專利名稱：香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣中克隆分離 編碼UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)的cDNA。
背景技術(shù)：
在植物花色形成過程中，UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)能將花色素催 化生成花色苷，糖基化通常發(fā)生在該物質(zhì)的0 (OH-和COOH-)、 N、 S、 C原子上，通常是 在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以核酸活化的糖分子作為^^體底物進(jìn)行的。最常見的受體是羥基 化的分子，而UDP-葡萄糖是最常見的供體分子。花色素結(jié)合糖苷對花色素的穩(wěn)定性及在液 泡中的溶解性起著至關(guān)重要的作用，糖基化作用使花的最大吸收光譜向紫外線端移動(dòng)而呈 現(xiàn)藍(lán)色。
到目前為止，人們已經(jīng)克隆得到許多與植物次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的UF3GT基因，如在玉 米(N. V. Fedoroff et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 119 (1988) 185-197)，金魚草(C. Martinet al. Plant J. 1 (1991) 37 - 49)，龍膽(Y. Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37 (1996) 711-716)，紫蘇(Z. Gongetal. Plant Mo 1. Biol. 35 (1997) 915 - 927)，葡萄(C.M. Ford etal. J. Biol. Chem. 273 (1998) 9224 - 9233)，矮牽牛(M. Yamazaki et al. Plant Mol. Biol. 48 (2002) 401 - 411)等。
對巳有的糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列和根據(jù)cDNA推測出的糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的比較 分析,編碼區(qū)具有2個(gè)保守的區(qū)域 一個(gè)是編碼44個(gè)氨基酸的糖基轉(zhuǎn)移酶所特有的特征性區(qū) 域(Lim E.K. ， Bowles D.J. EMB0 J (2004) 23: 2915 - 2922)，它被認(rèn)為是UDP-葡萄糖的 結(jié)合區(qū)域，在這個(gè)區(qū)域氨基酸序列與其它已知的糖基轉(zhuǎn)移酶基因有43% 78%的相似性；另 一個(gè)保守的區(qū)域位于糖基轉(zhuǎn)移酶基因的上游附龍，它們的相似性在30°/。 45%。但是，這類酶 不同成員及在不同植物種類中的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列的相似性很低，所以至今尚未見用糖 基轉(zhuǎn)移酶基因保守區(qū)合成簡并引物獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因的報(bào)道。
本發(fā)明克隆所得到的FhGTl基因能編碼與植物次生代謝過程相關(guān)的UF3GT，具體說該基
4因是植物花色形成過程中的結(jié)構(gòu)基因之一，能將UDP-葡萄糖上的葡萄糖轉(zhuǎn)移到花色素分子 的C3羥基上生產(chǎn)花色苷，保持花色素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時(shí)是花色素分子運(yùn)輸?shù)揭号荼夭豢缮?的因素，與花色合成密切相關(guān)。 '

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從紅花香雪蘭中克隆得到UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT) 的新cDNA，并確定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。另外，F(xiàn)hGTl基因在大腸桿 菌細(xì)胞中成功的表達(dá)了所述的UF3GT蛋白，并且發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組蛋白，在體外酶活實(shí)驗(yàn)中可 以將花色素催化生成花色苷。
所以，本發(fā)明的目的是提供編碼UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)的新 cDNA和由此推斷的氨基酸序列。
為了從香雪蘭中克隆得到FhGTl基因，本發(fā)明首先利用RT-PCR的方法在擬南芥中制備相 關(guān)的探針，使用ECL發(fā)光試劑盒對實(shí)驗(yàn)室已建立的紅花香雪蘭花瓣的cDNA文庫進(jìn)行篩庫，分 離得到919bp的cDNA片段，測序得到該片段的核苷酸序列。分析該序列顯示此片段與Iris hollandica的UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)同源性最高，達(dá)到63%。另夕卜， 序列分析顯示該片段包含ATG起始密碼子。利用RACE法克隆該基因的3'端序列，得到833bp 的片段，測序得到該片段的核苷酸序列。分析該序列顯示此片段與Iris hollandica的UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)同源性最高，達(dá)到64%。另外，序列分析顯示該 片段包含TGA終止密碼子。提取紅花香雪蘭花瓣總RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR，克隆得到 1383bp的全長FhGTl基因，開放閱讀框架長1338bp，其編碼的蛋白序列長446個(gè)氨基酸，蛋 白質(zhì)的分子量推測是48， 043Da，等電點(diǎn)為5.71。
在pET-28(a+)原核表達(dá)載體中插入克隆得到的的FhGTl基因，并且轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 BL21(DE3)細(xì)胞中，表達(dá)重組UF3GT蛋白。
進(jìn)行香雪蘭UF3GT蛋白的體外酶活反應(yīng)，高效液相(HPLC)檢測反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果顯示反 應(yīng)產(chǎn)物中有花色苷的生成，說明原核表達(dá)制備的UF3GT蛋白有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，證明克隆 得到的基因是UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA的特征如下 其中l(wèi): FhGTl基因5'端的核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)CGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGC
FhGTl基因5，端核苷酸序列長為919bp。 其中2: RACE法獲得FhGTl基因的3'端序列(SEQ ID NO. 2)
AAATTCTTCTTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC
FhGTl基因3'端核苷酸序列長為833bp。 其中3: FhGTl基因的全長核苷酸序列(SEQ ID NO. 3)GACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGA
克隆得到FhGTl基因全長為1383bp，開放閱讀框架長1338bp，下劃線表示的是該序列的 起始密碼子和終止密碼子。
其中4:由FhGTl基因核苷酸序列推測得到的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0， 4)
RANVAE細(xì)KKVVVGEEGRKMRERAAAIREMAAGSVRPGGSSVQNFKALLDIVIAR-
FhGTl基因編碼的蛋白序列長446個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量推測是48， 043Da，等電點(diǎn) 為5.71。


圖l為FhGTl基因的全長RT-PCR電泳圖； 圖2為FhGTl基因原核表達(dá)載體構(gòu)建的分子鑒定電泳其中M: DL 2000; 1:重組質(zhì)粒酶切；2:重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增；3:重組質(zhì)粒
圖3為HPLC檢測結(jié)果圖，其中體外酶活反應(yīng)，在保留時(shí)間17min時(shí)檢測到花色苷的生成;圖4為HPLC檢測結(jié)果圖，其中陰性對照反應(yīng)，反應(yīng)無花色苷生成。
具體實(shí)施例方式
在下面的具體實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l FhGTl基因全長的克隆
1、 探針的獲得根據(jù)擬南芥序列，設(shè)計(jì)特異的引物，即5'-CGA AGA CGG TGA AGA GGA C-3' (SEQ ID NO. 5)的上游引物和5'-GGT GAC TGA AAC AAA GAG CC-3' (SEQ ID NO. 6) 的下游引物。然后用Trizol試劑盒提取擬南芥的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此 作為模板進(jìn)行RT-PCR，得到的PCR產(chǎn)物即為篩庫的探針。
2、 FhGTl基因5'序列的獲得利用ECL發(fā)光試劑盒和上述探針對紅花香雪蘭花瓣的cDNA 文庫進(jìn)行篩庫，挑取曝光得到的陽性菌落進(jìn)行測序，序列如SEQ ID NO. l所示。
3、 FhGTl基因3'序列的獲得根據(jù)上述測序得到的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異的上游引物，即 5'-AATCCCACCCTGAACC-3' (SEQ ID NO. 7);根據(jù)mRNA保守的polyA結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特異的下游引 物5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3' (SEQ ID NO. 8)。用Trizol試劑盒提 取紅花香雪蘭花瓣的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進(jìn)行RACE，得到 FhGTl基因3，序列，結(jié)果如SEQ ID NO. 2所示。
4、 FhGTl基因全長序列的獲得根據(jù)上述兩次測序得到的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異的引物，即 5'-CAG CAA GCA ATG GGA TCG-3' (SEQ ID NO. 9)的上游引物和5'-CAG ACT TCA GTC ATA TTC CGA-3' (SEQ ID NO. 10)的下游引物。用Trizol試劑盒提取紅花香雪蘭花瓣的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進(jìn)行RT-PCR，電泳結(jié)果如圖l所示，得到FhGTl 基因全長序列，結(jié)果如SEQ ID NO. 3所示。
實(shí)施例2 FhGTl基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)
為了表達(dá)FhGTl蛋白，利用克隆得到的全長FhGTl基因作為模板，分別帶有EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行FhGTl基因開放閱讀框的PCR擴(kuò)增。其中上游引物5'-CTCGAATTC CAG CAA GCA ATG GGA TCG-3， (SEQ ID NO. 11);下游引物5， -CGG AAG CTT CAG ACT TCA GTC ATA TTC CGA-3' (SEQ ID NO. 12)。
分別利用EcoR I和Hind III兩種限制性內(nèi)切酶消化上述擴(kuò)增得到的DNA片段，并將其克 隆進(jìn)入質(zhì)粒pET-28(a+)，這樣構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-FhGTl，構(gòu)建后利用酶切及PCR 鑒定，結(jié)果如圖2所示。然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體表達(dá)FhGTl
8蛋白，將獲得的包涵體用6M尿素裂解，后緩慢透析得到重組的FhGTl蛋白
實(shí)施例3 FhGTl蛋白的體外酶活檢測
體外酶活反應(yīng)體系 (250 ul)
0. 1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0) : 100ul 10mM DTT : 25 u 1
10mM矢車菊花色素(cyanidin) : 10 u 1 lOmM UDP-Glu: 25 w 1
10%甘油 25 u 1
UFGT蛋白 65 ul
反應(yīng)條件30°C， 30min，反應(yīng)結(jié)束后14， 000rpra離心2min，所得上清液用O. 22 u m過 濾后，進(jìn)行HPLC檢測。
HPLC檢測檢測使用C18 column (規(guī)格250X4.6mm);檢測條件35°C， 270咖；洗 脫條件前20min線性洗脫溶液A(10。/。乙酸+0. 1%磷酸)100-60%，溶液B(50。/。乙腈)0—40%; 后20min等度洗脫溶液A: 60%，溶液B: 40%，檢測結(jié)果如圖3所示。檢測結(jié)果表明體外 酶活檢實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物中有花色苷的生成，說明原核表達(dá)制備的UFGT蛋白有活性，初步證明我 們分離的基因是尿苷二磷酸葡萄糖類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
權(quán)利要求
1、香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA，其特征如下其中1FhGT1基因5’端的核苷酸序列為TCATACTCTTGTTTCTTGCTTGTATTTGATTGATCATCAGCAACAGCAAGCAATGGGATCGGCCGATCGCTCCCACGTGGCACTCCTGGCCTTCCCCTTCGGGACCCACGCCGCCCCTCTCCTCTCCCTCGGCCTCAACCTCGCCTCCTCGGCACCCCACGGCACCACTTTCTCCTTTCTTAGCAACCGCCGTCCCGTCTCCTTGCCACCCAATTCCGCCATCAAGTTCTACGAGATCGCGGACGGCTCCGACCCCGAACACGAGGGACACGTGCACCCCGAAGAGGAGGTGAGGGTGTTCATGGAGGAGACGCCCGGGAACTACAAGAAGGCGCTGGAGGCCGCGGTTGATAGGTGCGGGGGGCAGCGTGTCACGTGCATCGTGGCGGACGCGTTCCTCTGGTTCGTTGGGGACATCGCGGCGGAGTTCGGTGTCCATTGGGTCCCACTCTGGACTGGCGGGCCGTGCAGCTTCCTCGCCCACCTCTACACCGACATGCTGAGGAACAAGATAGGTACAGGGAAGGAAGCTGATCCAGATGAGGACCTCCAATTCCTCCCTGGACTTTCCGGTTTCCGTGTACGCGACCTCCCCGACGACATTGTCACCGGAGACCTCACCGGTGCCTTCGCCAGTCTCCTCCACCGCATGTCAATCGAGATTCCCCGCTCCGCTGCCGCCATTGCCATCAACACCTTCGAGGGCCTCCATCCGGACATCGACGCCGACCTCGCCTCCAAGTTCAAGAAGTCACTCCCAATTGGCCCACTCAACCTCCTCAATCCCACCCTGAACCAACCGGACAAGTTCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCFhGT1基因5’端核苷酸序列長為919bp；其中2RACE法獲得FhGT1基因的3’端序列為AATCCCACCCTGAACCAACCGGACAGGTTCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCCTCGAGCAGAGTGGGGTCCCTTTCCTCTGGTCCCTCAAGGAACCGGGCCAACTGCCGGCCGGGTTCCTGGACCGGACCAAGGACCGGGGTCTCGTGGTCCCGTGGGTGCCGCAAGCCGAAGCATTGAAACATGTTGCGGTGGGCGCATCCTTGAGCCACTGCGGATGGAACTCCGTCATGGAGAGCGTAACGAGCGGCGTGCCGATGCTCTGCAGGCCGTTCCTCGGGGACCAGACAATGAATGCACGTGCCGTGTCGCATGTTTGGAAAGTCGGGGTGACGTTCGAGAATGGCACGATGACTAGGGCCAACGTGGCGGAGGCCATGAAGAAGGTGGTTGTCGGCGAAGAAGGGAGGAAGATGAGGGAGAGAGCGGCGGCGATTCGGGAAATGGCGGCCGGCTCGGTGCGACCGGGCGGAAGCTCGGTGCAAAACTTCAAGGCTCTCCTAGACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGATTGTATTTGAGTGAGATGGAGTATTAGTATTGTGCCTATTAATTCCTTGTTATGTTTGAAGAAATGAATCTAGTAATAATATAATAAACTTCTTGCATTTCGTCCTCTCTTGCTTATTGTGAAAGAGAGACCTGCAAATTCTTCTTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTCFhGT1基因3’端核苷酸序列長為833bp；其中3FhGT1基因的全長核苷酸序列為CAGCAAGCAATGGGATCGGCCGATCGCTCCCACGTGGCACTCCTGGCCTTCCCCTTCGGGACCCACGCCGCCCCTCTCCTCTCCCTCGGCCTCAACCTCGCCTCCTCGGCACCCCACGGCACCACTTTCTCCTTTCTTAGCAACCGCCGTCCCGTCTCCTTGCCACCCAATTCCGCCATCAAGTTCTACGAGATCGCGGACGGCTCCGACCCCGAACACGAGGGACACGTGCACCCCGAAGAGGAGGTGAGGGTGTTCATGGAGGAGACTCCCGGGAACTACAAGAAGGCGCTGGAGGCCGCGGTTGATAGGTGCGGGGGGCGGCGTGTCACGTGCATCGTGGCGGACGCGTTCCTCTGGTTCGTTGGGGACATCGCGGCGGAGTTCGGTGTCCATTGGGTCCCACTCTGGACTGGCGGGCCGTGCAGCTTCCTCGCCCACCTCTACACCGACATGCTGAGGAACAAGATAGGTACAGGGAAGGAAGCTGATCCAGATGAGGACCTCCAATTCCTCCCTGGACTTTCCGGTTTCCGTGTACGCGACCTCCCCGACGACATTGTCACCGGAGACCTCACCGGTGCCTTCGCCAGTCTCCTCCACCGCGTGTCAATCGAGATTCCCCGCTCCGCTGCCGCCATTGCCATCAACACCTTCGAGGGCCTCCATCCGGACATCGACGCCGACCTCGCCTCCAAGTTCAAGAAGTCACTCCCAATTGGCCCACTCAACCTCCTCAATCCCACCCTGAACCAACCGGACAAGTCCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCCTCGAGCAGAGTGGGGTCCCTTTCCTCTGGTCCCTCAAGGAACCGGGCCAACTGCCGGCCGGGTTCCTGGACCGGACCAAGGACCGGGGTCTCGTGGTCCCGTGGGTGCCGCAAGCCGAAGCATTGAAACATGTTGCGGTGGGCGCATTCTTGAGCCACTGCGGATGGAACTCTGTCATGGGGAGCGTAACGAGCGGTGTGCCGATGCTCTGCAGGCCGTTCCTCGGGGACCAGACGATGAATGCACGTGCCGTGTCGCATGTTTGGAAAGTCGGGGTGACGTTCGAGAATGGCACGATGACTAGGGCCAACGTGGCGGAGGCCATGAAGAAGGTGGTTGTCGGCGAAGAAGGGAGGAAGATGAGGGAGAGAGCGGCGGCGATTCGGGAAATGGCGGCCGGCTCGGTGCGACCGGGCGGAAGCTCGGTGCAAAACTTCAAGGCTCTCCTAGACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGA克隆得到FhGT1基因全長為1383bp，開放閱讀框架長1338bp，下劃線表示的是該序列的起始密碼子和終止密碼子；其中4由FhGT1基因核苷酸序列推測得到的蛋白質(zhì)序列為MGSADRSHVALLAFPFGTHAAPLLSLGLNLASSAPHGTTFSFLSNRRPVSLPPNSAIKFYEIADGSDPEHEGHVHPEEEVRVFMEETPGNYKKALEAAVDRCGGQRVTCIVADAFLWFVGDIAAEFGVHWVPLWTGGPCSFLAHLYTDMLRNKIGTGKEADPDEDLQFLPGLSGFRVRDLPDDIVTGDLTGAFASLLHRMSIEIPRSAAAIAINTFEGLHPDIDADLASKFKKSLPIGPLNLLNPTLNQPDRFSCLAWLDKFEPHSVAYVSFGTLAALTEAELVELASGLEQSGVPFLWSLKEPGQLPAGFLDRTKDRGLVVPWVPQAEALKHVAVGASLSHCGWNSVMESVTSGVPMLCRPFLGDQTMNARAVSHVWKVGVTFENGTMTRANVAEAMKKVVVGEEGRKMRERAAAIREMAAGSVRPGGSSVQNFKALLDIVIAR-FhGT1基因編碼的蛋白序列長446個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量推測是48,043Da，等電點(diǎn)為5.71。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣中分離編碼UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)的cDNA。香雪蘭UF3GT基因(FhGT1)cDNA的核苷酸序列分析顯示克隆得到的FhGT1基因長1383bp，開放閱讀框架長1338bp，其編碼的蛋白序列長446個(gè)氨基酸，推測蛋白質(zhì)的分子量是48,043Da，等電點(diǎn)為5.71。利用所述的FhGT1基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)重組的UF3GT蛋白，該蛋白在體外酶活反應(yīng)試驗(yàn)中，能促使花色素與UDP-葡萄糖反應(yīng)，催化生成花色苷。其在轉(zhuǎn)基因植物花卉的花色修飾方面具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/54GK101659956SQ20091006736
公開日2010年3月3日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者楊 付, 麗 王, 昕 隋 申請人:東北師范大學(xué)