專利名稱：分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞和胚胎細(xì)胞活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精能力的方法。本發(fā)明還涉及一種從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法。
背景技術(shù)：
用于分析卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的方法需要破壞卵母細(xì)胞。因此，盡管在分析中提取的信息可能特別令人關(guān)注，但是研究者不能夠?qū)⒙涯讣?xì)胞作為完整的細(xì)胞單位根據(jù)從分析中提取的信息進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，隨后不能夠使卵母細(xì)胞受精并使之發(fā)育成胚胎、胎兒和嬰兒。
存在對研究卵母細(xì)胞中胞質(zhì)機(jī)制而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法的需求。還存在對研究胚胎細(xì)胞中胞質(zhì)機(jī)制而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法的需求?？梢詫⑦@些方法用于研究卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞中的那些由線粒體介導(dǎo)并且是卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞或來源于受精卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞的子代中的功能異常或疾病的原因或懷疑可導(dǎo)致這些情況或與這些情況相關(guān)的機(jī)制。
本發(fā)明的描述本發(fā)明試圖滿足這些需求且在第一個(gè)方面中提供了一種從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括包括從卵母細(xì)胞中釋放細(xì)胞質(zhì)級分的步驟。從卵母細(xì)胞中釋放的細(xì)胞質(zhì)級分的體積約占該卵母細(xì)胞體積的5％。優(yōu)選該體積約占所述卵母細(xì)胞體積的2％。
在本發(fā)明第一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入卵母細(xì)胞；(b)將約占卵母細(xì)胞體積5％的細(xì)胞質(zhì)級分抽入釋放裝置；和(c)從卵母細(xì)胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
抽入釋放裝置中的細(xì)胞質(zhì)級分的體積一般小于10pL且優(yōu)選8pL。優(yōu)選釋放裝置包括至少一種ICSI移液管且優(yōu)選將細(xì)胞質(zhì)級分抽入移液管內(nèi)約(100μm)。
從卵母細(xì)胞抽入釋放裝置中的細(xì)胞質(zhì)級分一般在釋放裝置與卵母細(xì)胞之間形成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物的擠出物。通過緩慢拉伸或剪切擠出物以分離擠出物而從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分。優(yōu)選通過拉伸擠出物而分離細(xì)胞質(zhì)級分。
一般來說，細(xì)胞質(zhì)級分含有胞質(zhì)細(xì)胞器且包括卵母細(xì)胞線粒體和線粒體產(chǎn)物的樣品或由它們組成。
位于卵母細(xì)胞中的線粒體是一種模板，從受精卵母細(xì)胞中發(fā)展而來的子代內(nèi)所有的線粒體來源于該模板。本發(fā)明者認(rèn)為用于從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法能夠研究線粒體基因組的完整性與卵母細(xì)胞和由受精卵母細(xì)胞發(fā)展而來的子代的功能之間的相關(guān)性。
因此，在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分析卵母細(xì)胞中線粒體基因組而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；b)分析級分中線粒體的線粒體基因組。
線粒體基因組突變可導(dǎo)致功能異常或疾病或至少與此相關(guān)。例如，可以理解來自線粒體基因組8470位-13,446位核苷酸的核苷酸序列缺失即所謂的“5kb共同缺失”與克-塞綜合征(KSS)和慢性進(jìn)行性外眼肌癱瘓(CPEO)相關(guān)。可能或不可能因共同缺失而觀察到的導(dǎo)致疾病的其它缺失包括腦和心臟線粒體基因組中的7.4kb缺失和10.4kb缺失/插入以及各種點(diǎn)突變。在包括骨骼肌、心臟、腦、卵母細(xì)胞、白細(xì)胞、視網(wǎng)膜和卵巢在內(nèi)的人體組織中也觀察到了這種缺失。
線粒體基因組中超過40個(gè)致病性點(diǎn)突變可能與涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肌肉、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腎臟和肝臟的較廣范圍的退化性疾病相關(guān)。與點(diǎn)突變相關(guān)的疾病包括利氏綜合征、MELAS(線粒體性腦肌病、乳酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作)、MERRF(伴有深紅(ragged-red)纖維的肌陣攣性癲癇)、NARP(神經(jīng)病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)和色素性視網(wǎng)膜炎)和LHON(利伯氏遺傳性視神經(jīng)萎縮)。
一種從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法因卵母細(xì)胞與由受精卵母細(xì)胞發(fā)展而來的子代的功能完整性而用于檢測線粒體基因組中的核苷酸序列突變、能夠研究核苷酸序列、多態(tài)性或突變。
因此，在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種檢測位于卵母細(xì)胞線粒體內(nèi)的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)對細(xì)胞質(zhì)級分中線粒體的線粒體基因組核苷酸序列分析線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在。
如果導(dǎo)致疾病或功能異?；蚺c之相關(guān)的線粒體基因組突變(包括點(diǎn)突變)大部分僅通過母系遺傳，那么一種分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法可用于預(yù)測來源于受精卵母細(xì)胞的子代是否會(huì)含有可導(dǎo)致疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與這些情況相關(guān)的線粒體基因組的核苷酸序列、多態(tài)性或突變。
因此，在第四個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測來源于受精卵母細(xì)胞的子代是否含有可導(dǎo)致疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與這些情況相關(guān)的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變的方法，其中該方法不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精的能力，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在；其中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在表明了來源于受精卵母細(xì)胞的子代含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的可能性。
僅在卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的線粒體基因組中存在的核苷酸序列、多態(tài)性或突變(公知它們與疾病或功能異常相關(guān)或可導(dǎo)致這些情況或懷疑可導(dǎo)致這些情況)可能不足以介導(dǎo)卵母細(xì)胞自身或來源于受精卵母細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常。實(shí)際上，看起來在含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的卵母細(xì)胞或來源于受精卵母細(xì)胞的子代中存在產(chǎn)生疾病或功能異常的可能性和/或嚴(yán)重性的至少一種其它因素。即卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體基因組中含有特殊核苷酸序列、多態(tài)性或突變的線粒體的實(shí)際比例或“閾值水平”為卵母細(xì)胞或來源于受精卵母細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常提供了可能性和/或嚴(yán)重性。特別地且與核基因組相反，在卵母細(xì)胞中存在至少約100,000個(gè)拷貝的線粒體基因組。當(dāng)卵母細(xì)胞含有一種以上的線粒體基因組時(shí)，觀察到了“異質(zhì)性”。卵母細(xì)胞、且實(shí)際上來源于受精卵母細(xì)胞的子代的組織在將核苷酸序列、多態(tài)性或突變引入細(xì)胞時(shí)成為“異質(zhì)性的”，而在引入前所述細(xì)胞含有單一種類的線粒體基因組。鑒于線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與這些情況相關(guān)，所以一般認(rèn)為當(dāng)異質(zhì)性超過特定水平時(shí)，遲早會(huì)觀察到疾病或功能異常的表現(xiàn)。
為了獲得人卵母細(xì)胞中能代表所有線粒體基因組的樣品，根據(jù)對小鼠卵母細(xì)胞中線粒體在減數(shù)分裂的特定階段遷移至卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的特定區(qū)域、特別是核周區(qū)的觀察結(jié)果，一般將一種用于測定人卵母細(xì)胞中異質(zhì)性程度的方法應(yīng)用于減數(shù)分裂的特定階段。一種分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法可用于測定卵母細(xì)胞中的異質(zhì)性水平并用于預(yù)測來源于受精卵母細(xì)胞的子代組織中異質(zhì)性的平均水平或可能的范圍。
因此，在第五個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種測定卵母細(xì)胞中線粒體基因組的異質(zhì)性水平而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；b)將級分中含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的線粒體基因組的數(shù)量與級分中不含核苷酸序列、多態(tài)性或突變的基因組數(shù)量進(jìn)行比較。
由于來源于受精卵母細(xì)胞的子代中異質(zhì)性水平和可導(dǎo)致疾病或功能異常或懷疑可導(dǎo)致這些情況或與這些情況相關(guān)的核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在為疾病或功能異常提供了可能性和/或嚴(yán)重性，故可將測定卵母細(xì)胞中線粒體基因組異質(zhì)性水平的方法用于預(yù)測來源于受精卵母細(xì)胞的子代是否可能患有由特殊核苷酸序列、多態(tài)性或突變導(dǎo)致或與此相關(guān)的疾病或功能異常，和/或疾病或功能異常的嚴(yán)重性。
因此，在第六個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種測定來源于受精卵母細(xì)胞的子代是否患有，或可能患有由線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變導(dǎo)致或與此相關(guān)的疾病或功能異常，其中該方法不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精能力且包括下列步驟
a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在；和測定所述子代是否可能患有疾病或功能異常，其中對級分中線粒體的線粒體基因組的分析表明相應(yīng)于卵母細(xì)胞中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的線粒體基因組的異質(zhì)性水平至少與公知和疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性水平相同。
如上所述，用于分析來自卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)級分的方法包括破壞卵母細(xì)胞的步驟。盡管這些方法揭示了有關(guān)由此破壞的卵母細(xì)胞的信息，但是該信息的價(jià)值僅限于對未評價(jià)的其它卵母細(xì)胞的推斷。如果來自相同個(gè)體的卵母細(xì)胞群體就卵質(zhì)內(nèi)含物而言一般是異質(zhì)的，那么來源于受破壞的卵母細(xì)胞的信息可以準(zhǔn)確或可靠地推廣至其它卵母細(xì)胞的程度還存在一些問題。也就是說，使用這些方法不可能因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞不具有可導(dǎo)致或相關(guān)于卵母細(xì)胞或受精卵母細(xì)胞子代中的疾病或功能異常的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變，或與核苷酸序列、多態(tài)性或突變相關(guān)的異質(zhì)性程度較低，而推斷來源于相同個(gè)體的其它卵母細(xì)胞具有相同的線粒體基因型。因此，用于分析卵母細(xì)胞的這些方法限于體外受精領(lǐng)域，其中預(yù)計(jì)來源于患者的某些卵母細(xì)胞可以含有導(dǎo)致或相關(guān)于來源于受精卵母細(xì)胞子代中的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態(tài)性或突變。
從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法特別可用于篩選受精前卵母細(xì)胞中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在，這些核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致來源于受精卵母細(xì)胞子代中的疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與此相關(guān)。
因此，在第七個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種篩選卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在的方法，所述核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致來源于受精卵母細(xì)胞子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與此相關(guān)，其中該方法不會(huì)影響卵母細(xì)胞的受精能力且包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；
b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在。
接受體外受精治療的患者通?？捎糜谑芫穆涯讣?xì)胞很少，且這些有效卵母細(xì)胞中的某些可能在線粒體基因組中含有可導(dǎo)致或相關(guān)于受精卵母細(xì)胞子代中的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態(tài)性或突變。用于從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分的其它方法特別不適于篩選受精用卵母細(xì)胞且可能導(dǎo)致破壞那些在其線粒體基因組中不含核苷酸序列、多態(tài)性或突變的卵母細(xì)胞或那些就所述突變而言具有低水平的異質(zhì)性的卵母細(xì)胞，其中所述線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致疾病或功能異?；蚺c之相關(guān)。
從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法特別可用于在受精前對不含導(dǎo)致或可能導(dǎo)致或相關(guān)于受精卵母細(xì)胞子代的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態(tài)性或突變的受精用卵母細(xì)胞進(jìn)行篩選的方法。
因此，在第八個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種篩選受精用卵母細(xì)胞的方法，這種受精用卵母細(xì)胞(i)不含可導(dǎo)致受精卵母細(xì)胞子代的疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與此相關(guān)的卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變；或(ii)就核苷酸序列、多態(tài)性或突變而言具有的線粒體基因組的異質(zhì)性低于公知與疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性的水平；其中該方法不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精能力且包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；b)分析級分中線粒體的線粒體基因組；和c)篩選受精用卵母細(xì)胞，條件是使卵母細(xì)胞線粒體基因組在核苷酸序列、多態(tài)性或突變方面異質(zhì)性程度低于公知與疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性的程度。
可以使分別按照本發(fā)明第七或第八個(gè)方面篩選或選擇的卵母細(xì)胞通過胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)或通過體外受精而受精。優(yōu)選使卵母細(xì)胞通過ICSI受精。
就本發(fā)明的第八個(gè)方面特別適合于篩選受精用卵母細(xì)胞并可以在ICSI或IVF前使用而言，本發(fā)明者認(rèn)為本發(fā)明第八個(gè)方面所包括的方法是新型體外受精過程的一個(gè)完整部分。
因此，在第九個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種使卵母細(xì)胞受精的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法從卵母細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析可導(dǎo)致受精卵母細(xì)胞的子代中疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與此相關(guān)的核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在；和c)使卵母細(xì)胞受精，條件是使卵母細(xì)胞線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的異質(zhì)性程度低于公知與疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性的程度。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以分析按照本發(fā)明第一個(gè)方面的方法分離的屬于細(xì)胞質(zhì)級分中的線粒體的線粒體基因組。這些技術(shù)已在后文中舉例說明，其包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、基因組雜交、核苷酸測序和基因功能檢測和/或測定。
既然測定了卵母細(xì)胞中線粒體基因組的異質(zhì)性水平，那么在線粒體隨機(jī)分配入細(xì)胞質(zhì)時(shí)可以獲得有代表性的基因組級分。優(yōu)選當(dāng)預(yù)計(jì)卵母細(xì)胞中線粒體的分布是隨機(jī)的，例如在初級卵母細(xì)胞的生發(fā)泡(GV)期和/或在次級卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂中II期至融合生殖前的階段時(shí)，從卵母細(xì)胞中抽出細(xì)胞質(zhì)級分。
當(dāng)從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分的方法不會(huì)明顯受卵母細(xì)胞代謝的干擾時(shí)，本發(fā)明者認(rèn)為這種分離細(xì)胞質(zhì)級分的方法可用于研究其它細(xì)胞、例如胚胎細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)而不會(huì)影響這些細(xì)胞的發(fā)育潛能。
因此，在第十個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法，該方法包括使細(xì)胞質(zhì)級分從所述細(xì)胞中釋放出來的步驟。從細(xì)胞中釋放的細(xì)胞質(zhì)級分的體積約占該細(xì)胞體積的5％。優(yōu)選從細(xì)胞中釋放的細(xì)胞質(zhì)級分的體積約占該細(xì)胞體積的2％。
在本發(fā)明第十個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入胚胎細(xì)胞；
(b)將約占胚胎細(xì)胞體積5％的細(xì)胞質(zhì)級分抽入釋放裝置；和(c)從所述細(xì)胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
抽入釋放裝置中的細(xì)胞質(zhì)級分的體積一般小于10pL且優(yōu)選8pL。優(yōu)選釋放裝置包括至少一種ICSI移液管且優(yōu)選將細(xì)胞質(zhì)級分抽入該移液管內(nèi)約(100μm)。
將細(xì)胞質(zhì)級分從胚胎細(xì)胞中抽入釋放裝置的過程一般在釋放裝置與胚胎細(xì)胞之間形成胞質(zhì)內(nèi)含物的擠出物。通過緩慢拉伸或剪切擠出物以分離該擠出物可以從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分。優(yōu)選通過拉伸擠出物來分離細(xì)胞質(zhì)級分。
一般來說，細(xì)胞質(zhì)級分含有胞質(zhì)細(xì)胞器且包括胚胎細(xì)胞線粒體和線粒體產(chǎn)物的樣品或由它們組成。
如上所述，已知線粒體基因組中的各種缺失和點(diǎn)突變可導(dǎo)致功能異?；蚣膊』蛑辽倥c之相關(guān)。從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法可用于檢測線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變，它能研究核苷酸序列、多態(tài)性或突變在胚胎細(xì)胞和來源于胚胎細(xì)胞的子代中的功能完整性。
因此，在第十一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種檢測胚胎細(xì)胞線粒體內(nèi)的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第十個(gè)方面的方法從胚胎細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)對細(xì)胞質(zhì)級分中線粒體的線粒體基因組核苷酸序列分析線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在。
本發(fā)明者認(rèn)為分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響胚胎細(xì)胞發(fā)育潛能的方法可用于預(yù)測來源于胚胎細(xì)胞的子代是否會(huì)在線粒體基因組中含有可導(dǎo)致疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與之相關(guān)的核苷酸序列、多態(tài)性或突變。
因此，在第十二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測來源于胚胎細(xì)胞的子代是否在線粒體基因組中含有可導(dǎo)致疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與這些情況相關(guān)的核苷酸序列、多態(tài)性或突變的方法，其中該方法不會(huì)影響所述細(xì)胞的發(fā)育潛能，該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第十個(gè)方面的方法從胚胎細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在。
其中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在表明了來源于胚胎的子代含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的可能性。
正如本文上述所討論的，在觀察到由線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變導(dǎo)致或與之相關(guān)的疾病或功能異常的表現(xiàn)之前必須超過異質(zhì)性的特定水平是可能的。
因此，在第十三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種測定胚胎細(xì)胞中線粒體基因組異質(zhì)性水平而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法，且該方法包括下列步驟a)按照本發(fā)明第十個(gè)方面的方法從胚胎細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)將級分中含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的線粒體基因組的數(shù)量與級分中不含核苷酸序列、多態(tài)性或突變的基因組數(shù)量進(jìn)行比較。
因此，在第十四個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種測定來源于胚胎細(xì)胞的子代是否可能患有由線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變導(dǎo)致或懷疑由這些因素導(dǎo)致或與此相關(guān)的疾病或功能異常的方法，其中該方法不會(huì)影響所述細(xì)胞的發(fā)育潛能且包括下列步驟a)按照本發(fā)明第十個(gè)方面的方法從胚胎細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在；測定所述子代是否可能患有疾病或功能異常，其中對級分中線粒體的線粒體基因組的分析表明胚胎細(xì)胞的線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的異質(zhì)性水平至少與公知與疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性水平相同。
在胚胎轉(zhuǎn)移過程開始前，重要的是選擇(i)一種胚胎，其線粒體基因組不含可導(dǎo)致或懷疑可導(dǎo)致或相關(guān)于疾病或功能異常的核苷酸序列、多態(tài)性或突變；和/或(ii)一種胚胎，其核苷酸序列、多態(tài)性或突變具有低水平異質(zhì)性。
從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法特別可用于，在胚胎轉(zhuǎn)移前，篩選不含可導(dǎo)致或懷疑可導(dǎo)致或相關(guān)于來自胚胎細(xì)胞的子代的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態(tài)性或突變的、用于胚胎轉(zhuǎn)移的胚胎。
因此，在第十五個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種篩選胚胎轉(zhuǎn)移所用胚胎的方法，這種胚胎(i)不含來自該胚胎之胚胎細(xì)胞線粒體的線粒體基因組的核苷酸序列、多態(tài)性或突變，所述核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致或懷疑可導(dǎo)致或相關(guān)于該胚胎細(xì)胞或胚胎的子代的疾病或功能異常；或(ii)線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的異質(zhì)性水平低于公知與疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性水平；其中該方法不會(huì)影響胚胎發(fā)育潛能且包括下列步驟a)按照本發(fā)明第十個(gè)方面的方法從胚胎細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和b)分析級分中線粒體的線粒體基因組；和c)篩選用于胚胎轉(zhuǎn)移的胚胎，條件是使胚胎細(xì)胞線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的異質(zhì)性程度至少低于公知與疾病或功能異常的表現(xiàn)相關(guān)的異質(zhì)性程度。
在第十七個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種在從卵母細(xì)胞中或從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分的方法中應(yīng)用的試劑盒。該試劑盒包括至少一種對卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞內(nèi)線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變具有特異性的核苷酸探針，其中所述線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致來源于受精卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞的子代中的疾病或功能異?；驊岩煽蓪?dǎo)致這些情況或與此相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種核苷酸探針對線粒體基因組中表1中所示的任意一種核苷酸序列突變具有特異性。
表1位置 RNA 基因 疾病721 r12SADPD阿爾茨海默病/帕金森病1555 r12SDEAF，弱1606 tVal腦肌病(Encephalomyopathy)1642 tVal MELAS1644 tVal 利伯氏病(Leighs)3010 r16s 長壽3196 r16s ADPD3243 tLeu(UUR) MELAS3250 tLeu(UUR) MM線粒體肌病3251 tLeu(UUR) MM3254 tLeu(UUR) 糖尿病3256 tLeu(UUR)3260 tLeu(UUR) HCM肥大性心肌病3271 tLeu(UUR) MELAS晚期發(fā)作而非32433288 tLeu(UUR) MM3302 tLeu(UUR) MM3303 tLeu(UUR) HCM/MM3394 mND1 LHON還涉及ECG中的長U間隔3397 mND1 ADPD3460 mND1 LHON嚴(yán)重型4160 mND1 LHON+4216 mND1 LHON4269 tIle FICP嬰兒致死性心肌病+4274 tIle CPEO4317 tIle FICP4336 tGln ADPD(弱)4917 mND2 LHON5178 mND2 長壽5244 mND2 LHON5521 tTrp 肌病，晚期發(fā)作6480 mCOI6930 COI G6930A(終止密碼子)多系統(tǒng)7444 mCOI LHON7445 mCOI PPK掌跖角皮病和聽覺喪失7472 tSer肌陣攣性癲癇，w/o RRF7497 tSerMERRF肌陣攣性癲癇等7512 tSer肌陣攣性癲癇，w/o RRF8342 tLys外眼肌麻痹，肌病，w.o RRF8344 tLysMERRF肌陣攣性癲癇，深紅纖維；脂肪過多癥8356 tLysMERRF8414 mATP8 長壽8851 ATP6 雙側(cè)紋狀體壞死8860 ATP6 正常A-＞G8993 mATP6 NARP/Leighs神經(jīng)原性衰弱，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，視網(wǎng)膜炎9176 mATP6 雙側(cè)紋狀體壞死9438 mCOILHON9804 mCOILHON9997 tGlyHCM10004 tGly兒童期猝死？10010 t 腦肌病10410 tArgAlpers綜合征11778 mND4LHON嚴(yán)重型18832 mND4肌病12258 tLeu2(CUN) 色素性視網(wǎng)膜炎，感覺神經(jīng)性聽覺喪失12300 tLeu2(CUN) 針對UUR讀碼的反密碼子突變12320 tLeu2(CUN) 肌病患者老化加劇13708 mND5LHON13730 mND5LHON14459 mND6LHON或利伯氏病14569 mND6LHON或利伯氏病14484 mND6LHON嚴(yán)重型14709 tGlu可變的嬰兒肌病至NIDDM14826 cytb 運(yùn)動(dòng)不耐受性15084 mcytb 運(yùn)動(dòng)不耐受性15168 mcytb 運(yùn)動(dòng)不耐受性15257 m cytbLHON15498 第24位核 cytb運(yùn)動(dòng)不耐受性苷酸缺失15723 m cytb運(yùn)動(dòng)不耐受性15762 m cytb肌病，晚期發(fā)作15812 m cytbLHON15923 t Thr LIMM嬰兒致死性線粒體肌病15990 t Pro MM16189 D NIDDM 非胰島素依賴型糖尿病N＝任意的核苷酸R＝兩種嘌呤(A，G)之一Y＝兩種嘧啶(U，C)之一可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析按照本發(fā)明第十個(gè)方面的方法分離的屬于細(xì)胞質(zhì)級分中的線粒體的線粒體基因組。這些技術(shù)已在后文中舉例說明，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、基因組雜交、核苷酸測序和基因功能檢測和/或測定。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包括下列序列的核苷酸ATP6FTCACCACCCAACAATGACATP6RTAAGGCGACAGCGATTTC定義在本說明書和權(quán)利要求中，“卵母細(xì)胞”指的是包括初級卵母細(xì)胞和次級卵母細(xì)胞在內(nèi)的雌性生殖系細(xì)胞并且包括人卵母細(xì)胞。初級卵母細(xì)胞包括減數(shù)分裂GV(生發(fā)泡)期的生殖細(xì)胞。次級卵母細(xì)胞包括減數(shù)分裂中II期的生殖細(xì)胞。
在本說明書和權(quán)利要求中，“來源于受精卵母細(xì)胞的子代”指的是由雌性生殖細(xì)胞與雄性生殖細(xì)胞受精而產(chǎn)生的個(gè)體?！皞€(gè)體”指的是從胚胎生命最早期(例如，2細(xì)胞階段)到成體生命的多細(xì)胞生物體。
在本說明書和權(quán)利要求中，“不影響卵母細(xì)胞受精能力”指的是帶有所分離的細(xì)胞質(zhì)級分的卵母細(xì)胞可以受精；或者換句話說，它們可以經(jīng)歷與受精過程中任意一個(gè)或多個(gè)階段相關(guān)的任意一種或多種生化或細(xì)胞過程，從精子的進(jìn)入而激活卵母細(xì)胞開始到產(chǎn)生受精卵并形成受精卵的分裂產(chǎn)物。一般在分離細(xì)胞質(zhì)的級分后，可以通過例如包括ICSI和IVF在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體外使卵母細(xì)胞受精。
在本說明書和權(quán)利要求中，“胚胎細(xì)胞”包括雌性與雄性生殖細(xì)胞的有性生殖后的融合產(chǎn)物受精卵和從2細(xì)胞階段到植入階段的任意發(fā)育階段的受精卵分裂產(chǎn)物。
在本說明書和權(quán)利要求中，“來源于胚胎細(xì)胞的子代”或“來源于胚胎的子代”指的是由雌性與雄性生殖細(xì)胞的有性生殖后的融合產(chǎn)物產(chǎn)生的個(gè)體。“個(gè)體”指的是從胚胎生命最早期(例如，2細(xì)胞階段)到成體生命的多細(xì)胞生物體。
在本說明書和權(quán)利要求中，“不影響細(xì)胞發(fā)育潛能”或“不影響胚胎發(fā)育潛能”指的是帶有所分離的細(xì)胞質(zhì)級分的胚胎細(xì)胞和產(chǎn)生胚胎細(xì)胞的胚胎可以經(jīng)受與細(xì)胞分化和/或成熟相關(guān)的任意一種或多種生化或細(xì)胞過程。
附圖簡述附
圖1表示使用寡核苷酸引物L(fēng)29和H04從來源于卵母細(xì)胞A1-A7的細(xì)胞質(zhì)活檢樣品的線粒體基因組D-環(huán)區(qū)擴(kuò)增的400bp(by)片段。
附圖2表示使用相應(yīng)于mtDNA 8201和8472位的引物擴(kuò)增分離自胚胎細(xì)胞的線粒體基因組的271bp片段。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方法1.卵母細(xì)胞的活檢材料和方法卵母細(xì)胞的來源將人卵母細(xì)胞A1-A5用于研究。這些卵母細(xì)胞是生發(fā)泡(GV)細(xì)胞或處于減數(shù)分裂的MI期的細(xì)胞，已恢復(fù)6小時(shí)。
將人卵母細(xì)胞B1-B8用于研究。這些卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的MII期并且是提取(retrieval)后24小時(shí)的細(xì)胞。
以要求參與研究的患者命名人卵母細(xì)胞C1。該卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的MII期并且是提取后24小時(shí)的細(xì)胞。
卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)級分的分離使用ICSI移液管(Sydney IVF，Sydney)對來自人卵母細(xì)胞的少量卵質(zhì)物質(zhì)進(jìn)行活檢。簡單地說，所述的移液管是一種拉出具有約7μm直徑的末端并帶有斜尖端的玻璃毛細(xì)管。
如下實(shí)施活檢技術(shù)將卵質(zhì)抽入所述移液管內(nèi)約100μm(約8pl)。然后從卵母細(xì)胞中抽出移液管而形成薄卵質(zhì)橋，隨后通過拉伸將其打斷。直接將各卵質(zhì)活檢物排入含有20μl的PCR緩沖液、蛋白酶K和20mM DTT的PCR管中。在37℃下將管培養(yǎng)過夜或在50℃下培養(yǎng)30分鐘，然后冷凍。兩種方案均隨后在95℃下將蛋白酶K加熱10分鐘使之失活。
卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)級分中線粒體基因組的分析通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來分析卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)級分中的線粒體基因組。
(i)D-環(huán)片段建立20μl反應(yīng)物；將10μl反應(yīng)混合物加入到10μl卵質(zhì)活檢制劑中。101反應(yīng)混合物含有引物各2.5pmol、dNTP各200μM、PCR緩沖液、milli-Q水和0.5個(gè)單位的Taq。所有反應(yīng)均在加蓋的0.2ml長管(tube strips)中進(jìn)行。在下列條件下在FTS熱測序儀(Corbett Research，Sydney，NSW)中進(jìn)行PCR循環(huán)在93℃下起始變性5分鐘；隨后進(jìn)行93℃變性45秒、60℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘的24-40個(gè)循環(huán)；通過72℃下7分鐘的補(bǔ)齊步驟結(jié)束；冷卻至15℃并保持在4℃下。所有PCR反應(yīng)均以缺乏模板DNA的全反應(yīng)混合物作為陰性對照。
使用特異性針對線粒體D-環(huán)區(qū)中400bp序列的引物L(fēng)29(5’-GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3’)和H04(5’-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3’)。
(ii)共同缺失片段使用與上述相同的方案，不過應(yīng)用下列條件在95℃起始變性3分鐘；隨后進(jìn)行92℃變性1分鐘、60℃退火10秒和68℃延伸45秒的20-35個(gè)循環(huán)；通過75℃下7分鐘的補(bǔ)齊步驟結(jié)束；冷卻至15℃并保持在4℃下。從第11個(gè)循環(huán)開始，每個(gè)循環(huán)加入15秒的延伸時(shí)間。所有PCR反應(yīng)均以缺乏模板DNA的全反應(yīng)混合物作為陰性對照。
通過共同缺失區(qū)對4977具有特異性的引物L(fēng)820(5’-TTCATGCCCATCGTCCTAGA-3’)和H1363(5’-GGGGAAGGGAGGTTGACCTG-3’)要求應(yīng)用改良型酶ExpandTM高保真(High Fidelity)，這是因?yàn)樾钄U(kuò)增較大片段PCR程序特別“長”所導(dǎo)致的。
在丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺37∶1的5％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳來分析來自D-環(huán)區(qū)或所述共同缺失區(qū)的擴(kuò)增的DNA片段。
已活檢的卵母細(xì)胞的受精按標(biāo)準(zhǔn)方案(1、2)通過ICSI或IVF使B1-B8卵母細(xì)胞和C1卵母細(xì)胞受精。在對卵母細(xì)胞進(jìn)行胞質(zhì)活檢后立即進(jìn)行受精。
結(jié)果胞質(zhì)活檢后卵母細(xì)胞的結(jié)局卵母細(xì)胞A1-A5顯然不受胞質(zhì)活檢過程的影響且在活檢后48小時(shí)時(shí)沒有表現(xiàn)出退化的征兆。卵母細(xì)胞B1-B3和B5-B8在活檢后的48小時(shí)時(shí)沒有表現(xiàn)出退化的征兆。卵母細(xì)胞C1在活檢后的48小時(shí)時(shí)沒有表現(xiàn)出退化的征兆。僅有卵母細(xì)胞B4在活檢后的17小時(shí)時(shí)退化(表2)。
表2卵母細(xì)胞胞質(zhì)活檢活檢后17小時(shí)活檢后48小時(shí)A1 有 不退化A2 有 不退化A3 有 不退化A4 有 不退化A5 有 不退化B1 有 不退化B2 有 不退化B3 有 不退化B4 有 退化B5 有 不退化B6 有 不退化B7 有 不退化B8 有 不退化C1 有 不退化從胞質(zhì)活檢物經(jīng)PCR擴(kuò)增線粒體DNA
考慮從取自卵母細(xì)胞的胞質(zhì)活檢物擴(kuò)增線粒體DNA。有必要計(jì)算可能在這類活檢物中獲得的線粒體的近似量以便確定是否存在足以用于PCR的模板DNA。
如上所述通過使用ICSI移液管獲取胞質(zhì)活檢物。據(jù)估計(jì)這種胞質(zhì)活檢物的體積約為8pl。由于卵母細(xì)胞的體積約為500pl，據(jù)估計(jì)取出的胞質(zhì)活檢物包括約2％的細(xì)胞質(zhì)。據(jù)一種保守的估計(jì)，每個(gè)卵母細(xì)胞中存在約100,000個(gè)線粒體基因組(3)。根據(jù)這一估計(jì)，活檢取出了約1000個(gè)線粒體。這一線粒體的量在聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增能力的范圍內(nèi)。
從D-環(huán)區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增通過35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增從卵母細(xì)胞A1-A5的胞質(zhì)活檢物擴(kuò)增400bp的D-環(huán)片段(附圖1)。
從其同缺失區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增從卵母細(xì)胞B1-B3和B5-B8的胞質(zhì)活檢物擴(kuò)增5.5kb的片段(數(shù)據(jù)未顯示)。
已活檢的卵母細(xì)胞的受精已活檢的卵母細(xì)胞B1-B8和C1的受精結(jié)果如表3中所示。
表3卵母細(xì)胞 IVF/ICSI 活檢后17小時(shí)活檢后48小時(shí)B1ICSI2PN2細(xì)胞B2ICSI2PN未分裂B3ICSI3PN2細(xì)胞B4ICSI退化B5IVF未受精B6IVF未受精B7IVF未受精B8IVF未受精C1ICSI2PN2細(xì)胞PN＝觀察到的原核使進(jìn)行ICSI方案的所有卵母細(xì)胞(除B4外)受精。在受精后17小時(shí)在B1、B3和C1中觀察到兩個(gè)原核，在B3中觀察到3個(gè)原核。卵母細(xì)胞B1、B3和C1發(fā)生分裂并在受精后48小時(shí)進(jìn)化成2細(xì)胞期。在48小時(shí)時(shí)的B2中沒有觀察到細(xì)胞分裂。
盡管B5-B8卵母細(xì)胞在活檢后48小時(shí)時(shí)沒有退化，但是這些卵母細(xì)胞中無一通過經(jīng)IVF方案的受精而受精。
討論僅在實(shí)施胞質(zhì)活檢技術(shù)的14種卵母細(xì)胞中的一種中觀察到了退化現(xiàn)象。由于某些卵母細(xì)胞在提取后約24小時(shí)傾向于退化(4、5)，故可能B4卵母細(xì)胞不依賴于胞質(zhì)活檢技術(shù)而退化。應(yīng)注意卵母細(xì)胞A1-A5在特別為受精而不是為使卵母細(xì)胞成熟而配制的培養(yǎng)基中成熟。
結(jié)果表明一般可以將胞質(zhì)活檢技術(shù)應(yīng)用至提取卵母細(xì)胞后24小時(shí)。由此能夠?qū)⑦@種活檢技術(shù)與公知的受精技術(shù)一起應(yīng)用，所述的公知受精技術(shù)例如包括ICSI和IVF，一般將它們在提取卵母細(xì)胞的約4-6小時(shí)后使用。盡管在本研究中在活檢后立即進(jìn)行受精，但是希望可以在受精后進(jìn)行活檢。
我們發(fā)現(xiàn)ICSI過程(即注射精子而不除去細(xì)胞質(zhì))后形態(tài)上完整的卵母細(xì)胞百分比為95.2％(以注射的2649個(gè)卵母細(xì)胞為基準(zhǔn))(未公布結(jié)果)。
通過與未記錄的其它種類中為核移植而除去極體和下面的細(xì)胞質(zhì)后的退化率比較，仍然難以建立用于其它類型顯微操作的標(biāo)準(zhǔn)(6、7)。在人卵母細(xì)胞中進(jìn)行胞質(zhì)注射，據(jù)報(bào)導(dǎo)外源線粒體注射的存活率為30.8％(67/217)，裂解率為6％。
盡管除去細(xì)胞質(zhì)比單獨(dú)使用ICSI更具有侵害性，但是在本研究中卵母細(xì)胞的總體存活率令人意外地高于我們上述討論的標(biāo)準(zhǔn)ICSI后的存活率。因此，可認(rèn)為胞質(zhì)活檢技術(shù)在臨床上是可接受的。
對胞質(zhì)活檢中線粒體基因組D環(huán)區(qū)和共同缺失區(qū)片段的擴(kuò)增表明，活檢樣品中存在足夠進(jìn)行PCR分析的模板DNA，可從該樣品中擴(kuò)增0.5kb以下至5kb以上的片段。對線粒體基因組的2個(gè)獨(dú)立基因座片段的擴(kuò)增提示，使用PCR和特異性寡核苷酸可以從胞質(zhì)活檢樣品中擴(kuò)增線粒體基因組的其它基因座上的突變、特別是表1中所述的突變。
鑒于在這些實(shí)驗(yàn)組中指定的卵母細(xì)胞在進(jìn)行胞質(zhì)活檢時(shí)已經(jīng)存活了24小時(shí)以上且嘗試對其進(jìn)行受精，所以有助于提高受精率和隨后的分裂率。預(yù)先的研究已經(jīng)表明，在受精前培養(yǎng)20小時(shí)以上可以兼顧卵母細(xì)胞的受精和發(fā)育(4、5)。此外，在體外成熟的卵母細(xì)胞缺乏體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞維持高分裂率的能力(8)。由于這一原因，所以B5-B8卵母細(xì)胞在通過IVF方案受精后不再受精這一事實(shí)并不令人意外。
2.胚胎細(xì)胞材料和方法胚胎細(xì)胞的來源使冷凍的研究用胚胎(3個(gè)二原核的胚胎、1個(gè)二細(xì)胞的胚胎和1個(gè)四細(xì)胞的胚胎)解凍并在生長培養(yǎng)基中平衡。
胚胎細(xì)胞胞質(zhì)級分的分離使用標(biāo)準(zhǔn)ICSI對3個(gè)單細(xì)胞胚胎和來自每種多細(xì)胞胚胎的1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活檢。在每種情況中將移液管導(dǎo)入胞質(zhì)區(qū)域并抽出相當(dāng)于細(xì)胞體積約5％的細(xì)胞質(zhì)等分部分。將這一等分部分轉(zhuǎn)入蔗糖溶液。使胚胎返回培養(yǎng)箱以使其連續(xù)生長。
對胚胎細(xì)胞胞質(zhì)級分中線粒體基因組的分析用氫氧化鉀使細(xì)胞質(zhì)制備物呈堿性并加熱至90℃持續(xù)5分鐘。在用TrisHCl中和后，將一等分部分加至含有線粒體DNA特異性引物的反應(yīng)混合物中，以擴(kuò)增相應(yīng)于mtDNA 8201和8472位的271個(gè)堿基對的片段。線粒體基因組中的該區(qū)包括氧化酶和ATP酶的編碼區(qū)部分。使用能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測與雙鏈DNA擴(kuò)增相關(guān)的熒光增加的熱循環(huán)僅對該混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。試劑和培養(yǎng)基空白對任何熒光改變來說是陰性的。通過與對照組人DNA的外部稀釋液進(jìn)行比較來分析DNA的拷貝數(shù)。
結(jié)果對來自胞質(zhì)活檢的線粒體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增全部5個(gè)樣品顯示出存在線粒體靶DNA。表4表示活檢樣品中估計(jì)的mtDNA拷貝。
表4
活檢后胚胎的結(jié)局活檢過程后約24小時(shí)使用顯微鏡檢驗(yàn)胚胎以確定它們的個(gè)體持續(xù)活力。2PN胚胎中僅有一個(gè)沒有分裂，不過，在原始的2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎中觀察到了某些退化的細(xì)胞物質(zhì)。3天后，進(jìn)一步的觀察結(jié)果表明兩個(gè)胚胎已經(jīng)進(jìn)化而形成胚泡。
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權(quán)利要求
1.一種從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括從卵母細(xì)胞中釋放約占該卵母細(xì)胞5％體積的細(xì)胞質(zhì)級分的步驟。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的級分約占所述卵母細(xì)胞體積的2％。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入卵母細(xì)胞；(b)將約占卵母細(xì)胞體積5％的細(xì)胞質(zhì)級分抽入釋放裝置；和(c)從卵母細(xì)胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述級分的體積小于10pL。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述級分的體積等于卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)可以抽取至胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)移液管內(nèi)約100μm的體積。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的細(xì)胞質(zhì)級分包括線粒體。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的釋放裝置包括一種注射移液管。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的注射移液管是一種ICSI移液管。
9.一種檢測卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變而不影響該卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權(quán)利要求1所述的方法從卵母細(xì)胞中分離包含線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和(b)對細(xì)胞質(zhì)級分中線粒體基因組的核苷酸序列進(jìn)行分析以明確線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致卵母細(xì)胞或來源于受精卵母細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與這些情況相關(guān)。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態(tài)性或突變?nèi)绫?中所示。
12.一種測定卵母細(xì)胞中線粒體基因組的異質(zhì)性水平而不影響卵母細(xì)胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權(quán)利要求1所述的方法從卵母細(xì)胞中分離包含線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和(b)將級分中含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的線粒體基因組的數(shù)量與級分中不含核苷酸序列、多態(tài)性或突變的基因組數(shù)量進(jìn)行比較。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中分離出細(xì)胞質(zhì)級分的卵母細(xì)胞是處于卵母細(xì)胞發(fā)育之生發(fā)泡期的初級卵母細(xì)胞或處于從減數(shù)分裂的中II期至融合生殖之前的卵母細(xì)胞發(fā)育期的次級卵母細(xì)胞。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致卵母細(xì)胞或來源于受精卵母細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況的原因，或與這些情況相關(guān)。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態(tài)性或突變?nèi)绫?中所示。
16.一種從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法，該方法包括從所述細(xì)胞中釋放約占該細(xì)胞體積的5％的細(xì)胞質(zhì)級分的步驟。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的級分約占所述細(xì)胞體積的2％。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，該方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入胚胎細(xì)胞；(b)將約占所述細(xì)胞體積5％的細(xì)胞質(zhì)級分抽入釋放裝置；和(c)從所述細(xì)胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述級分的體積小于10pL。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述級分的體積等于胚胎細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)可以抽入ICSI移液管內(nèi)100μm的體積。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的細(xì)胞質(zhì)級分包括線粒體。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的釋放裝置包括一種注射移液管。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的注射移液管是一種ICSI移液管。
24.一種檢測胚胎細(xì)胞內(nèi)線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權(quán)利要求16所述的方法從胚胎細(xì)胞中分離包括線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和(b)對細(xì)胞質(zhì)級分中線粒體基因組的核苷酸序列進(jìn)行分析以明確線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的存在。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致胚胎細(xì)胞或來源于胚胎細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與這些情況相關(guān)。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態(tài)性或突變?nèi)绫?中所示。
27.一種測定胚胎細(xì)胞中線粒體基因組的異質(zhì)性水平而不影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權(quán)利要求16所述的方法從胚胎細(xì)胞中分離包含線粒體的細(xì)胞質(zhì)級分；和(b)將級分中含有核苷酸序列、多態(tài)性或突變的線粒體基因組的數(shù)量與級分中不含核苷酸序列、多態(tài)性或突變的基因組數(shù)量進(jìn)行比較。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致胚胎細(xì)胞或來源于該細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與這些情況相關(guān)。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態(tài)性或突變?nèi)绫?中所示。
30.一種在權(quán)利要求9或權(quán)利要求12所述方法中使用的試劑盒，該試劑盒包括能夠檢測線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的寡核苷酸，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致卵母細(xì)胞或來源于受精卵母細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與這些情況相關(guān)。
31.一種在權(quán)利要求24或權(quán)利要求27所述方法中使用的試劑盒，該試劑盒包括能夠檢測線粒體基因組中核苷酸序列、多態(tài)性或突變的寡核苷酸，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態(tài)性或突變可導(dǎo)致胚胎細(xì)胞或來源于胚胎細(xì)胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導(dǎo)致這些情況，或與這些情況相關(guān)。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中所述的寡核苷酸能夠檢測表1中所示的核苷酸序列、多態(tài)性或突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從卵母細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響卵母細(xì)胞受精能力的方法,該方法包括包括從卵母細(xì)胞中釋放約占該卵母細(xì)胞體積的5%的細(xì)胞質(zhì)級分的步驟。本發(fā)明還公開了一種從胚胎細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)級分而不會(huì)影響該細(xì)胞發(fā)育潛能的方法,該方法包括從所述細(xì)胞中釋放約占該細(xì)胞體積5%的細(xì)胞質(zhì)級分的步驟。
文檔編號G01N33/50GK1341212SQ00804183
公開日2002年3月20日 申請日期2000年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月23日
發(fā)明者羅伯特·詹森, 凱利·德博爾 申請人:悉尼Ivf有限公司