一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種柳蘭懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括從柳蘭誘導愈傷組織、繼代培養(yǎng)愈傷組織、懸浮細胞培養(yǎng)、細胞懸浮體系的優(yōu)化等步驟。本發(fā)明方法所制備的柳蘭懸浮細胞工藝流程簡單，生產周期短，不受地域，季節(jié)，氣候等自然環(huán)境因素影響等優(yōu)點，有利于建立柳蘭懸浮細胞的大規(guī)模工廠化生產。
【專利說明】 一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及柳蘭懸浮細胞的快繁方法，屬于植物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]熱生，Epilobiumangustifolium Linn.，柳葉菜科，多年生草本，高約 1-1.3 米。莖直立，通常不分枝。葉互生，披針形，總狀花序頂生，伸長，花序軸被短柔毛，苞片線形，長1-2厘米，花大，兩性，紅紫色。根、莖、葉、花、果均含鞣質，分布于我國西南、西北、華北至東北；北溫帶廣布，北美洲、歐洲至日本，自然生于海拔較高的林緣、林間、山坡草地、河岸草叢及火燒或采伐跡地。耐寒。喜涼爽、濕潤氣候及濕潤、肥沃、排水良好的土壤。稍耐陰。畏炎熱、干旱的環(huán)境。柳蘭全草70%丙酮提取物中分得9個鞣質類及其他酚性化合物，分別鑒定為3-氧-沒食子?；?D-葡萄糖、I，6- 二-氧-沒食子?；?β -D-吡喃型葡萄糖、1-氧-沒食子?；鵢4，6-六羥基聯(lián)苯甲?；?β -D-吡喃型葡萄糖、水楊梅丁素、英國櫟鞣花酸、特里馬素、蝦子花素、綠原酸、沒食子酸。根狀莖或全草入藥，有小毒，能調經活血、消腫止痛，主治月經不調、骨折、關節(jié)扭傷。柳蘭繁殖采用種子繁殖，也可分株和扦插繁殖，懸浮細胞培養(yǎng)還無人研究，懸浮細胞具有操作簡單可控，生產成本低，繁殖率高等優(yōu)點。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供柳蘭懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，操作簡單可控，生產成本低，繁殖率高等優(yōu)點。
[0004]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下列技術方案:
選用柳蘭的種子，在肥皂水中浸泡30min，自來水沖洗lh，在超凈工作臺上用0.2 %的升汞消毒15min，無菌水沖洗5遍至無殘留溶液，經消毒處理后的外植體，去掉外種皮接種在1/2WPM+NAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.5-lmg/L培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，誘導愈傷組織的條件為暗光照，光照10h/d，溫度21°C，30天后，將誘導出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基WPM+l-2mg/L6-BA+0.3-0.5mg/L2, 4-D+150mg/L番茄汁培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)40天后，挑選嫩綠松散的愈傷組織，放入附加了 150mg/L紅色紅曲酶的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，加入已消毒滅菌后的玻璃珠震搖，置于震蕩培養(yǎng)箱中進行水平震蕩培養(yǎng)，振幅2-4cm,震動頻率90r/min，溫度23°C，光照25001x，光期12h/d，7_8天繼代一次，取樣，洗滌，烘干。
[0005]采用本發(fā)明制備的柳蘭懸浮細胞，工藝流程簡單，生產周期短，不受地域，季節(jié)，氣候等自然環(huán)境因素影響等優(yōu)點，有利于建立柳蘭懸浮細胞的大規(guī)模工廠化生產。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

【具體實施方式】
[0007]實施例1
選用柳蘭的種子，在肥皂水中浸泡30min，自來水沖洗lh，在超凈工作臺上用0.2%的升汞消毒15min，無菌水沖洗5遍至無殘留溶液，經消毒處理后的外植體，去掉外種皮接種在1/2WPM+NAA0.lmg/L+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，誘導愈傷組織的條件為暗光照，光照10h/d，溫度21 °C, 30天后，將誘導出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基WPM+lmg/L6-BA+0.3mg/L2, 4-D+150mg/L番茄汁培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)40天后，挑選嫩綠松散的愈傷組織,放入附加了 150mg/L紅色紅曲酶的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，加入已消毒滅菌后的玻璃珠震搖，置于震蕩培養(yǎng)箱中進行水平震蕩培養(yǎng)，振幅2-4cm，震動頻率90r/min，溫度23°C，光照25001x，光期12h/d，7-8天繼代一次，取樣，洗滌，烘干，成活率為90%。
[0008]實施例2
選用柳蘭的種子，在肥皂水中浸泡30min，自來水沖洗lh，在超凈工作臺上用0.2 %的升汞消毒15min，無菌水沖洗5遍至無殘留溶液，經消毒處理后的外植體，去掉外種皮接種在1/2WPM+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，誘導愈傷組織的條件為暗光照，光照10h/d，溫度21 V，30天后，將誘導出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基WPM+2mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4-D+150mg/L番茄汁培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)40天后，挑選嫩綠松散的愈傷組織,放入附加了 150mg/L紅色紅曲酶的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，加入已消毒滅菌后的玻璃珠震搖，置于震蕩培養(yǎng)箱中進行水平震蕩培養(yǎng)，振幅2-4cm，震動頻率90r/min，溫度23°C，光照25001x，光期12h/d，7-8天繼代一次，取樣，洗滌，烘干，成活率為91%。
[0009]實施例3
選用柳蘭的種子，在肥皂水中浸泡30min，自來水沖洗lh，在超凈工作臺上用0.2 %的升汞消毒15min，無菌水沖洗5遍至無殘留溶液，經消毒處理后的外植體，去掉外種皮接種在1/2WPM+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，誘導愈傷組織的條件為暗光照，光照10h/d，溫度21°C，30天后，將誘導出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基WPM+2mg/L6-BA+0.3mg/L2, 4-D+150mg/L番茄汁培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)40天后，挑選嫩綠松散的愈傷組織,放入附加了 150mg/L紅色紅曲酶的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，加入已消毒滅菌后的玻璃珠震搖，置于震蕩培養(yǎng)箱中進行水平震蕩培養(yǎng)，振幅2-4cm，震動頻率90r/min，溫度23°C，光照25001x，光期12h/d，7-8天繼代一次，取樣，洗滌，烘干，成活率為92%。
【權利要求】
1.一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:柳蘭的種子經消毒處理，去掉外種皮接種在1/2WPM+NAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.5-lmg/L培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，30天后，將誘導出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基WPM+l-2mg/L6-BA+0.3-0.5mg/L2, 4-D+150mg/L番茄汁培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)40天后接入附加了 150mg/L紅色紅曲酶中進行液體懸浮細胞的培養(yǎng)，7-8天繼代一次，取樣，洗滌，烘干。
2.根據權利要求1所述的一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒處理為:選用柳蘭的種子，在肥皂水中浸泡30min，自來水沖洗lh，在超凈工作臺上用0.2%的升萊消毒15min,無菌水沖洗5遍至無殘留溶液。
3.根據權利要求1所述的一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:誘導愈傷組織的條件為暗光照，光照10h/d，溫度21°C。
4.根據權利要求1所述的一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:柳蘭愈傷組織繼代中添加了番茄汁，可以促進細胞的分裂生長。
5.根據權利要求1所述的一種柳蘭懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:懸浮細胞的培養(yǎng)方法為愈傷組織經過繼代培養(yǎng)之后，挑選嫩綠松散的愈傷組織，放入液體培養(yǎng)基中，加入已消毒滅菌后的玻璃珠震搖，置于震蕩培養(yǎng)箱中進行水平震蕩培養(yǎng)，振幅2-4cm,震動頻率 90r/min，溫度 23°C，光照 25001x，光期 12h/d。
【文檔編號】A01H4/00GK104255463SQ201410463061
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農業(yè)科技有限公司