專利名稱：細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移使受體細(xì)胞去分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使目的受體細(xì)胞，優(yōu)選人的體細(xì)胞“去分化”和/或改變其壽命的方法。這些方法尤其可以應(yīng)用于細(xì)胞治療領(lǐng)域和遺傳修飾細(xì)胞的產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)60年代采用兩棲類動物的核移植首先使核轉(zhuǎn)移獲得了認(rèn)可。(Diberardino，M.A.1980，“移植入卵和卵母細(xì)胞中的后生動物細(xì)胞核的遺傳穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)”，分化(Differentiation)，17-17-30；Diberardino，M.A.，N.J.Hoffner和L.D.Etkin，1984；“特化細(xì)胞中休眠基因的激活”，科學(xué)(science)，224946-952；Prather，R.S.和Robl，J.M.，1991，“通過核移植的克隆和實(shí)驗(yàn)動物及家畜胚胎中的分裂”，《動物在哺乳動物發(fā)育研究中的應(yīng)用》(AnimalApplication of Research in Mammalian Development)，R.A.Pederson，A.McLaren和N.First(編)，Spring HarborLaboratory出版社)。核轉(zhuǎn)移最初是在兩棲類動物中進(jìn)行的，部分原因是與哺乳動物的卵母細(xì)胞相比兩棲類動物的卵母細(xì)胞相對較大。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果向本領(lǐng)域的技術(shù)人員指明，供體細(xì)胞核的分化程度如果不是決定性地，也是在極大程度上確定了含有該細(xì)胞或細(xì)胞核的受體卵母細(xì)胞是否能有效地對所述核進(jìn)行重新編程(reprogram)和產(chǎn)生可存活的胚。(Diberardino，M.A.，N.J.Hoffner和L.D.Etkin，1984，“特化細(xì)胞中休眠基因的激活”，科學(xué)，224946-952；Prather，R.S.和Robl，J.M.1991，“通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的克隆和實(shí)驗(yàn)動物及家畜胚中的分裂”，《動物在哺乳動物發(fā)育研究中的應(yīng)用》，R.A.Pederson，A.McLaren和N.First(編)，Spring Harbor Laboratory出版社)。
多年以后，在20世紀(jì)80年代中期，顯微手術(shù)技術(shù)已臻完善后，研究者們開始研究是否能將核轉(zhuǎn)移沿用至哺乳動物。Robel等報(bào)道了克隆牛的最初方法(Robel，J.M.，R.Prather，F(xiàn).Barnes，W.Eyestone，D.Northey，B.Gilligan和N.L.First，1987，“在牛胚胎中進(jìn)行的核移植”，J.Anim.Sci.，64642-647)。事實(shí)上，Robel博士的實(shí)驗(yàn)室率先采用來自較早期胚胎細(xì)胞的供體核通過核移植克隆了兔(Stice，S.L.和Robl，J.M.，1988，“核移植兔胚胎中細(xì)胞核的重新編程”，Biol.Reprod.，39，657-664)。而且，采用相似的技術(shù)，通過將極早期胚胎的細(xì)胞或細(xì)胞核移植至去核卵母細(xì)胞中，克隆了牛(Prather，R.S.，F(xiàn)L.Barnes，ML.Sims，Robl，J.M.，W.H.Eyestone和N.L.First，1987，“牛胚胎中的細(xì)胞核移植對供體核和受體卵母細(xì)胞的評價(jià)”，Biol.Reprod.，37859-866)和綿羊(Willadsen，S.M.；1986，“綿羊胚胎中的細(xì)胞核移植”，自然(Nature)，(Lond)32063-65)，以及推測還克隆了豬(Prather，R.S.，M.M.Sims和N.L.First，1989，“豬胚胎中的細(xì)胞核移植”，Biol.Reprod.，41414)。
在20世紀(jì)90年代早期，對采用從進(jìn)程上更為分化的細(xì)胞獲得的供體核制備核轉(zhuǎn)移胚胎的可能性進(jìn)行了研究。這些實(shí)驗(yàn)的最初結(jié)果提示，當(dāng)胚胎發(fā)展到胚泡期(最初兩個(gè)細(xì)胞譜系發(fā)生分離時(shí)的胚胎期)后，核移植效力急劇降低(Collas，P.和J.M.Robl，1991，“核移植兔胚胎中細(xì)胞核重塑(remodeling)和發(fā)育的關(guān)系”，Biol.Reprod.，45455-465)。例如，已發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(形成胎盤的細(xì)胞)不支持細(xì)胞核融合物發(fā)育至胚泡期。(Collas，P.和J.M.Robl，1991，“核移植兔胚胎中細(xì)胞核重塑和發(fā)育的關(guān)系”，Biol.Reprod.45455-465)。相反，發(fā)現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(形成體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的細(xì)胞)支持低比例的發(fā)育至胚泡期，并獲得一些后代。(Collas P，BarnesFL，“通過顯微注射內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和顆粒細(xì)胞核進(jìn)行的核移植”，Mol ReprodDevel.，1994，38264-267)而且，進(jìn)一步的工作提示，經(jīng)過短期培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞能夠支持發(fā)育至分娩。(Sims M，F(xiàn)irst NL，“通過移植培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的核生產(chǎn)?！?，Proc Natl Acod Sci，1994，916143-6147)。
基于這些結(jié)果，在那時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛認(rèn)為兩棲類動物核移植實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的觀察結(jié)果將極有可能在哺乳動物中被觀察到。即，20世紀(jì)90年代早期在克隆領(lǐng)域工作的研究者廣泛認(rèn)為，一旦細(xì)胞定型為某一特定體細(xì)胞譜系后，它的細(xì)胞核將不可逆地喪失其“重新編程”的能力，即，當(dāng)用作核轉(zhuǎn)移的核供體時(shí)支持全程發(fā)育的能力。盡管體細(xì)胞表現(xiàn)出的不能有效重新編程的確切分子機(jī)制仍未知，但推測這可能是細(xì)胞分化過程中發(fā)生的DNA甲基化、組蛋白乙?；腿旧|(zhì)結(jié)構(gòu)過渡控制因子的改變所產(chǎn)生的結(jié)果。而且，據(jù)信這些細(xì)胞改變不能逆轉(zhuǎn)。
因此，1998年Roslin研究所報(bào)道定型為體細(xì)胞譜系的細(xì)胞當(dāng)用作核移植供體時(shí)能夠支持胚胎發(fā)育，是十分令人震驚的。同樣令人震驚，而且更具有商業(yè)意義的是，之后不久Massachusetts and AdvancedCell Technology大學(xué)工作的科學(xué)家報(bào)道了采用轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞通過核移植產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛。
而且，最近有報(bào)道在日本Ishikawa Prefecture Livestock研究中心從收集自屠宰場的母牛的輸卵管細(xì)胞產(chǎn)生了兩頭小牛。(Hadfield，P.和A.Coghlan，“早產(chǎn)重復(fù)Dolly混合物”，NewScientist，1998年7月11日)。而且，法國INRA的Jean-Paul Renard報(bào)道了采用胎牛的肌肉細(xì)胞產(chǎn)生的牛。(Mackenzie，D.和P.Cohen，1998，“法國?；卮痍P(guān)于克隆的幾個(gè)問題”，New Scientist，3月21日)。而且，新西蘭的David Wells報(bào)道了采用從成年母牛獲得的成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞產(chǎn)生的牛。(Wells，D.N.，1998，“克隆專題討論會重新編程細(xì)胞命運(yùn)-轉(zhuǎn)基因和克隆”，Monash MedicalCenter，Melbourne，澳大利亞，4月15-16日)。
據(jù)報(bào)道分化的細(xì)胞也可成功地用作核移植供體產(chǎn)生克隆小鼠。(Wakayama T，Perry ACF，Zucconi M，Johnsoal KR，YanagimachiR.，“從注射卵丘細(xì)胞核的去核卵母細(xì)胞全期發(fā)育的小鼠”，自然，1998，394369-374。)更進(jìn)一步地，Massachusetts and Advanced Cell Technology大學(xué)的研究者最近在1999年1月紐約時(shí)報(bào)的一則主要文章中報(bào)道了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中通過在去核的牛卵母細(xì)胞中插入一個(gè)成年分化細(xì)胞(從成人供體的頰獲得的細(xì)胞)產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移融合胚胎。因此，基于這些結(jié)果，似乎至少在某些條件下分化細(xì)胞可以被重新編程或去分化。
相關(guān)的是，最近在大眾化出版物上還報(bào)道，從年青女性供體卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移的細(xì)胞質(zhì)使老年婦女的卵母細(xì)胞“恢復(fù)活力”，以至能夠進(jìn)行繁殖。
然而，如果能夠開發(fā)在無需克隆的條件下將分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚胎細(xì)胞類型的方法，尤其是假若它們可以潛在地用于核移植和產(chǎn)生不同的治療用分化細(xì)胞類型，將是有利的。而且，如果能夠鑒定和通過重組方法制備負(fù)責(zé)分化細(xì)胞去分化和重新編程的細(xì)胞物質(zhì)，也將是有利的。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明旨在提供用于目的細(xì)胞“去分化”和/或改變其壽命的新方法。
本發(fā)明更具體的目的是提供一種新方法，以便通過導(dǎo)入分化較低的細(xì)胞，優(yōu)選卵母細(xì)胞或卵裂球，或另一胚胎細(xì)胞類型的細(xì)胞質(zhì)，使期望的分化細(xì)胞“去分化”和/或改變其壽命。ADD“胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞”。
本發(fā)明的另一目的是，在遺傳修飾之前、同時(shí)、或之后，改變目的細(xì)胞，典型的是哺乳動物分化細(xì)胞的壽命和/或使其去分化。
本發(fā)明的另一目的是，提供一種細(xì)胞治療的改良方法，其中改良包含施用通過導(dǎo)入從分化較低或未分化狀態(tài)的細(xì)胞，優(yōu)選卵母細(xì)胞或卵裂球獲得的細(xì)胞質(zhì)而去分化或壽命改變的細(xì)胞。
本發(fā)明的再一目的是，通過例如分級分離或扣除雜交，鑒定卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中負(fù)責(zé)去分化和/或改變細(xì)胞壽命的成分或多種成分。
本發(fā)明的再一目的是，提供一種治療(尤其是皮膚治療)的新方法，該方法通過施用治療上有效量的、獲自基本未分化或未分化細(xì)胞，尤其是卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一目的是提供用于治療、皮膚病學(xué)和/或化妝品的新組合物，其含有來自基本未分化或未分化的細(xì)胞(優(yōu)選卵母細(xì)胞或卵裂球)的細(xì)胞質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的是，提供通過導(dǎo)入基本未分化或未分化細(xì)胞，優(yōu)選卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞質(zhì)而“去分化”或壽命改變的細(xì)胞治療用細(xì)胞。
本發(fā)明的再一目的是，提供一種通過核移植進(jìn)行克隆的改良方法，其中改良包含將通過導(dǎo)入基本未分化或未分化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)而去分化和/或其壽命發(fā)生改變的細(xì)胞用作供體細(xì)胞或細(xì)胞核。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供通過導(dǎo)入未分化或基本未分化細(xì)胞，優(yōu)選卵母細(xì)胞或卵裂球，或另一胚胎細(xì)胞類型的細(xì)胞質(zhì)，制備去分化和/或其壽命改變(增加)的細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞、最優(yōu)選人細(xì)胞的新方法。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明將被用于制備處于更為原始狀態(tài)的細(xì)胞，特別是胚胎干細(xì)胞。
所獲細(xì)胞可用于基因和細(xì)胞治療，并可用作核移植用供體細(xì)胞或細(xì)胞核。
定義“卵母細(xì)胞”-本發(fā)明中，這是指從卵原細(xì)胞發(fā)育而來，并經(jīng)減數(shù)分裂形成成熟卵的任何卵母細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物的卵母細(xì)胞。
“分裂中期II卵母細(xì)胞”用于核移植的優(yōu)選卵母細(xì)胞成熟階段(First和Prather，分化(Differentiation)，481-8)。在此階段，卵母細(xì)胞充分準(zhǔn)備好將導(dǎo)入的供體細(xì)胞或細(xì)胞核如同受精的精子一樣地處理。
“供體細(xì)胞”-本發(fā)明中，這是指這樣一種細(xì)胞，其中其部分或全部細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞(“受體細(xì)胞”)中。供體細(xì)胞典型地是原始的或胚胎細(xì)胞類型，優(yōu)選卵母細(xì)胞、卵裂球、或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞。
“受體細(xì)胞”-這是指這樣一種細(xì)胞，在該細(xì)胞中轉(zhuǎn)移了供體細(xì)胞的全部或部分細(xì)胞質(zhì)，其中該供體細(xì)胞是比受體細(xì)胞更為原始的細(xì)胞類型。該轉(zhuǎn)移可以通過不同的方法來實(shí)現(xiàn)，這些方法的例子是顯微注射、或用脂質(zhì)體包被的細(xì)胞質(zhì)接觸供體細(xì)胞。典型地，供體細(xì)胞是卵母細(xì)胞、卵裂球或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，而受體細(xì)胞是體細(xì)胞，優(yōu)選人的體細(xì)胞。
“卵裂球”-胚泡期胚胎中包含的基本上未分化的胚細(xì)胞。
“胚細(xì)胞或胚胎細(xì)胞類型”-本發(fā)明中，這是指任何細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞、卵裂球、胚胎干細(xì)胞、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、或原始生殖細(xì)胞，其中將由此來源的細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入分化細(xì)胞，例如組織培養(yǎng)中的人的體細(xì)胞，導(dǎo)致這些分化細(xì)胞去分化和/或延長了它們的壽命。
“壽命改變的細(xì)胞”-本發(fā)明中這是指將更為原始或分化較低的細(xì)胞類型，例如胚細(xì)胞或胚細(xì)胞類型如卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入期望的分化細(xì)胞例如人的體細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生的細(xì)胞壽命的改變(延長)。
“胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)”-本發(fā)明中，這是指具有發(fā)育形成完整生物的潛能的未分化細(xì)胞，即能夠無限制增殖、維持其未分化狀態(tài)、并且當(dāng)被誘導(dǎo)分化時(shí)能夠產(chǎn)生任何機(jī)體細(xì)胞類型的細(xì)胞。
“核轉(zhuǎn)移”-供體細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞核DNA被導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞中，然后該細(xì)胞或細(xì)胞核與卵母細(xì)胞融合產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移融合物或核融合胚胎。可以采用該NT融合物制備克隆化胚胎或后代，或制備ES細(xì)胞。
“端粒酶”-采用其內(nèi)部RNA成分的部分作為模板進(jìn)行端粒重復(fù)DNA合成的核糖核蛋白(RNP)顆粒和聚合酶(美國專利5,583,016；Yu等，自然，344126(1990)；Singer和Gottschling，科學(xué)，266404(1004)；Autexier和Greider，Genes Develop.8563(1994)；Gilley等，Genes Develop.，92214(1995)；McEachern和Blackburn，自然，367403(1995)；Blackburn，Ann.Rev.Biochem.，61113(1992)；Greider，Ann.Rev.Bioehem.，65337(1996))。該酶的活性依賴于其RNA和蛋白質(zhì)成份，從而避免了采用RNA(即，與DNA相對的)作為端粒DNA合成的模板進(jìn)行末端復(fù)制所帶來的問題。端粒酶使端粒DNA的G鏈延長。包括端粒酶的持續(xù)合成能力、在各端粒部分的作用頻率、和端粒DNA降解速率在內(nèi)的多個(gè)因素一起決定了端粒的大小(即，它們是否被延長、縮短或維持在特定大小)。在體外端粒酶可以具有極大的持續(xù)性，四膜蟲屬(Tetrahymena)的端粒酶在解離前平均向G鏈添加大約500個(gè)堿基(Greider，Mol.Cell Biol.114572(1992))。
“遺傳修飾或改變”-本發(fā)明中這是指其基因組DNA中含有一個(gè)或多個(gè)修飾(例如添加、替換和/或缺失)的細(xì)胞。
“去分化”-本發(fā)明中，這是指由于導(dǎo)入更為原始的分化較低的細(xì)胞類型，例如卵母細(xì)胞或其它胚細(xì)胞，的細(xì)胞質(zhì)，引起的分化細(xì)胞如組織培養(yǎng)中的人類體細(xì)胞中的改變。
“全能性”-本發(fā)明中，這是指可產(chǎn)生發(fā)育機(jī)體例如胚胎、胎兒、動物中的所有細(xì)胞的細(xì)胞。術(shù)語“全能性”也可以指產(chǎn)生動物體中所有細(xì)胞的細(xì)胞。當(dāng)全能性細(xì)胞被用于從一或多個(gè)核移植步驟制備胚胎的程序中時(shí)，它能夠產(chǎn)生發(fā)育中的細(xì)胞團(tuán)的所有細(xì)胞。動物可以是在子宮外(ex utero)發(fā)揮功能的任何動物。動物可以例如以胎生動物的形式存在。全能性細(xì)胞還可以用于制備不完全動物，例如用于收獲器官的那些動物，如通過同源異型基因的操作而遺傳修飾消除了頭的生長的那些動物。
“有蹄動物”-本發(fā)明中這是指有蹄的四腿動物。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，該有蹄動物選自馴養(yǎng)或野生的?？?、羊科(ovids)、鹿科、豬科(suids)、馬科和駱駝科(camelids)代表性動物。這些代表性動物的例子有母?；蚬?、美洲野牛、水牛、綿羊、大角綿羊、馬、矮馬、驢、騾、鹿、麋鹿、北美馴鹿、山羊、水牛(water buffalo)、駱砣、大羊駝、羊駝和豬。在牛的物種中尤其優(yōu)選黃牛(Bos Taurus)、瘤牛(Bos Indicus)、和Bos buffalos母牛或公牛。
“無限增殖化”或“永久”細(xì)胞-本發(fā)明中用于指細(xì)胞的這些術(shù)語是指超越Hayflick限制的細(xì)胞。Hayflick限制可以定義為在一個(gè)細(xì)胞系衰老之前發(fā)生的細(xì)胞分裂次數(shù)。對于大多數(shù)非無限增殖化細(xì)胞，Hayflick將該限制設(shè)定為約60次分裂。見例如Hayflick和Moorhead，1971，Exp.Cell.Res.，25585-621；和Hayflick，1965，Exp.CellResearch，37614-636，它們以參考文獻(xiàn)形式完整地(包括所有數(shù)據(jù)、表和圖)并入本文。因此，如果該細(xì)胞系中的細(xì)胞能經(jīng)歷60次以上的細(xì)胞分裂，則可以將無限增殖化細(xì)胞系和非無限增殖化細(xì)胞系區(qū)分開來。如果細(xì)胞系中的細(xì)胞能夠經(jīng)歷60次以上細(xì)胞分裂，則該細(xì)胞系是無限增殖化或永生細(xì)胞系。本發(fā)明的無限增殖化細(xì)胞優(yōu)選能夠經(jīng)歷70次以上的分裂，更優(yōu)選地能夠經(jīng)歷80次以上的分裂，最優(yōu)選能夠經(jīng)歷90次以上的分裂。
典型地，可以根據(jù)無限增殖化和永生細(xì)胞與非無限增殖化細(xì)胞相比能夠以較低的密度傳代，對無限增殖化或永生細(xì)胞和非無限增殖化及非永生細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。具體地，當(dāng)接種條件不允許細(xì)胞間發(fā)生物理接觸時(shí)，無限增殖化細(xì)胞能夠生長至匯合(例如，細(xì)胞單層鋪展在整個(gè)平板上)。因此，當(dāng)以細(xì)胞之間彼此不能發(fā)生物理接觸的細(xì)胞密度接種細(xì)胞時(shí)，可以將無限增殖化細(xì)胞和非無限增殖化細(xì)胞區(qū)分開來。
“培養(yǎng)”-本文中此術(shù)語是指在液本培養(yǎng)基中處于靜止的或經(jīng)歷細(xì)胞分裂的一或多個(gè)細(xì)胞。幾乎所有類型的細(xì)胞都可以處在細(xì)胞培養(yǎng)條件中。細(xì)胞可以以懸浮和/或單細(xì)胞層形式和一或多種基本相似的細(xì)胞一起培養(yǎng)。細(xì)胞可以以懸浮和/或單細(xì)胞層形式和異種細(xì)胞群一起培養(yǎng)。前句中所用術(shù)語異種可以涉及任何細(xì)胞特征，如細(xì)胞類型和細(xì)胞周期階段等。細(xì)胞可以以懸浮和/或單細(xì)胞層形式和喂養(yǎng)細(xì)胞一起培養(yǎng)。
“飼養(yǎng)細(xì)胞”-這是指以和其它細(xì)胞一起共培養(yǎng)的形式培養(yǎng)的細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞包括例如成纖維細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞，并可以為與之共培養(yǎng)的細(xì)胞提供肽、多肽、電信號、有機(jī)分子(例如類固醇)、核酸分子、生長因子、細(xì)胞因子、和代謝養(yǎng)料的來源。一些細(xì)胞在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)時(shí)需要飼養(yǎng)細(xì)胞。
“重新編程(reprogram)”-該術(shù)語在本發(fā)明中用以指能夠?qū)⒎只?xì)胞轉(zhuǎn)化為分化較低的更原始的細(xì)胞類型(例如胚胎干細(xì)胞)的材料和方法。
“胚胎”-本發(fā)明中這是指尚未植入母體宿主的子宮膜中的發(fā)育中細(xì)胞團(tuán)。因此，術(shù)語“胚胎”在此用以指受精的卵母細(xì)胞、胞質(zhì)雜種(本文定義的)、胚泡期前發(fā)育中的細(xì)胞團(tuán)、和/或處于植入母體宿主子宮膜之前的發(fā)育階段的任何其它發(fā)育中的細(xì)胞團(tuán)。本發(fā)明的胚胎可能不會出現(xiàn)生殖嵴。因此，“胚細(xì)胞”是從胚胎分離獲得的和/或從胚胎產(chǎn)生的。
“胎兒”—本文發(fā)明中指植入母體宿主子宮膜中的發(fā)育中的細(xì)胞團(tuán)。胎兒可以包括如生殖嵴等辨別特征。生殖嵴是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于鑒別的一個(gè)特征，是大多數(shù)動物物種的胎兒中可識別的特征。
“胎兒細(xì)胞”—在此可以指從胎兒分離的和/或產(chǎn)生的或來源于胎兒的任何細(xì)胞。
“非胎兒細(xì)胞”—是指并非來源于胎兒也不是從胎兒分離的細(xì)胞。
“衰老”—本發(fā)明中這是指組織培養(yǎng)中非無限增殖化體細(xì)胞在通過培養(yǎng)維持了一段較長時(shí)期后出現(xiàn)的特征性生長變慢。特征性地，非無限增殖化細(xì)胞在衰老和死亡前具有確定的壽命。本發(fā)明通過在受體細(xì)胞如培養(yǎng)的人類體細(xì)胞中導(dǎo)入供體細(xì)胞，典型的是卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞質(zhì)來減緩或防止衰老。
發(fā)明詳述正如以上所闡述的，本發(fā)明提供通過導(dǎo)入更為原始的細(xì)胞類型，典型的是未分化或基本未分化細(xì)胞如卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞質(zhì)，使目的細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞、最優(yōu)選人或其它靈長類動物細(xì)胞去分化和/或改變其壽命的新方法。
正如前面提及的，最近在大眾出版物上報(bào)道，人工授精和不育領(lǐng)域的工作組成功地將較年青女性卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入老年女性卵母細(xì)胞中，并籍此使該老年卵母細(xì)胞的能力恢復(fù)以勝任受精和胚胎發(fā)育。基于這則秩聞證據(jù)，以及科學(xué)文獻(xiàn)中最近關(guān)于如下提示的論文即通過核移植可以有利地對分化的成年細(xì)胞“重新編程”，推測通過導(dǎo)入來自未分化或基本未分化細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞或卵裂球，或另一胚胎細(xì)胞類型的細(xì)胞質(zhì)，可以有效地使分化細(xì)胞“重新編程”或“去分化”和/或改變其壽命。
盡管目前仍不知道一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)是如何影響另一細(xì)胞的壽命或分化狀態(tài)的，但推測處于發(fā)育早期或原始狀態(tài)的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有一或多種物質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子和/或起到觸發(fā)或促進(jìn)細(xì)胞分化作用的其它物質(zhì)。例如，其中可能包含的影響細(xì)胞分化狀態(tài)的一種物質(zhì)是端粒酶。然而，申請人不希望受此理論的約束，因?yàn)閷τ诒景l(fā)明的理解這并不是必需的。
本發(fā)明中，典型地，受體細(xì)胞將在體外通過導(dǎo)入有效量的供體細(xì)胞，即未分化或基本未分化細(xì)胞如卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞質(zhì)來去分化。細(xì)胞質(zhì)的這種導(dǎo)入或轉(zhuǎn)移可以通過多種不同方法如通過顯微注射或利用脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。
受體細(xì)胞可以是任何物種的細(xì)胞，并可以和供體細(xì)胞異源，如兩棲動物、哺乳動物、鳥類的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。尤其優(yōu)選的受體細(xì)胞包括人和其它靈長類動物的細(xì)胞，如黑猩猩、cynomolgusmonkey、狒狒、其它舊大陸猴的細(xì)胞、山羊、馬、豬、綿羊、和其它有蹄動物、鼠、犬、貓、和其它哺乳動物物種。
而且，受體細(xì)胞可以是任何分化的細(xì)胞類型。其適合的例子包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和其它皮膚細(xì)胞類型、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞如T和B淋巴細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、樹突細(xì)胞、紅細(xì)胞和其它血細(xì)胞；胰細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(neural and nerve cell)類型、胃、腸、食道、肺、肝、脾、腎、膀胱、心、胸腺、角膜細(xì)胞和其它眼細(xì)胞類型等。一般地，這些方法可以用于任何希望處于較不分化狀態(tài)的細(xì)胞來源的應(yīng)用領(lǐng)域中。
正如所提及的，轉(zhuǎn)移的細(xì)胞質(zhì)將從與受體細(xì)胞相比處于分化較低狀態(tài)或更原始狀態(tài)的“供體細(xì)胞”獲得。典型地，該細(xì)胞質(zhì)將來源于卵母細(xì)胞或早期胚胎的細(xì)胞，如來自早期胚胎的卵裂球或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞。一般地，優(yōu)選供體細(xì)胞質(zhì)獲自卵母細(xì)胞或處于未分化或基本未分化狀態(tài)的其它胚細(xì)胞。牛卵母細(xì)胞是一個(gè)優(yōu)選來源，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀椎貜耐涝讏龃罅揩@得。
近來，文獻(xiàn)中報(bào)道了含有胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物的產(chǎn)生，這些胚胎干細(xì)胞據(jù)報(bào)道表達(dá)或不表達(dá)胚胎干細(xì)胞的某些特征性標(biāo)志。因此，也優(yōu)選供體細(xì)胞質(zhì)獲自表達(dá)或不表達(dá)未分化胚胎細(xì)胞類型特征性的細(xì)胞標(biāo)志的卵母細(xì)胞或其它細(xì)胞。靈長類動物ES細(xì)胞上的這些標(biāo)志包括例如，SSEA-1(-)；SSEA-3(+)；SSEA-4(+)；TRA-1-60(+)；TRA-1-81(+)；和堿性磷酸酶(+)。(見1998年12月1日授予Thomson的美國專利5,843,780)。
正如以上討論的，也期望將端粒酶和/或?yàn)槎肆Ｃ副磉_(dá)作準(zhǔn)備的DNA序列或其它成份導(dǎo)入受體細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞、更優(yōu)選人或非人靈長類動物細(xì)胞。端粒酶的分離和相應(yīng)DNA的克隆在本發(fā)明前就已有報(bào)道。例如，Cech等1998年4月9日公開的WO 98/14593報(bào)道了來自Eeuplotes aediculatus、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、和人的端粒酶核酸序列，以及含有端粒酶蛋白亞基的多肽。而且，Cech等1998年4月9日公開的WO 98/14592公開了含有人端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶，即人端粒酶的催化蛋白亞基的組合物。美國專利5,837,857和5,583,414也描述了編碼哺乳動物端粒酶的核酸。
進(jìn)一步地，授予West等的美國專利5,830,644；授予Kzolowski等的美國專利5,834,193和授予Harley等的美國專利5,837,453描述了測量端粒酶長度和端粒酶活性的方法以及影響端粒酶活性的藥劑。這些專利和PCT申請以參考文獻(xiàn)方式完整地并入本文。
因此，本發(fā)明中，期望的細(xì)胞如培養(yǎng)的人類體細(xì)胞可以通過單獨(dú)或聯(lián)合端粒酶一起導(dǎo)入更原始細(xì)胞類型如卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞類型的細(xì)胞質(zhì)，在組織培養(yǎng)中去分化或重新編程。這種供體卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞(如卵裂球)的細(xì)胞質(zhì)的導(dǎo)入可以通過多種方法來實(shí)現(xiàn)。例如這可以通過如下方式實(shí)現(xiàn)借助顯微手術(shù)用微量移液管取出供體卵母細(xì)胞或卵裂球或其它胚胎細(xì)胞類型的全部或部份細(xì)胞質(zhì)，并將這些細(xì)胞質(zhì)顯微注射至受體哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。還可以期望在該導(dǎo)入之前去除受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。該去除可以通過熟知的顯微手術(shù)方法來實(shí)現(xiàn)。或者，可以采用脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)來導(dǎo)入該細(xì)胞質(zhì)和/或端粒酶或端粒酶DNA。
本發(fā)明方法應(yīng)提供通過在組織培養(yǎng)中使目的細(xì)胞重新編程或去分化，制備胚胎干細(xì)胞如哺乳動物胚胎干細(xì)胞、最期望的是人胚胎干細(xì)胞的手段。從治療的立場上這些細(xì)胞是人們所期望的，因?yàn)檫@些細(xì)胞可以用于產(chǎn)生任何分化細(xì)胞類型。所獲分化細(xì)胞類型可以用于細(xì)胞移植治療。
本發(fā)明的另一重要應(yīng)用是用于基因治療。至今，已經(jīng)鑒定和克隆了許多具有顯著治療重要性的不同基因。而且，用于穩(wěn)定地將這些DNA導(dǎo)入目的細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞、更優(yōu)選的是人類體細(xì)胞類型中的方法是熟知的。而且，用于通過同源重組實(shí)現(xiàn)目的DNA的位點(diǎn)特異性插入的方法也是本領(lǐng)域熟知的。
然而，盡管將特定DNA導(dǎo)入目的體細(xì)胞并對其進(jìn)行檢測的方法是已知的，但正常即非無限增殖化細(xì)胞在組織培養(yǎng)中的有限壽命仍顯著防礙了這些方法的有效性。在期望導(dǎo)入多種DNA修飾如缺失、替代和/或添加的情況下，這尤其成問題。實(shí)質(zhì)上，盡管用于實(shí)現(xiàn)定向DNA修飾的方法是已知的，但實(shí)現(xiàn)和篩選這些修飾的所需時(shí)間可能是很漫長的。因此，在完成期望的DNA修飾之前細(xì)胞可能會衰老或死亡。
本發(fā)明可以通過在遺傳修飾之前、同時(shí)或之后在受體細(xì)胞中導(dǎo)入卵母細(xì)胞或其它胚胎細(xì)胞類型的細(xì)胞質(zhì)，緩解基因和細(xì)胞治療的這種固有限制。單獨(dú)地，或者聯(lián)合端粒酶或?qū)е露肆Ｃ副磉_(dá)的DNA或其它成份一起，導(dǎo)入該細(xì)胞質(zhì)將便該遺傳修飾細(xì)胞重新編程并使其在組織培養(yǎng)中具有更長的壽命?？梢栽谑荏w細(xì)胞的遺傳修飾過程中一次或重復(fù)地實(shí)施這種重新編程。例如，對于很復(fù)雜的遺傳修飾，為了防止衰老可能必須通過重復(fù)導(dǎo)入供體細(xì)胞質(zhì)，對受體細(xì)胞進(jìn)行幾次“重新編程”?？梢酝ㄟ^監(jiān)測組織培養(yǎng)中細(xì)胞的倍增時(shí)間確定該重新編程的最佳頻率，以便在細(xì)胞衰老前對它們進(jìn)行重新編程。
由于重新編程而具有更長壽命的所獲重新編程遺傳修飾細(xì)胞，可以用于細(xì)胞和基因治療。而且，這些細(xì)胞可以用作核移植程序的供體細(xì)胞或用于制備嵌合動物。本發(fā)明方法將使得可以制備具有復(fù)雜遺傳修飾的克隆化和嵌合動物。對于制備人疾病的動物模型而言，這將是尤其有利的。在目的基因產(chǎn)物或表型的表達(dá)取決于多個(gè)不同DNA序列的表達(dá)的情況下，或?qū)τ谏婕安煌虮舜私换ビ绊懙幕蜓芯慷?，本發(fā)明方法也將是有利的。而且，預(yù)期隨著對不同基因表達(dá)彼此交互影響的進(jìn)一步理解，本發(fā)明方法將變得極為重要。
本發(fā)明的再一應(yīng)用是減緩老化的作用。正如哺乳動物細(xì)胞在組織培養(yǎng)中具有有限壽命一樣，它們在體內(nèi)同樣具有有限壽命。這種有限壽命被推測解釋了為什么生物，包括人類，具有正常的最大壽命，即由人類體細(xì)胞的有限壽命所確定。
本發(fā)明將通過從哺乳動物個(gè)體采取細(xì)胞，并借助卵母細(xì)胞或其它胚胎細(xì)胞類型如卵裂球的細(xì)胞質(zhì)的導(dǎo)入來改變(延長)這些細(xì)胞的壽命，從而減緩老化的作用。所獲得恢復(fù)活力的細(xì)胞可以用于在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生分化細(xì)胞類型，然后可以將這些細(xì)胞導(dǎo)入個(gè)體中。這可以用于例如恢復(fù)個(gè)體免疫系統(tǒng)的活力。在據(jù)認(rèn)為的免疫來源疾病如某些癌癥的治療中這種活力恢復(fù)應(yīng)是有利的。
而且，本發(fā)明方法可以用于制備能在組織損傷或選擇手術(shù)(elective surgery)中使用的自體移植物，如皮膚移植物。
本發(fā)明的再一應(yīng)用是治療時(shí)間和UV誘導(dǎo)的皮膚老化影響。隨著皮膚老化，可能出現(xiàn)多種物理變化，包括變色、彈性的喪失、光澤的喪失、細(xì)紋和皺紋的出現(xiàn)。預(yù)期可以通過局部施用含細(xì)胞質(zhì)的組合物減輕或甚至逆轉(zhuǎn)老化的這些影響。例如，可以將任選地包括端粒酶或端粒酶DNA結(jié)構(gòu)在內(nèi)的供體卵母細(xì)胞如牛卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，包裝在脂質(zhì)體中以便于在局部施用時(shí)內(nèi)化進(jìn)入皮膚細(xì)胞。而且，在這些組合物中包括利于皮膚吸收的化合物如DMSO可能是有利的?？梢詫⑦@些組合物局部地施用在老化作用極為明顯的皮膚區(qū)域如眼睛、頸和手周圍的皮膚上。
本發(fā)明的又一應(yīng)用是鑒定細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)去分化的物質(zhì)或多種物質(zhì)。這可以通過如下方式來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行分級分離，并篩選這些組分，以鑒定含有當(dāng)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞如人分化細(xì)胞類型中后導(dǎo)致有效的活力恢復(fù)或重新編程的物質(zhì)的那些組分。
或者，可以通過扣除雜交，對早期胚胎和卵母細(xì)胞中mRNA的表達(dá)與更為分化的胚胎中mRNA的表達(dá)進(jìn)行比較，鑒定包含在卵母細(xì)胞質(zhì)中負(fù)責(zé)重新編程或恢復(fù)活力的成分。
對于該鑒定，目前并不知道胚胎細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中何種成分或化合物負(fù)責(zé)細(xì)胞重新編程或去分化。實(shí)際上，甚至關(guān)于該成分的具體性質(zhì)，例如它們是核酸還是蛋白酶，也不確定。
然而，本發(fā)明人推測該成分可能含有核酸，尤其是母體RNA，或籍此編碼的蛋白質(zhì)。關(guān)于這點(diǎn)，不同的研究組報(bào)道，在極早期胚胎中含有一類稱作母體RNA的RNA，它們在極早期時(shí)儲存在卵中，但囊胚期后就檢測不到了(Kontrogianni-Konstantopoulos等，Devel.Biol.，177(2)371-382(1996))。多個(gè)不同物種即兔、母牛、豬、綿羊和小鼠的母體RNA水平已獲得定量。(Olszanska等，J.Exp.Zool.，265(3)317-320(2993))。關(guān)于此，還報(bào)道，果蠅屬(Drosophila)卵母細(xì)胞中的母體RNA編碼可以和相鄰濾泡細(xì)胞中存在的酪氨酸激酶受體結(jié)合的蛋白質(zhì)，該受體可以起始導(dǎo)致背側(cè)濾泡細(xì)胞分化從而限定和定向胚胎將來背腹軸的多個(gè)事件(Schupbach等，Curr.Opin.Genet.Dev.，4(4)502-507(1994))。
而且，卵母細(xì)胞的分級分離表明，在小卵母細(xì)胞中促分裂原活化的蛋白激酶以較高的水平表達(dá)，這提示它是儲存用于早期胚胎發(fā)生的母體RNA。推測這可能參與了胚胎及成年細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Zaitsevskaya等，Cell Growth.Differ.，3(11)773-782(1992))。
另外有報(bào)道，蠶卵母細(xì)胞中的母體mRNA編碼的蛋白質(zhì)可能是胚胎的細(xì)胞囊胚層形成必需的結(jié)構(gòu)成份，而且該母體mRNA和皮層細(xì)胞骨架的聯(lián)系可能參與了囊胚層發(fā)育過程中新細(xì)胞骨架或相關(guān)結(jié)構(gòu)的合成(Kastern等，Devel.，108(3)497-505(1990))。
而且，已報(bào)道，海膽卵和雙棲類動物卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的母體poly(A)+RNA與U1 RNA(即體細(xì)胞核mRNA前體拼接中的輔因子)一致，而且這些RNA含有散布在單拷貝元件中的重復(fù)序列。(Calzone等，Genes Devel.，2(3)305-318(1998)；Ruzdijic等，Development，101(1)107-116(1987)。)因此，基于這些，以及細(xì)胞質(zhì)顯然含有某種導(dǎo)致細(xì)胞重新編程的成分的觀察結(jié)果，應(yīng)當(dāng)可以鑒定出存在于卵母細(xì)胞和早期胚胎的細(xì)胞質(zhì)中、在適合條件下為目的細(xì)胞的重新編程或去分化提供條件的化合物，可能地，核酸和/或蛋白質(zhì)化合物。這可以通過例如基于大小或等電點(diǎn)將細(xì)胞質(zhì)分級分離為不同組分，并確定出當(dāng)轉(zhuǎn)移至分化細(xì)胞類型時(shí)實(shí)現(xiàn)去分化或重新編程的那些因子來完成。
或者，可以通過扣除雜交，即基本上通過鑒定出存在于卵母細(xì)胞中但在胚胎分化超過特定階段后如發(fā)育的囊胚期后消失的那些mRNA、以及鑒定出參與去分化或重新編程的那些mRNA，確定負(fù)責(zé)重新編程的因子。
因此，本發(fā)明包括鑒定當(dāng)轉(zhuǎn)移至分化細(xì)胞時(shí)為去分化或重新編程提供條件的特定細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，如多肽和/或核酸序列。基于有關(guān)母體RNA的報(bào)道，預(yù)期負(fù)責(zé)去分化或重新編程的活性物質(zhì)包括母體RNA或由此編碼的多肽。
在鑒定出這類核酸或多肽，并對其進(jìn)行測序后，可以通過重組方法對它們進(jìn)行制備。預(yù)期這些重組制備的核酸或多肽將足以誘導(dǎo)目的細(xì)胞重新編程或去分化。
權(quán)利要求
1.使目的細(xì)胞(“受體細(xì)胞”)重新編程和/或改變其壽命的方法，包括向該細(xì)胞中導(dǎo)入來自其它分化較低或未分化的細(xì)胞(“供體細(xì)胞”)的細(xì)胞質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體細(xì)胞是卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入端粒酶或?yàn)槎肆Ｃ副磉_(dá)作準(zhǔn)備的DNA結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述受體細(xì)胞含有處于可調(diào)節(jié)啟動子控制下的端粒酶DNA。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞來源于選自非人靈長類動物、人、大鼠、豚鼠、小鼠、兔、狗、貓、倉鼠、山羊、牛、綿羊、馬、野牛和水牛的哺乳動物。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人類體細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自心細(xì)胞、肺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、腸細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胰細(xì)胞、脾細(xì)胞、食道細(xì)胞和角膜細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述受體細(xì)胞在導(dǎo)入所述細(xì)胞之前、同時(shí)和/或之后被遺傳修飾。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述遺傳修飾細(xì)胞含有幾個(gè)遺傳修飾。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述遺傳修飾受體細(xì)胞含有編碼目的多肽的重組DNA。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組DNA編碼選自下組的多肽激素、生長因子、結(jié)構(gòu)多肽、酶、酶激動劑或拮抗劑、抗體、抗細(xì)菌多肽、抗病毒多肽、抗真菌多肽、細(xì)胞因子、凝血因子和抗腫瘤多肽。
13.權(quán)利要求1的方法，其導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞的壽命增加。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體細(xì)胞與受體細(xì)胞來自不同的物種。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述供體細(xì)胞是非人靈長類動物的卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞，而受體細(xì)胞是人的體細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的方法，其導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的產(chǎn)生。
17.涉及導(dǎo)入至少一個(gè)遺傳修飾細(xì)胞的改良基因治療方法，其中改良包含將通過導(dǎo)入相同或不同物種的卵母細(xì)胞或胚胎供體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)而具有增加的壽命和/或被“重新編程”的哺乳動物細(xì)胞，用作該遺傳修飾細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人細(xì)胞，而供體細(xì)胞是人或非人來源的卵母細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該遺傳修飾細(xì)胞含有一個(gè)以上遺傳修飾，而且為了防止或抑制衰老在所述多次遺傳修飾細(xì)胞的培養(yǎng)過程中將來自供體卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)一或多次地導(dǎo)入所述哺乳動物細(xì)胞中。
20.含有至少一個(gè)哺乳動物細(xì)胞的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物，其中所述哺乳動物細(xì)胞通過導(dǎo)入相同或不同物種的卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已被“重新編程”和/或改變(增加)了其壽命。
21.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、倉鼠、山羊、牛、馬、綿羊、犬和貓的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人細(xì)胞。
23.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述哺乳動物細(xì)胞含有一或多個(gè)遺傳修飾。
24.通過核轉(zhuǎn)移克隆非人哺乳動物的改良方法，其方式是將供體哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核導(dǎo)入與該供體細(xì)胞相同或不同物種的去核卵母細(xì)胞中，使所述細(xì)胞或細(xì)胞核與所述卵母細(xì)胞融合，培養(yǎng)所述核融合物以產(chǎn)生適于植入的胚胎，并將所述胚胎植入適合的雌性替代動物中以產(chǎn)生克隆化后代，其中改良包含將通過導(dǎo)入與該供體哺乳動物細(xì)胞相同或不同物種的卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已被重新編程和/或改變(增加)了其壽命的細(xì)胞用作該供體哺乳動物細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述供體哺乳動物細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾而含有一或多個(gè)遺傳修飾。
26.制備含有胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物的方法，包括向組織培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中導(dǎo)入有效量的、來自與該哺乳動物細(xì)胞相同或不同物種的供體卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞在導(dǎo)入供體卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之前、之后或同時(shí)接受過遺傳修飾。
28.權(quán)利要求26的方法，其中該哺乳動物細(xì)胞是人或非人靈長類動物的細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞在允許它們分化成不同細(xì)胞類型的條件下培養(yǎng)。
30.權(quán)利要求26的方法，其中在所述哺乳動物細(xì)胞中還導(dǎo)入了端粒酶或?yàn)槎肆Ｃ副磉_(dá)作準(zhǔn)備的DNA序列。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述端粒酶DNA序列在可調(diào)節(jié)啟動子的控制下表達(dá)。
32.含有通過權(quán)利要求26的方法制備的胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供通過導(dǎo)入更為原始、分化較低的細(xì)胞類型(例如卵母細(xì)胞或卵裂球)的細(xì)胞質(zhì),使目的“受體細(xì)胞”,例如人類體細(xì)胞去分化,或改變其壽命的方法。這些方法可以用于制備胚胎干細(xì)胞,并通過使目的細(xì)胞可以接受多次遺傳修飾而不衰老來增加基因治療的有效性。可以對所述細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行分級分離和/或扣除雜交,并鑒定和通過重組方法制備(對去分化有效的)活性物質(zhì)。
文檔編號C12N15/07GK1362965SQ00809800
公開日2002年8月7日 申請日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月30日
發(fā)明者K·B·查普羅 申請人:先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司