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多聚糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烴基衍生物(“葡糖酰胺”))，或其混合物。當(dāng)包括在本發(fā)明方法中時(shí)，表面活性劑的濃度通常為按重量計(jì)約0. 01%至約10%，優(yōu)選約0. 05%至約5%，和更優(yōu)選約0. 1%至約1%。脂族經(jīng)類(lèi)化合物(aliphatichydrocarbons)在本發(fā)明方法中羥化的烴是脂族烴類(lèi)化合物，所述脂族烴類(lèi)化合物具有至少3個(gè)碳的鏈，并具有在2或3位附接于碳的氫。優(yōu)選地，所述脂族烴類(lèi)化合物是烷或烯；更優(yōu)選地，所述脂族烴類(lèi)化合物是烷，如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，或其異構(gòu)體。所述脂族烴類(lèi)化合物是直鏈或支化的，但非環(huán)化的，因?yàn)槲稽c(diǎn)特異性羥化對(duì)環(huán)烴類(lèi)化合物是不可能的。支化的烴類(lèi)化合物對(duì)應(yīng)于直鏈烴類(lèi)化合物的異構(gòu)體。
所述脂族烴類(lèi)化合物是取代或未取代的。優(yōu)選地，所述脂族烴類(lèi)化合物是未取代的，如非活化的烴類(lèi)化合物。當(dāng)脂族烴類(lèi)化合物是取代的時(shí)(附接有官能團(tuán))，優(yōu)選的取代基為鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺酰基、甲?；?、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲?；桶被酋；?；更優(yōu)選的取代基為氯、羥基、羧基和磺?；磺易顑?yōu)選的取代基為氯和羧基。所述脂族烴類(lèi)化合物可具有多至10個(gè)取代基，多至8個(gè)取代基，多至6個(gè)取代基，多至4個(gè)取代基，多至2個(gè)取代即或多至一個(gè)取代基的取代。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂族烴類(lèi)化合物是脂肪酸(取代基是羧基)。脂肪酸的實(shí)例包括但不限于丁酸(酪酸)，戊酸(纈草酸)，己酸(羊油酸)，庚酸(葡萄花酸)，辛酸(羊脂酸)，壬酸(天竺葵酸)，癸酸(羊蠟酸)，十二酸(月桂酸)，十四酸(肉豆蘧酸)，
十六酸(棕櫚酸)，十八酸(硬脂酸)，二十酸(花生酸)，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在第二個(gè)方面，所述脂族烴類(lèi)化合物是脂質(zhì)如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯，磷脂或鞘脂的酰基；且羥化發(fā)生在?；┒说?或3位。所述?；仨毦哂兄辽僖粋€(gè)與末端的2或3位的碳附接的氫。所述?；蔀轱柡?或不飽和的，并可任選地附接有官能團(tuán)(取代基)。?；膶?shí)例包括但不限于丁酸(酪酸)，戊酸(纈草酸)，己酸(羊油酸)，庚酸(葡萄花酸)，辛酸(羊脂酸)，壬酸(天竺葵酸)，癸酸(羊蠟酸)，十二酸(月桂酸)，十四酸(肉豆蘧酸)，十六酸(棕櫚酸)，十八酸(硬脂酸)，二十酸(花生酸)，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的?；问?。方法和用途本發(fā)明提供了使用過(guò)氧酶和過(guò)氧化氫在脂族烴類(lèi)化合物的2或3位進(jìn)行位點(diǎn)特異性羥化的方法。該脂族烴類(lèi)化合物必須包括至少3個(gè)碳的鏈，且脂族烴類(lèi)化合物的任一(一個(gè)或多個(gè))端可用作起始點(diǎn)以確定哪個(gè)碳為2或3位。所述脂族烴類(lèi)化合物必須在2或3位具有至少一個(gè)附接于碳的氫(其被羥化)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在2或3位的碳(用過(guò)氧酶羥化)是不飽和的(在進(jìn)行羥化之前)。相應(yīng)地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類(lèi)化合物任一端(一個(gè)或多個(gè)端)的2或3位進(jìn)行羥化的方法，所述脂族烴類(lèi)化合物具有至少3個(gè)碳，并在2或3位具有附接于碳的氫，所述方法包括將所述脂族烴類(lèi)化合物與過(guò)氧化氫和具有過(guò)氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQID NO:4，SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
本發(fā)明的方法可用于多種目的，如大量化學(xué)合成(生物催化)，增加脂族烴類(lèi)化合物的水溶性，生物治療，和食品特征的修飾。本發(fā)明的方法亦可用于多種工業(yè)工藝，其中所述羥化反應(yīng)是有益的。此種用途的一個(gè)實(shí)例是紙漿和紙產(chǎn)品的制造，其中存在于木質(zhì)(樹(shù)脂)中的烷和其他相關(guān)的脂族烴類(lèi)化合物可導(dǎo)致紙漿和紙制造工藝中的沉積問(wèn)題。這些疏水化合物是紙漿和紙制造工藝中所謂樹(shù)脂沉積物(Pitch deposit)的前體。樹(shù)脂沉積導(dǎo)致低品質(zhì)紙漿，并可導(dǎo)致紙漿廠運(yùn)轉(zhuǎn)的停工。涉及具有高提取物含量的紙漿的特定問(wèn)題包括流動(dòng)性問(wèn)題，紙中的污點(diǎn)和孔洞，以及紙張破裂(sheet break)。用過(guò)氧酶處理可增加所述化合物的溶解性,并由此減輕問(wèn)題。還有另一種本發(fā)明的方法的用途是，即用于油或煤精煉，其中過(guò)氧酶催化的羥化可用于改變烴類(lèi)化合物的溶解性、粘性和/或燃燒特征。具體而言，所述處理可導(dǎo)致接受該處理的烴類(lèi)化合物的煙點(diǎn)、著火點(diǎn)(kindling point)、燃點(diǎn)(fire point)和沸點(diǎn)(boilingpoint)的變化。在大量化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品(包括農(nóng)藥)、特種化學(xué)品和藥物的合成中，本發(fā)明的 方法顯然在將羥基基團(tuán)選擇性導(dǎo)入底物，由此影響修飾的化合物的可溶性方面是重要的。此外，所述選擇性羥化為通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成和化學(xué)酶合成領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行進(jìn)一步修飾提供了位點(diǎn)。將天然氣徹底加工以去除高級(jí)烷烴。此類(lèi)高級(jí)烷烴的羥化可用于改善其水溶性，并因此便于通過(guò)洗滌天然氣流來(lái)去除所述高級(jí)烷烴。可在井中或在精煉過(guò)程中進(jìn)行去除。油廢物的羥化會(huì)顯著改善生物可降解性，并可應(yīng)用于涉及來(lái)自精煉廠的廢水處理和污染的地面或水的生物治療的方面。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了在脂質(zhì)的酰基的末端的2或3位進(jìn)行羥化的方法，所述方法包括將所述脂質(zhì)與過(guò)氧化氫和具有過(guò)氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQID NO:4，SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI :[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。脂肪?；牧u化通常改善脂質(zhì)的水溶性。相應(yīng)地，本發(fā)明的方法可用于通過(guò)將衣物(laundry)與過(guò)氧酶和過(guò)氧化氫源和任選的表面活性劑相接觸而從衣物去除或減少含油或脂質(zhì)的污跡，如巧克力。本發(fā)明的方法可用具有過(guò)氧酶活性的固定化的多肽(過(guò)氧酶)進(jìn)行。本發(fā)明的方法可在水性溶劑(反應(yīng)介質(zhì))，多種醇、醚、其他極性或非極性溶劑，或其混合物中進(jìn)行。通過(guò)研究用于本發(fā)明的方法的脂族烴類(lèi)化合物的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識(shí)別溶劑的合適實(shí)例。通過(guò)提高或降低羥化進(jìn)行的壓力，可在反應(yīng)溫度將溶劑(反應(yīng)介質(zhì))和脂族烴類(lèi)化合物維持在液相中。
根據(jù)本發(fā)明的方法可在O至90攝氏度,優(yōu)選5至80攝氏度,更優(yōu)選10至70攝氏度，甚至更優(yōu)選15至60攝氏度，最優(yōu)選20至50攝氏度，以及特別是20至40攝氏度的溫
度進(jìn)行。本發(fā)明的方法可采用10秒至(至少)24小時(shí)，優(yōu)選I分鐘至(至少)12小時(shí)，更優(yōu)選5分鐘至(至少)6小時(shí)，最優(yōu)選5分鐘至(至少)3小時(shí)，且特別是5分鐘至(至少)I小時(shí)的處理時(shí)間。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法可用于通過(guò)將衣物與過(guò)氧酶和過(guò)氧化氫源以及任選的表面活性劑相接觸而從衣物減少不愉快的氣味。本發(fā)明的方法導(dǎo)致衣物中丁酸(酪酸)的量的減少。丁酸在衣物洗滌過(guò)程中，當(dāng)某些動(dòng)物脂肪和植物油由例如洗滌劑脂肪酶水解以產(chǎn)生游離脂肪酸(包括丁酸)時(shí)形成。丁酸具有極端不愉快的氣味。過(guò)氧酶將丁酸羥化為2-羥基丁酸(α -羥基丁酸)或3-羥基丁酸(β -羥基丁酸)。除非另行指明，使用的命名法是標(biāo)準(zhǔn)IUPAC命名法。 本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下述實(shí)施例描述，但不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例來(lái)自Agrocybe aegerita的具有過(guò)氧酶活性的多肽,示為SEQ ID N0:2,在下述實(shí)施例中稱作AaeAPO。實(shí)施例IιΗ己烷的羥化己烷的酶羥化在含有作為水性酶溶液(10 μ I)添加的2U πιΓ1 (O. 31nmol) AaeAPO的醇底物(正己烷，>97%，Sigma Aldrich)中進(jìn)行。在I小時(shí)期間通過(guò)注射泵添加H2O2 (4mM)。實(shí)驗(yàn)以200 μ I規(guī)模(總體積)在用磁力攪拌器攪拌的Iml玻璃小瓶中完成。通過(guò)直接注射反應(yīng)混合物由GC-MS(Varian)分析產(chǎn)物。對(duì)照以相同方式處理，只是添加水(IOyl)替代酶溶液。具有活性酶(AaeAPO)和正己烷的樣品的氣相色譜和質(zhì)譜顯示高量2_己醇和3-己醇的形成；不含酶的對(duì)照不含任何這些峰。實(shí)施例2ιΗ癸烷的羥化酶轉(zhuǎn)化(200 μ I總體積中)在補(bǔ)充2UmF1 (O. 31nmol) AaeAPO的純正癸烷(>97%,Sigma Aldrich)中完成。在2小時(shí)期間通過(guò)注射泵添加H2O2(8mM)并用磁力攪拌器攪拌樣品。產(chǎn)物通過(guò)GC-MS測(cè)量。對(duì)照以相同方式處理，只是添加水(10μ1)替代酶。具有活性酶(AaeAPO)和正癸烷的樣品的氣相色譜和質(zhì)譜顯示高量的兩種正烷醇，3-癸醇和2-癸醇的形成；不含酶的對(duì)照不含任何這些峰。實(shí)施例3月桂酸的酶羥化 月桂酸的酶羥化使用4ml的總反應(yīng)混合物進(jìn)行，所述反應(yīng)混合物含有50mM磷酸鉀緩沖液，40v/v%乙腈，ImM月桂酸(>98%純,將Aldrich W261408溶解于乙腈),0. Olmg過(guò)氧酶蛋白/ml (如SEQ ID NO:4所示的過(guò)氧酶)，并根據(jù)下表添加2mM抗壞血酸。反應(yīng)通過(guò)將對(duì)應(yīng)于O. 5mM濃度的過(guò)氧化氫添加于反應(yīng)混合物中而起始。將反應(yīng)混合物在35°C使用加熱塊溫育60分鐘。在30分鐘溫育之后添加過(guò)氧化氫的二次添加至ImM的總濃度。反應(yīng)通過(guò)在水浴中在85°C進(jìn)行5分鐘的熱處理停止。通過(guò)在100°C在分流模式(split mode)以10:1的比例注射(氦以25ml/分鐘的恒定流速用作載氣)由GC-FID (Varian 3900)測(cè)量產(chǎn)物。施加溫度梯度以10°C /分鐘的速率加熱至200°C，然后以500C /分鐘的速率進(jìn)行至360°C。結(jié)果記錄為峰面積(參見(jiàn)表I)。表I
處理月桂酸(面積@3. 2分鐘)產(chǎn)物(面積@4. 3分鐘)
過(guò)氧酶+H2O2無(wú)峰無(wú)峰
月桂酸+H2O2+抗壞血酸1601191
月桂酸+過(guò)氧酸+H2O2+抗壞血酸14406395. 5產(chǎn)物峰在過(guò)氧酶的存在下出現(xiàn)。產(chǎn)物的洗脫時(shí)間相對(duì)于12-羥基十二烷酸(其為2-羥基月桂酸和3-羥基月桂酸的異構(gòu)形式)略有偏移。因此，該洗脫時(shí)間符合預(yù)期的在2或3位羥化的產(chǎn)物。實(shí)施例4棕櫚酸的酶羥化棕櫚酸的酶羥化使用4ml的總反應(yīng)混合物進(jìn)行，所述反應(yīng)混合物含有50mM磷酸鉀緩沖液，40v/v%乙腈，ImM棕櫚酸(>99%純Sigma P0500)和O. Olmg過(guò)氧酶蛋白/ml (如SEQID N0:4所示的過(guò)氧酶)。反應(yīng)通過(guò)將對(duì)應(yīng)于ImM濃度的過(guò)氧化氫添加于反應(yīng)混合物中而起始。將反應(yīng)混合物在35°C使用加熱塊溫育1、2、3和10分鐘。反應(yīng)通過(guò)在水浴中在85°C進(jìn)行5分鐘的熱處理停止。通過(guò)在100°C在分流模式(split mode)以10:1的比例注射(氦以25ml/分鐘的恒定流速用作載氣)由GC-FID (Varian 3900)測(cè)量產(chǎn)物。施加溫度梯度以10°C /分鐘的速率加熱至200°C，然后以50°C /分鐘的速率進(jìn)行至360°C。結(jié)果記錄為峰面積(參見(jiàn)表2)。表2
溫育時(shí)間(分鐘)棕櫚酸(面積)產(chǎn)物(面積)
~O1799.5^il
~ 1481.282 8
2979. I191.3產(chǎn)物峰在I分鐘的溫育之后已經(jīng)出現(xiàn)，并在兩分鐘溫育之后增加。洗脫譜(profile)相對(duì)于16-羥基十六烷酸(其為2-羥基棕櫚酸和3-羥基棕櫚酸的異構(gòu)形式)略有偏移。因此，該洗脫時(shí)間符合預(yù)期的在2或3位羥化的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類(lèi)化合物的任一末端的2或3位進(jìn)行羥化的方法，所述脂族烴類(lèi)化合物具有至少3個(gè)碳并具有在2或3位附接于碳的氫，所述方法包括將所述脂族烴類(lèi)化合物與過(guò)氧化氫和具有過(guò)氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含 a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和 b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示 基序 I : [FL]XX[YF] S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO:9)； 基序 II G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序 III RXXRI [QE] [DEQ] S [IM] ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)； 基序 V :P[H)K] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)； 基序 VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述羥化的2和3位的碳在與過(guò)氧酶相接觸前是未取代的。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少55%同一性，優(yōu)選至少60%同一性，更優(yōu)選至少65%同一性,更優(yōu)選至少70%同一性,更優(yōu)選至少75%同一性,更優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，并且特別是至少95%同一性。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽，包含如下或由如下組成SEQID NO: I, SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列，或其具有過(guò)氧酶活性的片段。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述脂族烴類(lèi)化合物的取代基選自下組鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺?；⒓柞；?、乙?；?、甲氧基、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲?；桶被酋；?。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述取代基選自下組氯、羥基、羧基和磺?；?，特別是氯和羧基。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述脂族烴類(lèi)化合物是未取代的。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述脂族烴類(lèi)化合物是直鏈的。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述脂族烴類(lèi)化合物是烷。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述烷是丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，或其異構(gòu)體。
11.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述脂族烴類(lèi)化合物是脂肪酸。
12.一種在脂質(zhì)的?；哪┒说?或3位進(jìn)行羥化的方法，所述方法包括將所述脂質(zhì)與過(guò)氧化氫和具有過(guò)氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含 a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和 b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序 I : [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N(SEQ ID NO :9)； 基序 II G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序 III RXXRI [QE] [DEQ] S[IM]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)； 基序 V :P[H)K] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)； 基序 VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4, SEQ ID N0:5, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的成熟多肽具有至少55%同一性，優(yōu)選至少60%同一性，更優(yōu)選至少65%同一性，更優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，更優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，并且特別是至少95%同一性。
14.過(guò)氧酶用于在脂族烴類(lèi)化合物任一端的2或3位進(jìn)行羥化的用途。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述脂族烴類(lèi)化合物是脂肪酸，烷或脂質(zhì)的?；?。
16.過(guò)氧酶用于從衣物減少不愉快的氣味的用途，包括將衣物與過(guò)氧酶和過(guò)氧化氫源相接觸。
17.過(guò)氧酶用于從衣物減少或去除的含油或脂質(zhì)的污跡的用途，其是通過(guò)將衣物與過(guò)氧酶和過(guò)氧化氫源相接觸而進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類(lèi)化合物的2或3位進(jìn)行羥化的酶方法。
文檔編號(hào)C12P7/04GK102822348SQ201180016868
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月28日
發(fā)明者M.霍夫里克特, K.希布納, R.烏爾里克, M.基恩, S.彼得, H.倫德, L.卡魯姆 申請(qǐng)人:諾維信公司