專利名稱：一種無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物腸細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法，具體涉及一種無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
魚(yú)類腸細(xì)胞為腸道主要功能性細(xì)胞，參與腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等多種重要生理過(guò)程。由于神經(jīng)、體液和許多類群細(xì)胞與腸細(xì)胞間存在廣泛的相互作用，使體內(nèi)試驗(yàn)研究腸細(xì)胞非常困難。而腸細(xì)胞體外培養(yǎng)研究模型是探討營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)腸細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)制、藥物、重金屬及其它有毒有害物質(zhì)對(duì)腸道損傷與腸道修復(fù)機(jī)制、篩選有益魚(yú)類腸道健康的功能性物質(zhì)的理想模型。因此，依據(jù)腸細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)，建立體外魚(yú)腸細(xì)胞培養(yǎng)研究模型，對(duì)于各相關(guān)領(lǐng)域的研究非常重要。細(xì)胞培養(yǎng)是指由活體組織，原代培養(yǎng)物、細(xì)胞系或細(xì)胞株經(jīng)酶、機(jī)械力或化學(xué)的離散作用得到分散細(xì)胞，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性的技術(shù)。根據(jù)分散細(xì)胞的來(lái)源可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，前者指從來(lái)源組織直接離散獲得細(xì)胞的首次培養(yǎng)，又叫初代培養(yǎng)；后者指從原代培養(yǎng)物、細(xì)胞系或細(xì)胞株離散的細(xì)胞， 經(jīng)稀釋，接種到新培養(yǎng)器皿內(nèi)的繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源于新鮮動(dòng)物組織。由于剛從活體組織上分離出來(lái)，具有二倍體遺傳性，其代謝和功能與活體更為接近，在一定程度上反映了體內(nèi)的特性。因此，原代培養(yǎng)模型適合營(yíng)養(yǎng)、藥物、細(xì)胞生長(zhǎng)等研究，越來(lái)越受到重視。根據(jù)腸細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)特點(diǎn)，原代腸細(xì)胞培養(yǎng)可分為貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)是分離后的腸細(xì)胞接種后，懸浮在培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。但在無(wú)胃溫水性魚(yú)類上，至今仍無(wú)腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)。有胃冷水性魚(yú)類的腸道結(jié)構(gòu)、生理特點(diǎn)與無(wú)胃溫水性魚(yú)類存在很大差異，因此現(xiàn)有的有胃冷水性魚(yú)腸細(xì)胞的分離方法、懸浮培養(yǎng)參數(shù)都無(wú)法直接應(yīng)用于無(wú)胃溫水性魚(yú)類。在這種前提下，研究無(wú)胃溫水性魚(yú)類腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，可為研究魚(yú)類腸細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)生理和代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)和有效手段，意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，使用該種方法能有效地實(shí)現(xiàn)無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞的分離和懸浮培養(yǎng)。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)方法，依次包括以下步驟1、選擇體重400-600g的健康鯉魚(yú)或草魚(yú)，用2%烏拉坦溶液浸泡麻醉，待魚(yú)體翻倒后，切去頭部，破壞脊髓。按常規(guī)方法將魚(yú)體表消毒，無(wú)菌取出整個(gè)內(nèi)臟，去除腸道表面的系膜組織，用溶液-1 (Hanks液)洗凈腸道內(nèi)容物。2、先將腸道一端扎住，用溶液-1充滿腸道，另一端用止血鉗夾住，在室溫下孵育 10分鐘。然后棄去溶液，以除去腸內(nèi)可能殘余的食糜和黏液。
3、再用溶液-2 (Hanks液+0. 2mMEDTA)充滿腸道，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40 轉(zhuǎn)/分，振蕩孵育15分鐘。然后將腸腔內(nèi)含有腸細(xì)胞的溶液收集起來(lái)。再用溶液-2充滿腸腔，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40轉(zhuǎn)/分，振蕩孵育15分鐘。4、將收集的腸細(xì)胞懸液混合在一起，在1500 Xg冷凍離心lOmin。5、收集的細(xì)胞沉淀用溶液-3(DMEM培養(yǎng)液+42U膠原蛋白酶I)重新懸浮，在25°C 振蕩孵化15min，腸細(xì)胞懸液經(jīng)100-μ m孔徑血液尼龍網(wǎng)過(guò)濾，在1500Xg冷凍離心lOmin。 細(xì)胞沉淀重新懸浮在溶液-4 (DMEM培養(yǎng)液+0. 5 %胎牛血清)中，供試驗(yàn)使用。6、細(xì)胞膜完整性用0. 5%臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法檢測(cè)。細(xì)胞懸液和染料等體積混合，滴加在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。7、細(xì)胞懸液在1500Xg冷凍離心lOmin，分別測(cè)定上清液和細(xì)胞沉淀乳酸脫氫酶 (LDH)的活性。細(xì)胞沉淀的LDH活性反映細(xì)胞的代謝活力，上清液的LDH活性反映細(xì)胞膜的完整性。8、臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力在90%以上，將細(xì)胞濃度調(diào)整為12X106cell/ml， 用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。輕輕混勻細(xì)胞懸液，取試驗(yàn)所需的細(xì)胞懸液數(shù)量，^rc振蕩培養(yǎng)，70轉(zhuǎn)/分， 培養(yǎng)總時(shí)間為MOmin。作為本發(fā)明的魚(yú)腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)步驟3)腸細(xì)胞分離的適宜EDTA濃度和時(shí)間處理包括以下內(nèi)容A、分離魚(yú)腸細(xì)胞的EDTA適宜濃度為0. 2mM,分離液與組織的適宜比例為1 10 ；B、分離的適宜溫度為20°C，振蕩轉(zhuǎn)速40轉(zhuǎn)/分，分離時(shí)間為15分鐘。作為本發(fā)明的魚(yú)腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)步驟8)分離腸細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)條件處理包括以下內(nèi)容A、培養(yǎng)溫度以2546°C為宜。B、使用細(xì)胞培養(yǎng)器皿密閉培養(yǎng)。C、所用培養(yǎng)液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明1、本發(fā)明首次提出無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法。2、本發(fā)明根據(jù)無(wú)胃溫水性魚(yú)腸道組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，摸索了最佳的魚(yú)腸細(xì)胞分離技術(shù)。3、本發(fā)明所述的培養(yǎng)條件和方法，能夠幫助初次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的研究人員，比較順利的完成魚(yú)腸細(xì)胞的分離和懸浮培養(yǎng)。


圖1分離良好的鯉魚(yú)腸細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1、選擇體重500g左右的健康鯉魚(yú)或草魚(yú)，用2%烏拉坦溶液浸泡麻醉，待魚(yú)體翻倒后，切去頭部，破壞脊髓。按常規(guī)方法將魚(yú)體表消毒，無(wú)菌取出整個(gè)內(nèi)臟，去除腸道表面的系膜組織，用溶液-1 (Hanks液)洗凈腸道內(nèi)容物。2、先將腸道一端扎住，用溶液-1充滿腸道，另一端用止血鉗夾住，在室溫下孵育 10分鐘。然后棄去溶液，以除去腸內(nèi)可能殘余的食物顆粒和黏液。3、再用溶液-2 (Hanks液+0. 2mMEDTA)充滿腸道，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40 轉(zhuǎn)/分，振蕩孵育15分鐘。然后將腸腔內(nèi)含有腸細(xì)胞的溶液收集起來(lái)。再用溶液-2充滿腸腔，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40轉(zhuǎn)/分，振蕩孵育15分鐘。分離鯉魚(yú)腸細(xì)胞的EDTA 適宜濃度為0.2mM，分離液(ml)與組織(g)的適宜比例為1 10(ml/g)；4、將收集的腸細(xì)胞懸液混合在一起，在1500 Xg冷凍離心lOmin。5、收集的細(xì)胞沉淀用溶液-3 (DMEM培養(yǎng)液+42U膠原蛋白酶I)重新懸浮，在25°C 振蕩孵化15min，腸細(xì)胞懸液經(jīng)100- μ m孔徑血液尼龍網(wǎng)過(guò)濾，在1500 X g冷凍離心IOmi η。 細(xì)胞沉淀重新懸浮在溶液_4(DMEM培養(yǎng)液+0. 5%胎牛血清)中，供試驗(yàn)使用。6、細(xì)胞膜完整性用0. 5%臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法檢測(cè)。細(xì)胞懸液和染料等體積混合，滴加在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。7、細(xì)胞懸液在1500Xg冷凍離心lOmin，分別測(cè)定上清液和細(xì)胞沉淀乳酸脫氫酶 (LDH)的活性。細(xì)胞沉淀的LDH活性反映細(xì)胞的代謝活力，上清液的LDH活性反映細(xì)胞膜的完整性。8、臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力在90%以上，將細(xì)胞濃度調(diào)整為12X106cell/ml， 用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。輕輕混勻細(xì)胞懸液，取試驗(yàn)所需的細(xì)胞懸液數(shù)量，26°C振蕩培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度以25-26°C為宜，使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶密閉培養(yǎng)。)，70轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)總時(shí)間為MOmin。所用培養(yǎng)液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉
ο如圖1所示為本發(fā)明方法分離的鯉魚(yú)腸細(xì)胞，多呈圓形，可見(jiàn)明顯的兩極特征；少量胞質(zhì)物質(zhì)豐富的粘液細(xì)胞；偶有橢圓形的紅細(xì)胞。腸細(xì)胞的純度和活力分別達(dá)到95%和 93%以上。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟Al、選擇體重400-600g的健康鯉魚(yú)或草魚(yú)，用2%烏拉坦溶液浸泡麻醉，待魚(yú)體翻倒后，切去頭部，破壞脊髓；按常規(guī)方法將魚(yú)體表消毒，無(wú)菌取出整個(gè)內(nèi)臟，去除腸道表面的系膜組織，用Hanks液洗凈腸道內(nèi)容物；A2、先將腸道一端扎住，用Hanks液充滿腸道，另一端用止血鉗夾住，在室溫下孵育10 分鐘；然后棄去溶液，以除去腸內(nèi)可能殘余的食糜和黏液；A3、再用溶液-2充滿腸道，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40轉(zhuǎn)/分，振蕩孵育15分鐘；然后將腸腔內(nèi)含有腸細(xì)胞的溶液收集起來(lái)；再用溶液-2充滿腸腔，兩端用止血鉗夾住， 在20°C下，40轉(zhuǎn)/分，振蕩孵育15分鐘；A4、將收集的腸細(xì)胞懸液混合在一起，在1500 Xg冷凍離心IOmin ；A5、收集的細(xì)胞沉淀用溶液-3重新懸浮，在25 °C振蕩孵化15min，腸細(xì)胞懸液經(jīng) 100-μπι孔徑血液尼龍網(wǎng)過(guò)濾，在1500Xg冷凍離心IOmin ；細(xì)胞沉淀重新懸浮在溶液_4 中，供試驗(yàn)使用；A6、細(xì)胞膜完整性用0. 5%臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法檢測(cè)；細(xì)胞懸液和染料等體積混合，滴加在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力；A7、細(xì)胞懸液在1500Xg冷凍離心lOmin，分別測(cè)定上清液和細(xì)胞沉淀乳酸脫氫酶 (LDH)的活性；A8、臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力在90%以上，將細(xì)胞濃度調(diào)整為12X106cell/ml，用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；輕輕混勻細(xì)胞懸液，取試驗(yàn)所需的細(xì)胞懸液數(shù)量，^TC振蕩培養(yǎng)，70轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)總時(shí)間為MOmin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液-2為=Hanks液+0.2mMEDTA ；所述溶液-3為DMEM培養(yǎng)液+42U膠原蛋白酶I ；所述溶液_4為DMEM培養(yǎng)液+0. 5%胎牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中分離液與組織的適宜比例為 1 10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟8)分離腸細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)條件處理包括以下內(nèi)容使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶密閉培養(yǎng)；所用培養(yǎng)液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，將收集的腸細(xì)胞懸液混合在一起，在1500×g冷凍離心10min；收集的細(xì)胞沉淀用溶液-3重新懸浮，在25℃振蕩孵化15min，腸細(xì)胞懸液經(jīng)100-μm孔徑血液尼龍網(wǎng)過(guò)濾，在1500×g冷凍離心10min；細(xì)胞沉淀重新懸浮在溶液-4中，供試驗(yàn)使用；細(xì)胞膜完整性用0.5％臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法檢測(cè)；細(xì)胞懸液和染料等體積混合，滴加在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力；細(xì)胞懸液在1500×g冷凍離心10min，分別測(cè)定上清液和細(xì)胞沉淀LDH的活性；輕輕混勻細(xì)胞懸液，取試驗(yàn)所需的細(xì)胞懸液數(shù)量，26℃振蕩培養(yǎng)，70轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)總時(shí)間為240min。本發(fā)明首次提出無(wú)胃溫水性魚(yú)腸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102367433SQ20111034883
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者馮琳, 劉揚(yáng), 周小秋, 姜俊, 姜維丹, 胡凱 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)